第二代高通量測序的三大巨頭比拼

1、第二代高通量測序的三大巨頭比拼(之一)第二代高通量測序準(zhǔn)確率，延長度都明顯優(yōu)于第一代高通量測序，更重要的是，價格比第一代大幅度降低，使得高通量測序的產(chǎn)業(yè)化成為現(xiàn)實(shí)。第二代高通量測序儀的三大代表是Illumina公司的Solexa基因組分析儀(IlluminaGenomeAnalyzer),羅氏公司(Roche)的454測序儀(RochGSFLXsequencer)和ABI的SOLiD測序儀(ABISOLiDse-quencer)。摘要：第二代高通量測序準(zhǔn)確率，延長度都明顯優(yōu)于第一代高通量測序，更重要的是，價格比第一代大幅度降低，使得高通量測序的產(chǎn)業(yè)化成為現(xiàn)實(shí)。一、Illumina公司的Sole

2、xa基因組分析儀Illumina公司的新一代測序儀GenomeAnalyzer最早由Solexa公司研發(fā)，利用其專利核心技術(shù)"DNA簇"和可逆性末端終結(jié)(reversibleterminator)”,實(shí)現(xiàn)自動化樣本制備及基因組數(shù)百萬個堿基大規(guī)模平行測序。GenomeAnalyzer作為新一代測序技術(shù)平臺，具有高準(zhǔn)確性，高通量，高靈敏度，和低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢，可以同時完成傳統(tǒng)基因組學(xué)研究(測序和注釋)以及功能基因組學(xué)(基因表達(dá)及調(diào)控，基因功能，蛋白/核酸相互作用)研究。1、GenomeAnalyzer技術(shù)的基本原理：Solexa方法是利用單分子陣列測試genotyping,

3、此種測序法首先將DNA從細(xì)胞中提取，然后將其打斷到約100200bp大小，再將接頭連接到片段上，經(jīng)PCR擴(kuò)增后制成Library。隨后在含有接頭的芯片(flowcell)上將已加入接頭的DNA片段綁定在flowcell上，經(jīng)反應(yīng)，將不同片段擴(kuò)增。在下一步反應(yīng)中，四種熒光標(biāo)記的染料應(yīng)用邊合成邊測序的原理，在每個循環(huán)過程里，熒光標(biāo)記的核昔和聚合酶被加入到單分子陣列中?；パa(bǔ)的核昔和核甘酸片斷的第一個堿基配對，通過酶加入到引物上。多余的核昔被移走。這樣每個單鏈DNA分子通過互補(bǔ)堿基的配對被延伸，利用生物發(fā)光蛋白，比如螢火蟲的熒光素酶，可通過堿基加到引物后端時所釋放出的焦磷酸鹽來提供檢測信號。針對每種堿

4、基的特定波長的激光激發(fā)結(jié)合上的核昔的標(biāo)記，這個標(biāo)記會釋放出熒光。熒光信號被CCD采集，CCD快速掃描整個陣列檢測特定的結(jié)合到每個片斷上的堿基。通過上述的結(jié)合，檢測可以重復(fù)幾十個循環(huán)，這樣就有可能決定核甘酸片斷中的幾十個堿基。Solexa的這種方法，可在一個反應(yīng)中同時加入4種核昔的標(biāo)簽，采用邊合成邊測序(SBS-sequencingbysynthesis),可減少因二級結(jié)構(gòu)造成的一段區(qū)域的缺失。并具有所需樣品量少，高通量，高精確性，擁有簡單易操作的自動化平臺和功能強(qiáng)大等特點(diǎn)，此反應(yīng)可以同時檢測上億個核甘酸片斷，因此在同一個芯片或幾個芯片上花費(fèi)很少(只需常規(guī)方法的1%)的成本就可測試全基因組。2、

5、Solexa高通量測序技術(shù)特點(diǎn)：1)可擴(kuò)展的超高通量：GenomeAnalyzer系統(tǒng)目前每次運(yùn)行后可獲得超過20GB的高品質(zhì)過濾數(shù)據(jù)。這個技術(shù)的可擴(kuò)展性保證了更高的數(shù)據(jù)密度和輸出，能用更少的經(jīng)費(fèi)完成更復(fù)雜的項(xiàng)目。到今年底，通量還有望上升到95GB,相當(dāng)于人類基因組的30倍覆蓋度。2）需要樣品量少：GenomeAnalyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至100ng,能應(yīng)用在很多樣品有限的實(shí)驗(yàn)（比如免疫沉淀、顯微切割等）中。這也是很多研究人員所考慮的因素。3）簡單、快速、自動化：GenomeAnalyzer系統(tǒng)提供了最簡單和簡潔的工作流程。即使是最小的實(shí)驗(yàn)室也能像大型基因組中心一樣進(jìn)行大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)。制備

6、樣品文庫可以在幾小時內(nèi)完成，一個星期內(nèi)就能得到高精確度的數(shù)據(jù)。ClusterStation可以說是GenomeAnalyzer的核心。由獨(dú)立軟件控制的自動生成DNA簇的過程可以在5小時之內(nèi)（30分鐘手工操作）完成。這個自動化的流程不需要進(jìn)行EmulsionPCR,減少了手工操作誤差和污染可能性，也不需要機(jī)器人操作或潔凈室?？焖俚膶?shí)驗(yàn)流程使GenomeAnalyzer的能力增至最大，而自動化步移降低了項(xiàng)目的時間和費(fèi)用。4）新穎的測序化學(xué)技術(shù)：GenomeAnalyzer通過合成測序來支持大規(guī)模并行測序。利用新穎的可逆熒光標(biāo)記終止子，可以在DNA鏈延伸的過程中檢測單個堿基摻入。由于四個可逆終止子d

7、NTP在每個測序循環(huán)都存在，自然的競爭減少了摻入的誤差。5）單個或配對末端支持：GenomeAnalyzer系統(tǒng)支持單個片段或配對末端文庫。文庫構(gòu)建過程簡單，減少了樣品分離和制備的時間。制備基因組DNA的單個片段或配對末端文庫需要6個小時，只有3個小時需要手工操作。2X50個堿基或更長的讀長增加了比對基因組的能力，并拓展了在其他方面的應(yīng)用。3、實(shí)驗(yàn)流程1）文庫制備將基因組DNA打成幾百個堿基（或更短）的小片段，在片段的兩個末端加上接頭（adapter）o2）產(chǎn)生DNA簇利用專利的芯片，其表面連接有一層單鏈引物，DNA片段變成單鏈后通過與芯片表面的引物堿基互補(bǔ)被一端固定”在芯片上。另外一端（5&

8、#39;或3'）隨機(jī)和附近的另外一個引物互補(bǔ)，也被固定”住，形成橋（bridge）。反復(fù)30輪擴(kuò)增，每個單分子得到了1000倍擴(kuò)增，成為單克隆DNA簇。DNA簇產(chǎn)生之后，擴(kuò)增子被線性化，測序引物隨后雜交在目標(biāo)區(qū)域一側(cè)的通用序列上。3）測序GenomeAnalyzer系統(tǒng)應(yīng)用了邊合成邊測序（SequencingBySynthesis）的原理。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP。這些核甘酸是何逆終止子"，因?yàn)?'羥基末端帶有可化學(xué)切割的部分，它只容許每個循環(huán)摻入單個堿基。此時，用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核甘酸種類。之后，

9、將這些基團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù)3'端粘性，繼續(xù)聚合第二個核甘酸。如此繼續(xù)下去，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣，統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結(jié)果，就可以得知每個模板DNA片段的序列。目前的配對末端讀長可達(dá)到2X50bp,更長的讀長也能實(shí)現(xiàn)，但錯誤率會增高。讀長會受到多個引起信號衰減的因素所影響，如熒光標(biāo)記的不完全切割。4）數(shù)據(jù)分析自動讀取堿基，數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)移到自動分析通道進(jìn)行二次分析4、GenomeAnalyzer系統(tǒng)得到國內(nèi)外大型研究機(jī)構(gòu)的認(rèn)可GenomeAnalyzer系統(tǒng)之所以如此暢銷，關(guān)鍵在于其技術(shù)上的優(yōu)勢。根據(jù)去年底的數(shù)據(jù)，GenomeAnalyzer已售出約200臺，估計是市場占

10、有率最廣的。前不久，華大基因再添置了12臺，準(zhǔn)備放在香港和深圳的實(shí)驗(yàn)室，至此華大基因已經(jīng)有29臺GenomeAnalyzer。而著名的麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)Broad研究院擁有47臺Illumina測序儀。眾多實(shí)驗(yàn)室之所以選擇Illumina,看中的無疑是GenomeAnalyzer的高性價比。上個月，Illumina將GenomeAnalyzerII升級到GenomeAnalyzerIIx,距年底實(shí)現(xiàn)單次運(yùn)行獲得95GB數(shù)據(jù)的宏偉目標(biāo)又近了一步。GenomeAnalyzerIIx有兩個核心特征：其一是更大的試劑冷卻器，支持超過100個測序循環(huán)，進(jìn)一步提升了系統(tǒng)的易用性和自動化；其二是全新的流

11、動池支架，讓每輪運(yùn)行所得的高質(zhì)量數(shù)據(jù)增加20%。依靠系統(tǒng)軟件和試劑的改進(jìn)，GenomeAnalyzerIIx現(xiàn)在能夠支持100bp以上的配對末端讀長，并在每次運(yùn)行中產(chǎn)生超過20GB的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。第二代高通量測序的三大巨頭比拼(之二)摘要：羅氏公司(Roche)的454測序儀結(jié)合了DNA擴(kuò)增的乳膠系統(tǒng)(emulsionsystem)和皮升級焦磷酸(pyrophosphate)為基礎(chǔ)的測序方法焦磷酸測序(pyrosequencing)方法。二、羅氏公司(Roche)的454測序儀(RochGSFLXsequencer)羅氏2005年，在國際頂級的學(xué)術(shù)期刊Nature»上，來自454生命科

12、學(xué)公司的Margulies等人發(fā)表文章介紹了一種快速簡單的測序方法：結(jié)合了DNA擴(kuò)增的乳膠系統(tǒng)(emulsionsystem)和皮升級焦磷酸(pyrophosphate)為基礎(chǔ)的測序方法焦磷酸測序(pyrosequencing)方法。這是一種依靠生物發(fā)光進(jìn)行DNA序列分析的新技術(shù)；在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號釋放偶聯(lián)起來。通過檢測熒光信號釋放的有無和強(qiáng)度，就可以達(dá)到實(shí)時測定DNA序列的目的。此技術(shù)不需要熒光標(biāo)記的引物或核酸探針，也不需要進(jìn)行電泳；具有分析結(jié)果快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和自動化的特點(diǎn)。1、GSFLX系統(tǒng)的工作

13、流程GSFLX系統(tǒng)的流程概括起來，就是“一個片段=一個磁珠=一條讀長(Onefragment=Onebead=Oneread)”。1 )樣品輸入并片段化：GSFLX系統(tǒng)支持各種不同來源的樣品，包括基因組DNA、PCR產(chǎn)物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。大的樣品例如基因組DNA或者BAC等被打斷成300800bp的片段；對于小分子的非編碼RNA或者PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，這一步則不需要。短的PCR產(chǎn)物則可以直接跳到步驟3)。2 )文庫制備：借助一系列標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，將A和B接頭(3'和5'端具有特異性)連接到DNA片段上。接頭也將用于后續(xù)的純化，擴(kuò)增和測序步驟。具有A、B接頭

14、的單鏈DNA片段組成了樣品文庫。3 ）一個DNA片段=一個磁珠：單鏈DNA文庫被固定在特別設(shè)計的DNA捕獲磁珠上。每一個磁珠攜帶了一個獨(dú)特的單鏈DNA片段。磁珠結(jié)合的文庫被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了只包含一個磁珠和一個獨(dú)特片段的微反應(yīng)器。4 ）乳液PCR擴(kuò)增：每個獨(dú)特的片段在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個片段文庫的擴(kuò)增平行進(jìn)行。對于每一個片段而言，擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬個相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增的片段仍然結(jié)合在磁珠上。5 ）一個磁珠=一條讀長：攜帶DNA的捕獲磁珠隨后放入PTP板中進(jìn)行后繼的測序。PTP孔的直徑（29

15、um）只能容納一個磁珠（20um）。然后將PTP板放置在GSFLX中，測序開始。放置在四個單獨(dú)的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入PTP板，每次只進(jìn)入一個堿基。如果發(fā)生堿基配對，就會釋放一個焦磷酸。這個焦磷酸在ATP硫酸化酶和螢光素酶的作用下，經(jīng)過一個合成反應(yīng)和一個化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最終將螢光素氧化成氧化螢光素，同時釋放出光信號。此反應(yīng)釋放出的光信號實(shí)時被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個堿基和測序模板進(jìn)行配對，就會捕獲到一分子的光信號；由此一一對應(yīng)，就可以準(zhǔn)確、快速地確定待測模板的堿基序列。這也就是大名鼎鼎的焦磷酸測序。6 ）數(shù)據(jù)分析：GSFLX系統(tǒng)在10小時的運(yùn)行當(dāng)中

16、可獲得100多萬個讀長，讀取超過4-6億個堿基信息。GSFLX系統(tǒng)提供兩種不同的生物信息學(xué)工具對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，適用于不同的應(yīng)用：達(dá)400MB的從頭拼接和任何大小基因組的重測序。GSFLX系統(tǒng)的準(zhǔn)確率在99%以上。其主要限制來自同聚物，也就是相同堿基的連續(xù)摻入，如AAA或GGG。由于沒有終止元件來阻止單個循環(huán)的連續(xù)摻入，同聚物的長度就需要從信號強(qiáng)度中推斷出來。這個過程就可能產(chǎn)生誤差。因此，454測序平臺的主要錯誤類型是插入-缺失，而不是替換。2、454GS測序系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)數(shù)據(jù)高效獲取10小時內(nèi)可得到超過1000000條的序列，平均讀長高達(dá)450bp!極大的拓展研究思路，大量的高讀長的序列，為研

17、究者提供更廣闊的思路！獲取等量數(shù)據(jù)，比傳統(tǒng)方法的花費(fèi)大大降低，454Titanium系統(tǒng)，可以幫助您：1 ）獲取各個物種的基因組序列草圖2 ）大規(guī)模PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序3 ）尋找基因組中，Sanger測序法不能發(fā)現(xiàn)的稀有突變4 ）開放閱讀框（ORF）的鑒定，不同生物間的同源性分析，基因組結(jié)構(gòu)概況分析5 ）鑒定不同菌株的保守區(qū)域，突變熱點(diǎn)和基因插入或者缺失，了解藥物抗性的遺傳基礎(chǔ)6）識別微生物產(chǎn)生的藥物前體有關(guān)的基因或者途徑，比較致病性和非致病性微生物的區(qū)別作為發(fā)展抗微生物藥物的遺傳學(xué)基礎(chǔ)7）進(jìn)行病毒基因組、microRNA、SAGE文庫、cDNA文庫和BAC文庫的測序第二代高通量測序的三大巨頭比

18、拼（之三）摘要：第二代高通量測序的三大巨頭比拼（之三）ABI的SOLiD測序儀三、ABI的SOLiD測序儀（ABISOLiDse-quencer）SOLiD全稱為supportedoligoligationdeletion,SOLiD系統(tǒng)是一個端到端的新一代基因組研究方案，包含測序組件、化學(xué)組件、計算集群和數(shù)據(jù)存儲組件。這個平臺基于通過寡核甘酸連接和檢測進(jìn)行測序。它的獨(dú)特之處在于以四色熒光標(biāo)記寡核甘酸的連續(xù)連接合成為基礎(chǔ)，取代了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)，可對單拷貝DNA片段進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增和高通量并行測序。與聚合酶測序方法不同的是，SOLiD系統(tǒng)利用專利的逐步連接（stepwiseligation）

19、技術(shù)來產(chǎn)生高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，可應(yīng)用于全基因組測序、染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）、微生物測序、數(shù)字核型分析、臨床測序、基因型分析、基因表達(dá)分析和小分子RNA的發(fā)現(xiàn)等等。就通量而言，SOLiD3系統(tǒng)是革命性的，目前SOLiD3單次運(yùn)行可產(chǎn)生50GB的序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于17倍人類基因組覆蓋度。而其無以倫比的準(zhǔn)確性、系統(tǒng)可靠性和可擴(kuò)展性更讓它從其他新一代測序平臺中脫穎而出。為什么SOLiD能輕松實(shí)現(xiàn)貌似不可能的任務(wù)？讓生物通帶你從測序原理入手，一探究竟。1、SOLiD工作流程1）文庫制備SOLiD系統(tǒng)能支持兩種測序模板：片段文庫（fragmentlibrary）或配對末端文庫（mate-pairedlibr

20、ary）。使用哪一種文庫取決于你的應(yīng)用及需要的信息。片段文庫就是將基因組DNA打斷，兩頭加上接頭，制成文庫。如果你想要做轉(zhuǎn)錄組測序、RNA定量、miRNA探索、重測序、3',5'-RACE、甲基化分析、ChIP測序等，就可以用它。如果你的應(yīng)用是全基因組測序、SNP分析、結(jié)構(gòu)重排/拷貝數(shù)，則需要用配對末端文庫。配對末端文EcoP15酶切，使中間接庫是將基因組DNA打斷后，與中間接頭連接，再環(huán)化，然后用頭兩端各有27bp的堿基，再加上兩端的接頭，形成文庫。2）乳液PCR/微珠富集在微反應(yīng)器中加入測序模板、PCR反應(yīng)元件、微珠和引物，進(jìn)行乳液PCR（EmulsionPCR）。PCR完

21、成之后，變性模板，富集帶有延伸模板的微珠，去除多余的微珠。微珠上的模板經(jīng)過3'修飾，可以與玻片共價結(jié)合?？吹竭@里，是不是有一種似曾相識的感覺呢？那就對了，此步驟與454的GSFLX基本相同。不過SOLiD系統(tǒng)的微珠要小得多，只有1um。乳液PCR最大的特點(diǎn)是可以形成數(shù)目龐大的獨(dú)立反應(yīng)空間以進(jìn)行DNA擴(kuò)增。其關(guān)鍵技術(shù)是“注水到油”，基本過程是在PCR反應(yīng)前，將包含PCR所有反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，水溶液瞬間形成無數(shù)個被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構(gòu)成了獨(dú)立的PCR反應(yīng)空間。理想狀態(tài)下，每個小水滴只含一個DNA模板和一個P1磁珠，由于水相中的P2引物和磁珠表面的P1

22、引物所介導(dǎo)的PCR反應(yīng)，這個DNA模板的拷貝數(shù)量呈指數(shù)級增加，PCR反應(yīng)結(jié)束后，P1磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目巨大的同來源DNA模板擴(kuò)增產(chǎn)物。3）微珠沉積3'修飾的微珠沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過程中，沉積小室將每張玻片分成1個、4個或8個測序區(qū)域。SOLiD系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是每張玻片能容納更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實(shí)現(xiàn)更高的通量。4）連接測序這一步可就是SOLiD的獨(dú)門秘笈了。它的獨(dú)特之處在于沒有采用慣常的聚合酶，而用了連接酶。SOLiD連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物。連接反應(yīng)中，這些探針按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對。探針的5'末端分別標(biāo)記了CY5

23、、TexasRed、CY3、6-FAM這4種顏色的熒光染料。探針3'端15位為隨機(jī)堿基，可以是ATCG四種堿基中的任何一種堿基，其中第1、2位構(gòu)成的堿基對是表征探針染料類型的編碼區(qū)，下圖的雙堿基編碼矩陣規(guī)定了該編碼區(qū)16種堿基對和4種探針顏色的對應(yīng)關(guān)系，而35位的“n”表示隨機(jī)堿基，68位的“z”指的是可以和任何堿基配對的特殊堿基。單向SOLiD測序包括五輪測序反應(yīng)，每輪測序反應(yīng)含有多次連接反應(yīng)。第一輪測序的第一次連接反應(yīng)由連接引物“n”介導(dǎo)，由于每個磁珠只含有均質(zhì)單鏈DNA模板，所以這次連接反應(yīng)摻入一種8堿基熒光探針，SOLiD測序儀記錄下探針第1、2位編碼區(qū)顏色信息，隨后的化學(xué)處理

24、斷裂探針3'端第5、6位堿基間的化學(xué)鍵，并除去68位堿基及5'末端熒光基團(tuán)，暴露探針第5位堿基5'磷酸，為下一次連接反應(yīng)作準(zhǔn)備。因?yàn)榈谝淮芜B接反應(yīng)使合成鏈多了5個堿基，所以第二次連接反應(yīng)得到模板上第6、7位堿基序列的顏色信息，而第三次連接反應(yīng)得到的是第11、12位堿基序列的顏色信息幾個循環(huán)之后，引物重置，開始第二輪的測序。由于第二輪連接引物n-1比第一輪錯開一位，所以第二輪得到以0,1位起始的若干堿基對的顏色信息。五輪測序反應(yīng)反應(yīng)后，按照第0、1位，第1、2位.的順序把對應(yīng)于模板序列的顏色信息連起來，就得到由“0,1,2,3”組成的SOLiD原始顏色序列。5）數(shù)據(jù)分析S

25、OLiD測序完成后，獲得了由顏色編碼組成的SOLiD原始序列。理論上來說，按照“雙堿基編碼矩陣”，只要知道所測DNA序列中任何一個位置的堿基類型，就可以將SOLiD原始顏色序列“解碼”成堿基序列。但由于雙堿基編碼規(guī)則中雙堿基與顏色信息的簡并特性（一種顏色對應(yīng)4種堿基對），前面堿基的顏色編碼直接影響緊跟其后堿基的解碼，所以一個錯誤顏色編碼就會引起“連鎖解碼錯誤"，改變錯誤顏色編碼之后的所有堿基。和其它所有測序儀一樣，測序錯誤在所難免，關(guān)鍵是對測序錯誤的評價和后續(xù)處理。由于SOLiD系統(tǒng)采用了雙堿基編碼技術(shù)，在測序過程中對每個堿基判讀兩遍，從而減少原始數(shù)據(jù)錯誤，提供內(nèi)在的校對功能。這樣，雙保險確保了SOLiD系統(tǒng)原始堿基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%，而在15X覆蓋率時的準(zhǔn)確度可以達(dá)到99.999%,是目前新一代基因分析技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的。為避免“連鎖解碼錯誤”的發(fā)生，SOLiD數(shù)據(jù)分析軟件不直接將SOLiD原始顏色序列解碼成堿基序