熊果酸的研究進(jìn)展

1、熊果酸的研究進(jìn)展                 作者：肖坤福 鄭云法 劉成左 張春牛【關(guān)鍵詞】  熊果酸；,檢測(cè)方法；,提取方法；,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；,臨床研究熊果酸是廣泛存在于白花蛇舌草、女貞子、烏梅、夏枯草等天然植物中的一種五環(huán)三萜類化合物，有研究表明熊果酸具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌、抗糖尿病、降血糖等多種生物學(xué)效應(yīng)，早在1996年，日本學(xué)者神藏美枝子等人從杜鵑花科越桔屬植物越桔葉中提取了具有較高熊果酸濃度的熊果酸產(chǎn)品，產(chǎn)品中除含有2

2、5%的熊果酸外，尚含有大量的熊果酸衍生物、熊果苷和其它三萜類化合物等，具有多種活性成分，用于增強(qiáng)機(jī)體免疫力、預(yù)防心血管系統(tǒng)疾病、穩(wěn)定肝功能等。現(xiàn)在人們對(duì)其研究越來越多，并在很多方面取得了可喜的研究進(jìn)展。1   提取方法對(duì)三萜類化合物的分離提純是其研究起點(diǎn)，沒有較好的提取工藝，就更談不上對(duì)其進(jìn)一步研究。近年來，許多科研工作者在這方面做出了突出的貢獻(xiàn)。有些科研工作者15，通過正交實(shí)驗(yàn)確定85%95%的乙醇提取熊果酸效果最佳。崔星明等6采用超臨界流體萃取得到的蘆筍提取物，用甲醇溶解，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)，得到了56個(gè)組分。發(fā)現(xiàn)有保留時(shí)間和熊果酸基本一致的峰。其質(zhì)譜分子離子

3、峰和特征碎片峰都與熊果酸的一致，確定該化合物為熊果酸。2   檢測(cè)方法在檢測(cè)方法方面，有不少科研工作者對(duì)其進(jìn)行了較深入的研究。熊慧敏7全面地論證了薄層層析-雙波長(zhǎng)掃描法測(cè)定大山楂咀嚼片中熊果酸含量的檢測(cè)限的線性范圍可行性，并考查了此方法的測(cè)定熊果酸的穩(wěn)定性和重復(fù)性，從而證明薄層層析-雙波長(zhǎng)掃描法測(cè)定熊果酸精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率均都達(dá)有關(guān)規(guī)定的要求，本方法操作簡(jiǎn)單方便，結(jié)果可靠，可作為檢驗(yàn)產(chǎn)品質(zhì)量的一個(gè)快速而實(shí)用的定量方法。朱玉琴等8在采用薄層掃描檢測(cè)保駕膠囊中熊果酸的含量時(shí)首次對(duì)顯色劑進(jìn)行了改進(jìn)，并驗(yàn)證了醋酸-濃硫酸 (91)比10%硫酸乙醇顯色要好，檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)

4、。與此同時(shí)，楊云等9在采用薄層層析檢測(cè)牙周康泰膠囊熊果酸的含量驗(yàn)證了10%磷鉬酸乙醇液比10%硫酸乙醇顯色要好。羅啟劍等10采用分光光度法測(cè)定連錢草中熊果酸含量。郭艷玲等11和陳志強(qiáng)12采用薄層掃描法分別測(cè)定了補(bǔ)腎顆粒和消食貼中熊果酸含量，方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可作為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法。周靜等13探求用毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定女貞子中齊墩果酸和熊果酸含量。取女貞子氯仿提取液自然揮發(fā)干，甲醇溶解經(jīng)甲酯化后，進(jìn)樣分析。色譜條件：HP1毛細(xì)管柱（25 cm×0.32 mm，0.52 m），柱溫280，氮?dú)鉃檩d氣，氫火焰檢測(cè)器。分析結(jié)果表明熊果酸的線性良好，回收率為99.8%±2.1

5、%。所建立的氣相色譜法可以作為女貞子藥材的質(zhì)量檢測(cè)方法。施慧君等14采用HPLC法測(cè)定知柏地黃沖劑中熊果酸的含量。選用ODS-C：色譜柱，流動(dòng)相：甲醇-水(991)，磷酸調(diào)pH 2.5，檢測(cè)波長(zhǎng)：206 nm，流速：1.2 ml/min，柱溫25的條件下，熊果酸線性關(guān)系良好(r=0.999 8) 平均回收率達(dá)98.7%(RSD=0.66%)。羅曉清等15采用RP-HPLC法測(cè)定石精葉中熊果酸含量，色譜柱為Zorbax ODS柱，用甲醇（1%），醋酸水溶液(8812)為流動(dòng)相。檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。結(jié)果熊果酸和齊墩果酸的平均收率分別為98.5%、97.6%(n=3)。RSD分別為1.62%，1.

6、89%(n=3)。方法準(zhǔn)確、靈教、快速，可作為石抽葉藥材的質(zhì)量檢測(cè)方法之一。楊書良等16采用高效液相色譜法從影響熊果酸測(cè)定的各個(gè)方面(例如：粒度、煎煮次數(shù)、溶媒量、提取時(shí)間等)進(jìn)行測(cè)定和和正交分析，從而論證了它比薄層層析法更精確、更可靠、靈敏度更高，重現(xiàn)性更好。鞠建華等17，也采用高效液相色譜測(cè)定熊果酸含量，但他在前人的基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)流動(dòng)相的比例和加入改性劑乙酸胺，驗(yàn)證了此改進(jìn)方法可以使熊果酸和它的同分異構(gòu)體齊墩果酸達(dá)到基線分離，并使基線平穩(wěn)、峰型和分離效果較佳。鄢立新等18在采用高效液相色譜測(cè)定熊果酸時(shí)通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在流動(dòng)相中加入少量的醋酸可提高熊果酸的分離度，因?yàn)樯倭看姿岬募尤胧沽鲃?dòng)相蒸發(fā)所需

7、的漂移管溫度和氣體流速應(yīng)比初始條件高，可以在     試驗(yàn)中逐漸增加漂移管溫度和氣體流速。劉海興等19首先采用毛細(xì)管電泳法測(cè)定熊果酸含量的方法, 此方法能有效地分離和測(cè)定熊果酸，測(cè)定精密度比其它方法高，最易適合低含量測(cè)定，此方法準(zhǔn)確、樣品及試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)。但此方法可操作性難度大，不適合簡(jiǎn)捷檢測(cè)。閆花麗等20曾經(jīng)采用重氮甲烷衍生化氣相色譜法測(cè)定熊果酸的含量，此方法精密度高，檢測(cè)限低，并克服了齊墩果酸和熊果酸(二者是性質(zhì)和結(jié)構(gòu)相似)難分離、難分別測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)。但此方法工藝繁鎖，可操作性難度大，故現(xiàn)在很少有人使用此方法。也有人如皮文霞等21采用分光光度法測(cè)定熊

8、果酸的含量。此方法很少有人采用，因?yàn)榇朔椒ň_度不夠，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差，不便采用。3   藥理效應(yīng)在藥理研究方面也取得了可喜的成就。黃鏡等22采用MTT法、DNA凝膠電泳、形態(tài)學(xué)等方法觀察到熊果酸抑制HL-60細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用。王杰軍等23探討了熊果酸對(duì)體外血管形成的抑制作用(由于新生血管形成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的重要步驟),采用MTT法、細(xì)胞遷移及小管實(shí)驗(yàn)觀察到熊果酸對(duì)培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)增殖、遷移和小管形成均有較強(qiáng)的抑制作用(P0.01)，并且結(jié)果表明抑制程度與熊果酸的作用濃度呈正相關(guān)。白育軍等24對(duì)熊果酸的1、2位和3位進(jìn)行氧化，制備其衍生物來觀察

9、其抗腫瘤活性，結(jié)果顯示熊果酸抗腫瘤活性最強(qiáng)。樊明文等25采用MTT法研究熊果酸對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞株(TSCCa)增值的影響；用原位雜交的方法檢測(cè)熊果酸對(duì)TSCCa細(xì)胞漿中核轉(zhuǎn)錄因子mRNA原位表達(dá)的影響研究了女貞葉有效成分熊果酸對(duì)TSCCa細(xì)胞增殖的影響，探討其中可能的機(jī)制。研究結(jié)果顯示，熊果酸抑制TSCCa 細(xì)胞增殖，對(duì)TSCCa細(xì)胞的半數(shù)生長(zhǎng)的抑制劑量約為12.5 molL1，在24h內(nèi)表現(xiàn)為一定的量效關(guān)系；原位雜交顯示熊果酸對(duì)TSCCa細(xì)胞的抑制作用與抑制核轉(zhuǎn)錄因子的原位表達(dá)有關(guān)。4   動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是臨床研究的最重要前期階段，在這一方面很多科研工作者做出了不少貢獻(xiàn)。

10、向敏等26觀察到細(xì)胞經(jīng)熊果酸誘導(dǎo)后，B16細(xì)胞黑色素顆粒生成能力明顯增多，并通過集落形成實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)證明了B16細(xì)胞分化后，致瘤力下降，由細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)研究表明，熊果酸可使B16細(xì)胞周期阻斷在G1期，而S期細(xì)胞明顯減少。由免疫組化分析顯示，熊果酸作用后B16細(xì)胞內(nèi)C-myc蛋白含量明顯下降。黃鏡等22系統(tǒng)地考察了熊果酸對(duì)抗致癌物如苯并芘、黃曲霉素B1誘發(fā)基因突變, 可抑制TPA的促癌作用，通過抗氧化作用起到抗始發(fā)突變與抗促癌作用，還對(duì)P-388和L-1210白血病細(xì)胞、A-549人肺腺癌細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒作用，其ED50均小于4 mgL 。熊筱娟、陳蔚云27采用動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熊果酸能使急性

11、肝損傷大鼠血清SGPT和肝甘油三脂含量明顯下降，血清甘油三脂和肝糖原含量明顯增加，并能減輕肝細(xì)胞變性、壞死，對(duì)急性肝損傷有顯著保護(hù)和治療作用。Hsue-Yin Hsu28通過輻射損傷后的小鼠分別用齊墩果酸和熊果酸治療觀察表明熊果酸比齊墩果酸更能抗癌，并且熊果酸能加強(qiáng)損傷的小鼠體內(nèi)的造血功能。 5    臨床研究5.1   對(duì)肝炎的作用熊果酸臨床表現(xiàn)有顯著而迅速降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶、消退黃疽、增進(jìn)食欲和恢復(fù)肝功能的作用，具有見效快、療程短、效果穩(wěn)定的特點(diǎn)29。Lee I等30實(shí)驗(yàn)研究證明熊果酸具有明顯的趨脂停用和抗纖維化，并能保護(hù)肝細(xì)胞膜及細(xì)胞器的生物

12、膜系統(tǒng)，使主動(dòng)運(yùn)輸功能恢復(fù)正常，細(xì)胞內(nèi)外離子和水的移動(dòng)及分布亦隨之復(fù)原，再生能力相繼恢復(fù)，促進(jìn)肝小葉中央?yún)^(qū)壞死肝細(xì)胞修復(fù)。5.2   抑制腫瘤形成生長(zhǎng)以及誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化作用熊果酸對(duì)腫瘤形成生長(zhǎng)各階段具有預(yù)防和抑制作用。Li J等31通過實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)證明熊果酸能抗DNA突變、抑制癌變的啟動(dòng), 并且熊果酸能對(duì)抗致癌物如苯并芘，黃曲霉毒素Bl誘發(fā)基因突變。王鵬32試驗(yàn)對(duì)早期抗體(EBV-EA)活化試驗(yàn)型來篩選皮膚癌促癌物的抑制劑，發(fā)現(xiàn)熊果酸對(duì)TPA誘導(dǎo)Raji細(xì)胞EBV-EA活化具有幾乎同維甲酸相同的抑制作用，并使Raji細(xì)胞的存活率更高；利用同位素標(biāo)記的佛酯化合物3H-PDB

13、2證明熊果酸不影響TPA與受體的結(jié)合，不是通過競(jìng)爭(zhēng)TPA位點(diǎn)，而是有效地阻斷致癌物與受體     結(jié)合后的環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。論文出處(作者):5.3   對(duì)艾滋病病毒的抑制作用人體免疫缺陷病毒 (HIV)是獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的致病因子。田 英等33通過臨床試驗(yàn)證明熊果酸對(duì)HIV-1蛋白酶活性有強(qiáng)的抑制作用，其50%抑制濃度(IC50)為8 mol/L。HIV-1蛋白酶是一個(gè)同型二聚體酶，熊果酸可能是通過抑制HIV-1蛋白酶的二聚作用來抑制HIV-1蛋白酶的活性，從而抑制HIV蛋白酶發(fā)揮作用。5.4   利

14、膽退黃作用李開泉等34證明熊果酸不但使正常人體膽汁流量增加，而且使膽汁流量增加，膽汁中SB濃度增高，血清中SB含量下降，有明顯的利膽、促進(jìn)膽紅素排泄作用。臨床上，濕熱黃疽證肝、膽疾患癥狀與APIT肝損傷大鼠的病理特征相似。熊果酸利膽、退黃的作用與中藥陸英糖漿、沖劑治療急性病毒性肝炎其迅速退黃，增進(jìn)食欲，恢復(fù)肝功能的療效一致。5.5   抗炎抑菌作用熊果酸能導(dǎo)致細(xì)胞生存能力下降。王鵬32證明熊果酸誘導(dǎo)基因組DNA分裂表明其誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)理是通過細(xì)胞凋亡, 熊果酸能抑制人急性早幼粒白血病細(xì)胞(HL-60)的增殖，對(duì)HL-60細(xì)胞的半數(shù)生長(zhǎng)的抑制劑量(IC50)為8.26 m，

15、并能誘導(dǎo)共發(fā)生凋亡。5.6   抗氧化作用熊果酸是一個(gè)較強(qiáng)的抗氧化劑。You等35能明顯地捕獲O-      2，在肝微粒體和P450單胺氧化酶系中對(duì)脂質(zhì)過氧化均顯示較強(qiáng)的抑制作用。另外，有試驗(yàn)證明熊果酸對(duì)環(huán)氧合酶的活性有較強(qiáng)的抑制作用，其IC50值為130 m。6   其它熊果酸具有抑制癌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，以及抗炎抑菌和抗艾滋病病毒等作用當(dāng)然也不可避免對(duì)人體其它細(xì)胞有一定的毒害作用，孫備36驗(yàn)證它對(duì)精子有一定毒性作用，它能破壞膽間橋的肌動(dòng)蛋白，打開橋鍵，產(chǎn)生共質(zhì)體，抑制精子的形成, 利用這一作用有望開發(fā)成

16、男性避孕藥。熊果酸毒性很低、毒性周期短，在醫(yī)藥和化妝品中越來越被人們關(guān)注。參考文獻(xiàn)：1   韓   晶，孫來九.從毛泡桐葉中提取，分離熊果酸的新工藝研究J.西北大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，33(3):304304.2    李開泉，鄒盛勤，陳武，等.陸英中烏索酸提取工藝的正交優(yōu)選J.中草藥, 2003，34(9)：791791.3    原春蘭，李宗孝，楊佩云.地榆中熊果酸的提取J.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2002，33(10)：478478.4    陳鴻英，馬雪梅.澤蘭中齊墩

17、果酸和熊果酸的提取，分離J.天津中醫(yī)藥，2003，20(5)：7474.5   馬   穩(wěn)，李   丹.夏桑菊中熊果酸的提取方法及可靠性研究J.信陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，16(3)：318318.6   崔星明，王勇為，陳光宇.超臨界流體萃取蘆筍中熊果酸的研究J.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004，21（1）：123123.7   熊慧敏.雙波長(zhǎng)薄層掃描法測(cè)定大山植咀嚼片中熊果酸的含量J.海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2003, 9(3): 4646.8   朱玉琴，陳愛英，劉 

18、0; 放.薄層掃描法測(cè)定保駕膠囊中熊果酸含量J.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志, 2003, 20(2): 147147.9   楊   云，李國(guó)茹，聞?dòng)琅e.牙周康泰膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究J.中藥新藥與臨床藥理，2003，14(6)：400400.10   羅啟劍，祝德秋，崔   嵐，等.分光光度法測(cè)定連錢草中熊果酸含量J.藥學(xué)服務(wù)與研究，2003，3（4）：268268.11   郭艷玲，曲靜，李紅紀(jì).薄層掃描法測(cè)定補(bǔ)腎顆粒中熊果酸含量J.遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，5（2）：1  

19、60;  59159.12    陳志強(qiáng).雙波長(zhǎng)薄層掃描法測(cè)定消食貼中熊果酸的含量J.中藥材，2003，26（7）：523523.13   周   靜，劉垣升.氣相色譜法測(cè)定女貞子中齊墩果酸和熊果酸的含量J.中國(guó)新藥與臨床雜志，2003，22（10）：596596.14   施慧君，黃有興.HPLC法測(cè)定知柏地黃沖劑中熊果酸含量J.中藥材，2004，27（2）：136136.15   羅曉清，祝偉瑋，錢蘇生.RP-HPLC法測(cè)定石楠葉中熊果酸和齊墩果酸的含量J.現(xiàn)代中藥研究與

20、實(shí)踐，2003，17（5）：1414.16   楊書良，凌寧生，種宏國(guó).二至九的工藝研究J.中成藥, 2003,25(1):1919.17   鞠建華，周   亮，鄭瑞霞，等.高效液相色譜法測(cè)定中藥批把葉中熊果酸的含量J.中國(guó)藥學(xué)雜志，2003, 38(9)：657657.18   鄢立新，唐衛(wèi)文，及元喬.高效液相色譜法蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定山茱萸藥材中熊果酸的含量J.藥物分析雜志，2003，23(5):358358.19   劉海興，楊更亮，王德先，等.毛細(xì)管電泳法測(cè)定石桶葉中有效成分的含量J.

21、中草藥, 2001， 32(11): 999999.20   閆花麗，趙陸華，朱舟妮，等.衍生化氣相色譜法測(cè)定夏枯草中齊墩果酸和熊果酸的含量J.中國(guó)中藥雜志，1999，24(12)：744745.21   皮文霞，蔡寶昌，郭勝偉，等.分光光度法測(cè)定山茱萸制劑中總?cè)扑岬暮縅.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，19(2):9999.22   黃   鏡，孫   燕.蘆筍有效成分熊果酸誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究J.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志, 1999, 19(5): 296296.23 &#

22、160; 王杰軍，王   兵，郭   靜，等.熊果酸體外抑制血管形成的研究J.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，21(11): 10711071.24   白育軍，楊小生，康文藝，等.熊果酸的結(jié)構(gòu)修飾物及其抗腫瘤活性J.華西藥學(xué)雜志，2003，18（2）：8787.25   樊明文，王   茜，邊   專，等.熊果酸對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞株TSCCa的抑制作用及其機(jī)制探討J.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2004，25（1）：11.26   向   敏，顧

23、振綸，梁中琴，等. 熊果酸對(duì)小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用J.中國(guó)藥理學(xué)會(huì)通訊, 2000,17(3):3333.27   熊筱娟，陳蔚云，崔江龍，等. 烏索酸對(duì)大鼠膽汁的影響J.中醫(yī)藥學(xué)報(bào), 2003,31(4):5454.28   Hsue-Yin Hsu, Jenq-Jer Yang, Chun-Ching Lin. Effects of oleanolic acid and ursolic acid on inhibiting tumor growth and enhancing the recovery of hematopoietic system postirradiation in mice. Cancer letters, 1997, 2(1)：713.29   陳   武，熊筱娟，李開泉，等. 烏索酸治療急性病毒性肝炎的臨床研究J.宜春醫(yī)專學(xué)報(bào)，2001，13(1):11.30   Lee I, Lee J, Lee YH, et a1Ursolic acid indeed changes in tumir growth, Q2 consumption,