目的基因克隆

1、一、目的基因克隆的策略有哪些？其理論依據(jù)什么？如何根據(jù)具體條件，如目的性狀的特點(diǎn)，已知控制目的性狀的基因的信息合理選擇基因克隆的方法？ 1、主要有以下幾個(gè)克隆的策略：(1) PCR法分離目的基因：從蛋白質(zhì)的一級(jí)序列分析得到核酸序列的相關(guān)信息， 設(shè)計(jì)簡并引物，通過對(duì) mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以cDNA為模板，然后 將目的基因通過PCR方法擴(kuò)增，或者直接從基因組 DNA擴(kuò)增的方法。(2)核酸雜交的方法：通過對(duì)蛋白質(zhì)的氨基酸序列分析，設(shè)計(jì)簡并引物，通過 核酸雜交的方法從基因文庫中篩選得到目的基因。(3)免疫學(xué)篩選法分離目的基因：利用免疫學(xué)原理，通過目的蛋白的特異抗體 與目的蛋白的專一結(jié)合，從

2、表達(dá)文庫中分離目的蛋白基因。2、若控制該性狀的目的蛋白質(zhì)不容易分離純化，這 PCR方法比較適宜，若蛋白 質(zhì)分離純化容易，且有現(xiàn)成的基因文庫，則后兩種方法較為簡單。二、蛋白組學(xué)方法克隆目的基因的理論依據(jù)是什么？有哪些技術(shù)環(huán)節(jié)？要用到哪 些技術(shù)？1、理論依據(jù)：以分離純化的目的蛋白為研究起點(diǎn)，通過對(duì)目的蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu) 分析，獲得起碼的氨基酸序列信息后，反推可能的 DNA序列，然后設(shè)計(jì)引物， 從cDNA中將目的基因擴(kuò)增出來，或者設(shè)計(jì)核酸探針，通過雜交技術(shù)將目的基 因從基因文庫中篩選出來?；蛲ㄟ^抗體抗原免疫反應(yīng)從表達(dá)文庫中將該基因分離 出來。2、技術(shù)環(huán)節(jié)是確定并制備出高純度的蛋白質(zhì)。3、所需要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)

3、有：蛋白質(zhì)的雙向電泳技術(shù)，由第一向的等電聚焦電泳和 第二向的SDS-PAGE電泳組成；蛋白質(zhì)氨基酸序列分析。三、基因組學(xué)方法克隆基因的策略有哪些？各有什么特點(diǎn)？如何選擇恰當(dāng)?shù)幕?組學(xué)方法克隆目的基因？1、基因文庫篩選方法通過對(duì)基因文庫的篩選將目的基因分離出來， 一般有兩種方法：核酸雜交法，原 理是分子雜交；PCR篩選法，通過PC R方法將目的基因分離出來，對(duì)于以混 合形式保存的文庫，先將文庫分成幾份，每份為一個(gè) 反應(yīng)池”進(jìn)行PCR反應(yīng)， 待選出陽性池后，將陽性池的混合克隆稀釋，然后等量分置96孔板中，進(jìn)行橫向池及縱向池的P C R反應(yīng)，然后將陽性菌落群進(jìn)行稀釋，重復(fù)上述工作，直到 篩出陽性單

4、克隆。2、圖位克隆目的基因利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行精細(xì)定位， 利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行 精細(xì)定位，用獲得的與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選基因文庫的方法。主要有染色體步移法、染色體登陸、跳查和連接法；外顯子捕捉和 cDNA直選法等。 3、插入突變分離克隆目的基因由重組DNA技術(shù)衍生出的插入突變，可人為地造成某一待研究基因的突變， 并 可根據(jù)由此帶來的表型特征的改變分析該基因的功能。 基因插入突變的方法主要 有：插入失活突變；T- DNA標(biāo)簽；轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽。4、相鄰片段的體外克隆(1) Panhandle PC砒在限制酶消化的DNA 3/端加一個(gè)與未知序列上游已知序列互補(bǔ)的單鏈引物，

5、從而使經(jīng)變性后產(chǎn)生的單鏈 DNA分子內(nèi)聚合，導(dǎo)致已知 DNA定位于未知相鄰 DNA側(cè)翼區(qū)段。引物設(shè)計(jì)是該技術(shù)運(yùn)用的關(guān)鍵所在，所需引物包含一個(gè)與已知 序列上游互補(bǔ)的單鏈引物和兩對(duì)位于該單鏈引物兩側(cè)與已知序列一致的引物。(2) Cassette PCRfe利用Cassette及Cassetted物特異性快速擴(kuò)增cDNA及基因組DNA未知區(qū)域的 一種有效方法。由于Cassette的5/端沒有磷酸基，在目標(biāo)DNA的3/端和Cassette 的5/端的連接部位形成缺口，在第一次 PCR反應(yīng)的第一循環(huán)時(shí)，從引物C1開 始的延伸反應(yīng)在連接部位終止，從而控制了非特異性的擴(kuò)增。只有從引物S1開始延伸合成的DNA

6、鏈，才能成為引物C1的模板，進(jìn)行DNA的擴(kuò)增反應(yīng)。再用 內(nèi)側(cè)引物(引物C2,引物S2)進(jìn)一步進(jìn)彳T第二次PCR反應(yīng)時(shí)，能高效特異性地?cái)U(kuò)增 目的DNA?？寺∧康幕虻姆椒ǎ喝裟康幕虻男蛄形粗?，則采用相鄰片段的體外克隆的方法； 若目的基因的序列 已知，有現(xiàn)成的基因文庫，則采用基因文庫篩選方法較好；若有合適的分子標(biāo)記， 則用圖位克隆的方法較好；若需研究目的分子的功能，則采用插入突變分離克隆 目的基因的方法較好。四、功能基因組學(xué)策略克隆目的基因的方法有哪些？各有什么特點(diǎn)？如何解決其 中的假陽性克隆問題？1、RT-PCR擴(kuò)增這種方法專一性強(qiáng)，但是操作過程比較麻煩，特別是mRNA很不穩(wěn)定、生存時(shí)問短，所

7、以要求的技術(shù)條件較高。2、mRNA差異顯示技術(shù)該方法以RT-PCR和DNA凝膠電泳為基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)簡便，靈敏度高，耗時(shí)短，可 同時(shí)比較多個(gè)樣品間基因表達(dá)的差異， 可同時(shí)檢測到上調(diào)和下調(diào)的基因，但這種 方法對(duì)低豐度的mRNA檢出率低，得到的絕大多數(shù)差異條帶僅含 3'UTR短片段 信息，這些區(qū)域的序列結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，得不到特異的基因且容易出現(xiàn)假陽性。 假陽性的鑒定：(1) Northern雜交：通常是將序列膠中回收的片段再次擴(kuò)增后作探針進(jìn)行 Northern雜交檢測，確定陽性片段后再進(jìn)行克隆。(2) Northern雜交并回收特異 cDNA片段(3) DNA部分序列分析法：先對(duì)10個(gè)菌落的cDN

8、A插入序列進(jìn)行部分序列分 析，通過比較選出不同菌落，再對(duì)其進(jìn)行序列分析以證實(shí)其異質(zhì)性。3、PCR法構(gòu)建減法cDNA文庫(SSH)該法通過2次雜交和2次PCR,使假陽性率可降到6%,且靈敏度高。用SSH可 一次同時(shí)分離幾十至幾百個(gè)差異基因，使效率大增。但由于 SSH需mRNA量大 (幾微克)，對(duì)mRNA來源困難的材料不利。因?yàn)?SSH對(duì)不同材料或材料間存在 的小片段缺失不能有效檢測，所以研究材料的差異不能太大。4、基因表達(dá)的序列分析(SAGE)目前，高通量地研究基因表達(dá)譜的方法主要有兩種，即生物芯片和基因表達(dá)序列分析(serial analysis of gene expression SAGE

9、)。基因芯片所能檢測的基因必須 是已知的基因，放在芯片上幾種基因的探針就只能檢測這幾種基因的表達(dá)譜；相比之下，SAGE能以遠(yuǎn)高于DNA芯片的精確度和重復(fù)性來檢測在病理?xiàng)l件下基因表達(dá)譜的改變，而不必考慮所檢測的基因是已知的還是未知的。因此在檢測疾病相關(guān)的新基因，特別是無法用基因芯片進(jìn)行檢測的低表達(dá)量致病基因時(shí)， SAGE是目前的最佳手段，無可取代。5、cDNA末端快速克隆(RACE)RACE是基于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上由已知的一段 cDNA片段，通過往兩端延伸擴(kuò)增 從而獲得完整的3'端和5'端的方法。與篩庫法相比較，此方法是通過 PCR技術(shù) 實(shí)現(xiàn)的，無須建立cDNA文庫，可以在很短的時(shí)

10、間內(nèi)獲得有利用價(jià)值的信息， 節(jié)約了實(shí)驗(yàn)所花費(fèi)的經(jīng)費(fèi)和時(shí)間，且只要引物設(shè)計(jì)正確，在初級(jí)產(chǎn)物的基礎(chǔ)上可 以獲得大量的感興趣基因的全長。五、基因芯片技術(shù)的基本原理是什么？有哪些類型？基因芯片在基因克隆中有哪 些應(yīng)用？如何利用基因芯片進(jìn)行基因的功能驗(yàn)證？1、原理：采用光導(dǎo)原位合成或顯微印刷等方法將大量特定序列的探針分子密集、 有序地固定于經(jīng)過相應(yīng)處理的硅片、玻片、硝酸纖維素膜等載體上，然后加入標(biāo)記的待測樣品，應(yīng)用已知核酸序列與互補(bǔ)的靶序列雜交， 通過雜交信號(hào)的強(qiáng)弱及 分布,來分析目的分子的有無、數(shù)量及序列，從而獲得受檢樣品的遺傳信息。2、類型：由于尚未形成主流技術(shù)，生物芯片的形式非常多，以基質(zhì)材料分，

11、有 尼龍膜、玻璃片、塑料、硅膠晶片、微型磁珠等；以所檢測的生物信號(hào)種類分， 有核酸、蛋白質(zhì)、生物組織碎片甚至完整的活細(xì)胞；按工作原理分類，有雜交型、 合成型、連接型、親和識(shí)別型等。但可分為三種主要類型：(1)固定在聚合物基片(尼龍膜，硝酸纖維膜等)表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標(biāo)記的靶基因與其雜交，通過放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測。(2)用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的 DNA探針陣列，通過與熒光標(biāo)記的靶基因雜 交進(jìn)行檢測。這種方法點(diǎn)陣密度可有較大的提高， 各個(gè)探針在表面上的結(jié)合量也 比較一致，但在標(biāo)準(zhǔn)化和批量化生產(chǎn)方面仍有不易克服的困難。(3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核甘酸探針陣列，與熒

12、光標(biāo)記的靶基因雜 交進(jìn)行檢測。該方法把微電子光刻技術(shù)與 DNA化學(xué)合成技術(shù)相結(jié)合，可以使基 因芯片的探針密度大大提高，減少試劑的用量，實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和批量化大規(guī)模生產(chǎn)， 有著十分重要的發(fā)展?jié)摿Α?、基因芯片在基因克隆上的應(yīng)用：(1)研究生物體對(duì)逆境的反應(yīng)植物抗逆等基因的篩選是從分子水平上揭示植物生理機(jī)制的一項(xiàng)基礎(chǔ)性研究，發(fā)現(xiàn)新基因是培育抗逆新品種的重要前提，如尋找抗病蟲、抗旱、耐寒的相關(guān)基因， 以進(jìn)行新產(chǎn)品的開發(fā)和品種的改良等， 利用基因芯片可以高通量、快速檢測基因 的差異表達(dá)。(2)基因表達(dá)水平的檢測基因芯片將已知基因固定于芯片上，將生物體某種生理狀態(tài)下所表達(dá)的 mRNA反 轉(zhuǎn)錄為cDNA并作熒

13、光標(biāo)記，然后和芯片進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號(hào)的強(qiáng)度來 分析相關(guān)基因的表達(dá)豐度。用基因芯片進(jìn)行的表達(dá)水平檢測可自動(dòng)、 快速地檢測 出成千上萬個(gè)基因的表達(dá)情況。(3)基因突變和多態(tài)性分析基因突變是順序上的核甘酸發(fā)生了改變，具突變將會(huì)引起相應(yīng)基因的功能喪失或 改變，引起遺傳病。芯片用于檢測分子突變，可以準(zhǔn)確地確定突變位點(diǎn)和突變型， 芯片可以同時(shí)檢測多個(gè)基因乃至整個(gè)基因組的突變，還可以進(jìn)行基因多態(tài)性分析。(4)基因組DNA序列分析基因芯片技術(shù)用于序列分析提出最早，原理是依據(jù)短的標(biāo)記寡核音探針與靶 DNA雜交，利用雜交譜重建靶DNA序列。(5)利用基因芯片技術(shù)進(jìn)行后基因組學(xué)研究基因預(yù)報(bào)和功能鑒定是測序和

14、對(duì)基因組進(jìn)行注釋的結(jié)果，基因組測序完成后，研究未知基因的功能是一個(gè)十分引人的后基因組研究課題。(6)轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測廣泛收集用于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的啟動(dòng)子、目的基因(如抗病基因、抗蟲基因等)和標(biāo)記 基因的EST序列，制成基因芯片，可以對(duì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行檢測。4、基因功能驗(yàn)證首先進(jìn)行序列分析，根據(jù)基因序列中特異的片段設(shè)計(jì)探針， 制備出代表該生物所 有基因的寡核甘酸或DNA陣列，即DNA芯片。然后將不同條件下從某生物中轉(zhuǎn) 錄出來的所有mRNA標(biāo)記，與DNA芯片雜交，通過分析雜交位點(diǎn)及信號(hào)強(qiáng)弱， 可 得知在不同條件下各組基因是否表達(dá)及各自表達(dá)的程度。根據(jù)表達(dá)圖譜進(jìn)行不同條件下基因表達(dá)的對(duì)比分析，可找出在環(huán)境

15、條件變化時(shí)，哪些基因表達(dá)發(fā)生了變 化，從而分析其生理功能，找出與該生理功能相關(guān)的功能基因。六、簡述生物信息學(xué)技術(shù)在基因克隆和基因結(jié)構(gòu)與功能分析中的應(yīng)用，舉例說明。1、核酸序列的同源性檢索GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的EST序列有數(shù)百萬個(gè)之多，由于EST代表著一段表達(dá) 基因序列，這樣就可用其與公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性檢索， 檢索與其同源的核酸序 列。典型分析是采取 NCBI的Blast軟件對(duì) GenBank中的非冗余數(shù)據(jù)庫(non-redundant database,nr 進(jìn)行查詢。2、比較基因組分析達(dá)爾文的進(jìn)化論給比較基因組學(xué)提供了理論依據(jù)。動(dòng)物進(jìn)化從低等到高等，動(dòng)物與動(dòng)物之間存在著親緣關(guān)系。這種

16、關(guān)系可以從基因序列上反映出來。親緣關(guān)系越 近，其基因序列的同源性就越高?？梢愿鶕?jù)已經(jīng)親緣關(guān)系較大的動(dòng)物的基因序列 來擴(kuò)增目的基因的序列。3、利用Unigene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子克隆從NCBI的UniGene數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，得到相應(yīng)的 UniGene編號(hào)。獲得待分 析序列的UniGene編號(hào)以后，就可以將與 UniGene Cluster的所有核酸序列下載 到本地，利用SequencherTM或其他的序列裝配軟件進(jìn)行組裝。形成較長的新生 序列°4、cDNA序列的開放閱讀框分析基于遺傳密碼表，可通過計(jì)算機(jī)方便分析核酸序列的讀碼框。通過 NCBI的 ORF巾nder,輸入cDNA序列，計(jì)算機(jī)

17、將按照六種相位翻譯成蛋白質(zhì)。5、基于核酸序列的電子基因定位對(duì)核酸序列進(jìn)行電子基因定位(即基因的染色體定位)，通過所定位區(qū)帶的相鄰 基因或者基因簇間接提示該基因的功能，是核酸分析的一個(gè)重要方面。6、基于序列同源性分析的蛋白質(zhì)功能預(yù)測相似的序列很可能具有相似的功能。因此，蛋白質(zhì)的功能預(yù)測最為可靠的方法是 進(jìn)行數(shù)據(jù)庫相似性檢索。富而不驕，莫若富而好禮?！比缃裎覀儾蝗备徊毁F只能是土豪，你可以一夜暴富，但是貴氣卻需要三代以上的培養(yǎng)?？鬃诱f土豪，但是我們?nèi)鄙儋F族。高貴是大庇天下寒士俱歡顏的豪氣與悲憫之懷，高貴是位卑未敢忘憂國的壯志與擔(dān)當(dāng)之志高貴是先天下之憂而憂的責(zé)任之心。精神的財(cái)富和高貴的內(nèi)心最能養(yǎng)成性格的高貴，以貴為美，在不知不覺中營造出和氣的氛圍；以貴為高，在潛移默化中提升我們的素質(zhì)。以貴為尊，