基因工程知識(shí)點(diǎn)

1、基因工程各章知識(shí)點(diǎn)第一章緒論1. 基因工程的首例操作實(shí)驗(yàn)三大理論基礎(chǔ)：DNA是遺傳物質(zhì)、DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制、遺傳密碼的破譯和遺傳物質(zhì)傳遞方式的確定三大技術(shù)基礎(chǔ)：限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與DNA的切割、DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與DNA片段的連接、基因工程載體的研究與應(yīng)用基因工程的誕生：72年，P.Berg首次實(shí)現(xiàn)體外DNA重組：體外用EcoRI分別切割SV40和入DNA,并用T4DNA連接酶連接成為重組的雜種DNA分子73年，S.Cohen體外重組DNA并轉(zhuǎn)化：具Kanr的E.Coli質(zhì)粒R65和具Tetr的E.Coli質(zhì)粒pSC101切割并連接轉(zhuǎn)化的大腸桿菌具有雙重抗性S.Cohen和H.

2、Boyer首次實(shí)現(xiàn)真核基因在原核中表達(dá)：將非洲爪蟾的DNA與E.Coli質(zhì)粒（pSC101）體外切割并連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌2. 基因工程的基本概念基因工程是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種新物體（受體）內(nèi)，使之穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或具有新性狀的DNA體外操作技術(shù)，也稱為分子克隆或重組DNA技術(shù)。供體、載體、受體是基因工程的三大基本元件。3. 基因工程的基本操作過(guò)程a分離目的DNA片段：酶切、PCR擴(kuò)增、化學(xué)合成等。b重組：體外連接的DNA和載體DNA，形成重組DNA分子。c轉(zhuǎn)化：將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞并與之一起增殖。d篩選：鑒定出獲得了重組DNA分子的

3、受體細(xì)胞。e對(duì)獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過(guò)培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。第二章載體1.理解用PBR322和PUC18作載體的克隆外源基因的原理。答案不確定PBR322作載體的克隆外源基因的原理：PBR322質(zhì)粒具有12種限制性內(nèi)切酶的單一識(shí)別位點(diǎn)：Tetr基因內(nèi)有7個(gè)酶切位點(diǎn)：BamHI,Sall:Amp基因內(nèi)有3個(gè)酶切位點(diǎn)：PstI。EcoRI和Hindm不在抗生素基因內(nèi)，不導(dǎo)致插入失活。如果在pBR322質(zhì)粒的Tetr基因內(nèi)位上插入外源DNA片斷，將切斷了tetr基因編碼序列的連續(xù)性，使tetr失去活性，產(chǎn)生出AmprTets表型的重組pBR322質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入AmpsTe

4、ts的大腸桿菌細(xì)胞。先涂布在含氨節(jié)青霉素的選擇培養(yǎng)基上，篩選出具Ampr菌落，再將它們影印于含四環(huán)素的選擇性培養(yǎng)基上。插入外源片斷的重組質(zhì)粒不能在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這樣就找出了含重組質(zhì)粒的大腸桿菌。如果在pBR322質(zhì)粒的Ampr基因內(nèi)位點(diǎn)插入外源DNA片斷，則反之。PUC18作載體的克隆外源基因的原理：在pBR322的基礎(chǔ)上，在其5'-端帶有一段多克隆位點(diǎn)的lacZ'基因，而發(fā)展的具有雙功能檢測(cè)特性的新型質(zhì)粒載體系列。典型的pUC系列的質(zhì)粒載體包括如下4個(gè)組成部分：a、pBR322的復(fù)制起始點(diǎn)。b、氨節(jié)青霉素抗性基因但它的DNA核昔酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來(lái)的核酸內(nèi)切

5、限制酶的識(shí)別位點(diǎn)。c、大腸桿菌3-半乳糖昔酶基因（lacZ）的啟動(dòng)子及編碼a-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱之為lacZ'基因。d、位于lacZ'基因中的靠近5'-端的一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段。但它并不破壞該基因的功能。2. 理想載體的必備條件（1）、較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。（2）、應(yīng)最大限度的具有各種常用限制性內(nèi)切酶的單一酶切位點(diǎn)。（3）、具兩種以上的選擇標(biāo)記基因。（4）、重組質(zhì)粒較易導(dǎo)入宿主細(xì)胞并復(fù)制和表達(dá)。3.穿梭載體和a-互補(bǔ)A穿梭質(zhì)粒載體是指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記，因而可在兩種不同的宿主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。常見的穿梭質(zhì)粒有大

6、腸桿菌-土壤農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒載體、大腸桿菌-枯草芽跑桿菌穿梭質(zhì)粒載體、大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體。BlacZ基因的突變體M15質(zhì)粒（缺失氨基酸殘基11到41）是沒有野生型lacZ基因產(chǎn)物那種分解X-gal能力的。但如果在M15突變體的抽取物中加入6-半乳糖昔酶的第3至第92氨基酸殘基的肽段（a肽）則能恢復(fù)M15分解X-gal，而顯示藍(lán)色的能力。這樣一種基因內(nèi)互補(bǔ)現(xiàn)象稱做a互補(bǔ)。第三章核酸操作的基本技術(shù)1.堿解法提取質(zhì)粒DNA的原理？提取DNA時(shí)常用試劑的作用原理堿裂解法是基于DNA的變性與復(fù)性差異而達(dá)到分離目的的。堿性使質(zhì)粒DNA變性，再將pH值調(diào)至中性使其復(fù)性，復(fù)性的為質(zhì)粒DNA，而染色體

7、DNA不會(huì)復(fù)性，纏結(jié)成網(wǎng)狀物質(zhì)，通過(guò)離心除去。堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH值高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離,當(dāng)以pH4.8的NaAc/KAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。常用試劑的作用溶菌

8、酶：溶解菌體細(xì)胞壁的6-1,4糖苜鍵，即具溶菌作用。葡萄糖：增加溶液粘度，防止DNAe機(jī)械切力作用而降解EDTA金屆離子螯合劑，抑制脫氧核糖核酸酶（Dnase）對(duì)DNA勺降解作用SDS陰離子表面活性劑，可破壞細(xì)胞膜，使DNAI放出來(lái)，結(jié)合蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)抑制脫氧核糖核酸酶（RNase）的活性。酚、氯仿：蛋白質(zhì)變性劑。使蛋白質(zhì)失水變性，；離心后與水相（含DNA）分離。異戊醇：降低分子表面張力，可減少氣泡的產(chǎn)生；有助于分相。無(wú)水乙醇：DNA的沉淀劑。奪取DNA周圍的水分，使DNA失水而易于聚合。NaOH:核酸在pH=59的溶液中穩(wěn)定，pH>12或pH<3時(shí)會(huì)引起氫鍵斷裂。KAc

9、:KAc-HAc,pH=4.8緩沖液，變性的質(zhì)粒DNA在此溶液中發(fā)生復(fù)性。2. RNA分離的關(guān)鍵因素。（RNA酶是一種蛋白質(zhì)，所以提取時(shí)利用氯仿抽提可以很好去除，得到高質(zhì)量的RNA。）RNA分離的關(guān)鍵因素是盡量減少RNA酶（RNase）的污染，因此在RNA制備過(guò)程中，必須注意控制RNase酶的活性，并設(shè)法抑制其活性。造成RNase酶污染源有：所用的器皿、所用的溶液、實(shí)驗(yàn)人員的手及飛沫。玻璃器皿：烘箱中（180C）烘烤8h以上。塑料器皿：0.1%DEPC（diethylpyrocarbonate，二乙基焦碳酸鹽）浸泡或用氯仿洗滌。配置的溶液應(yīng)盡可能用0.1%DEPC在37C處理12h以上，然后高

10、壓滅菌。全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程均需戴手套操作，并經(jīng)常更換。RNA電泳槽常用去污劑洗滌，0.1%DEPC處理。提取中出現(xiàn)RNA降解原因：操作過(guò)程中溫度太高、操作時(shí)有RNA酶的污染或RNase抑制劑量不足等都有可能使RNA降解。解決方法：做好使用器皿的RNase去除工作；在整個(gè)操作過(guò)程中最好在低溫（4C）或是冰上進(jìn)行；操作者自始至終戴手套。3. 電泳法和紫外分光光度法都能檢測(cè)DNA的濃度和純度，哪種方法更好。A、紫外光度法原理：核酸中含有喋吟和嚅嚏環(huán)，在256265nm處顯示出特征吸收峰，在230nm處吸收最小。DNA或RNA分子在260nm處有特異吸收峰，吸收強(qiáng)度與系統(tǒng)中DNA或RNA的濃度成正比。方法：

11、首先用TE或ddH2O稀釋待測(cè)DNA樣品；用TE或ddH2O為空白對(duì)照，在260nm及280nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)讀數(shù)為0;加入DNA稀釋液與上述兩波長(zhǎng)處讀取OD值；A260值為1時(shí)相當(dāng)于50ug/mL的dsDNA,40ug/mL的ssDNA或RNA;通過(guò)計(jì)算公式計(jì)算濃度及純度。雙鏈DNA（dsDNA）濃度（g/ml）=50XOD260X稀釋倍數(shù)單鏈DNA或RNA（ssDNAssRNA）濃度g/ml）=40XOD260X稀釋倍數(shù)DNA純度可通過(guò)OD260/OD280來(lái)衡量：純的DNA的OD260/OD280為1.82.0;OD260/OD280>2.0為RNA污染，V1.8為蛋白質(zhì)污染

12、；OD260/OD280V0.9時(shí)適當(dāng)稀釋樣品，可再進(jìn)行一次抽提；OD260/OD280>2時(shí)則RNA過(guò)高，要除去RNA。B、水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA在生理?xiàng)l件下，核酸分子是多聚陰離子當(dāng)核酸分子被放置在電場(chǎng)當(dāng)中時(shí)，它們就會(huì)向正電極的方向遷移。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的電泳遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。原理：在瓊脂糖凝膠中加入EB,當(dāng)與DNA混合時(shí)EB可插入到DNA分子中形成熒光絡(luò)合物。而EB在紫外光照射下能發(fā)射熒光，熒光的強(qiáng)度與DNA的含量成正比。便可十分敏感而方便地檢測(cè)出凝膠介質(zhì)中DNA的存在、強(qiáng)度和譜帶的位置。在適當(dāng)?shù)娜旧珬l件下，熒光的強(qiáng)度同DNA數(shù)量成正比，

13、據(jù)此，人們可以估計(jì)DNA的濃度。不同大小的DNA片段在凝膠中的遷移速度不同，據(jù)此，科研工作者們便能判斷DNA的分子質(zhì)量，其有無(wú)降解；同時(shí)，通過(guò)同已知分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段之間的比較，還可測(cè)定出隨遷移的DNA片段的分子質(zhì)量。4.為什么核酸保存在TE溶液(Tris-HCl和EDTA)中比較穩(wěn)定在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)(pKa=7.2)和硼酸系統(tǒng)(pKa=9.24)等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2+產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反應(yīng)時(shí)，不同的酶對(duì)

14、輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-Hcl(pKa=8.0)的緩沖系統(tǒng)，由丁緩沖液是TrisH/Tris，不存在金屆離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時(shí)，大都采用Tris-HCL系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。第四章限制性內(nèi)切酶1. 寄主的限制與修飾的作用R/M中的限制作用(restriction)是指一定類型的細(xì)菌可以通過(guò)限制酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA(外源DNA)導(dǎo)致噬菌體寄主幅度受到限制的現(xiàn)象。限制酶來(lái)完成R/M中的修飾作用(modification)是指寄主本身的DNA由于合成后通過(guò)甲基化作用得以甲基化，使DN

15、A獲得修飾，從而避免遭自身限制酶的破壞。寄主的限制與修飾有兩個(gè)方面的作用：保護(hù)自身的DNA不受限制；破壞外源DNA使之迅速降解。細(xì)菌正是利用限制與修飾系統(tǒng)來(lái)區(qū)分自身DNA與外源DNA的。2.RE識(shí)別序列的特點(diǎn)主要類型I型型m型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體同源三聚體異源二聚體輔助因子ATP,Mg2+,SAMMg2+ATP,Mg2+,SAM識(shí)別序列TGAN8TGCT或AACN6GTGC旋轉(zhuǎn)對(duì)稱序列GAGCC或CAGCAG切割位點(diǎn)距離識(shí)別位點(diǎn)1Kb處隨機(jī)性切割識(shí)別序列內(nèi)或附近特異性切割距識(shí)別序列下游2426bp處3. 同裂酶同尾酶完全消化不完全消化星號(hào)活性同裂酶(isoschizom

16、ers)：來(lái)自不同有機(jī)體，識(shí)別切割相同序列的一組酶。同尾酶(isocaudamer):來(lái)源不同，識(shí)別序列也各不相同，但能產(chǎn)生出相同的粘性末端的RE。由同尾酶所產(chǎn)生的DNA片段可通過(guò)粘性末端之間的互補(bǔ)作用而連接，在基因克隆中很有用。完全酶切消化(completedisestion):如果一種RE對(duì)某個(gè)DNA分子的所有識(shí)別位點(diǎn)均實(shí)現(xiàn)了完全的切割，稱為完全酶切消化。限制性內(nèi)切酶的不完全消化(partialdigestion):RE對(duì)DNA分子的消化不完全，即未能在所有分子的所有識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行完全的切割，可獲得分子量大小有所增加的限制片段產(chǎn)物。星號(hào)活性：非最適條件（酶量大、甘油高、低離子強(qiáng)度，高pH等）

17、常使酶發(fā)生不正確切割（切割特異性序列相似的序列）。4. 影響酶切的因素（1）、DNA純度：DNA制劑中，Pro.酚，氯仿，酒精，EDTA，高鹽濃度等，影響RE的活性。提高酶切效率方法：增加RE用量；擴(kuò)大反應(yīng)體積以使?jié)撛诘囊种埔蛩叵鄳?yīng)稀釋；延長(zhǎng)酶切時(shí)間。（2）、DNA甲基化程度：甲基化作用會(huì)強(qiáng)烈影響酶活性；基因工程中用的菌株為喪失了甲基化酶的；不同位點(diǎn)之間的甲基化程度是不相同的且與DNA來(lái)源的細(xì)胞類型有密切關(guān)系。（3）、酶切反映溫度：（4）、DNA分子結(jié)構(gòu)：超螺旋比線性DNA需酶量大；DNA的邊側(cè)序列也有影響。（5）、RE的緩沖液：Mg2+。Tris-HCl:使pH處于最佳數(shù)值范圍內(nèi)。保護(hù)酶穩(wěn)定

18、性的物質(zhì)3-疏基乙醇、（DDT）、（BSA）。第五章DNA的連接1. 連接酶的作用及范圍作用：連接酶是一種能夠催化DNA上裂口兩側(cè)（相鄰）核昔酸裸露的3'羥基和5'磷酸之間形成共價(jià)結(jié)合的磷酸二酯鍵，使原來(lái)斷開的DNA裂口重新連接起來(lái)的酶。在DNA復(fù)制、修復(fù)以及重組過(guò)程中起重要作用。范圍：可連接切口（nick），但不可連接缺口（gap）。可連接雙鏈DNA分子的一部分，但不可連接兩條單鏈DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子。DNA連接酶的種類：1、T4噬菌體DNA連接酶：T4噬菌體DNA連接酶（又稱T4DNA連接酶）分子質(zhì)量為68Ku,需要ATP作為輔助因子，最早是從T4噬菌體感染的大

19、腸桿菌中提取的。范圍T4噬菌體DNA連接酶可以連接：（1）兩個(gè)帶有互補(bǔ)黏性末端的雙鏈DNA分子。（2）兩個(gè)帶有平頭末端的雙鏈DNA分子。（3）一條鏈帶有切口的雙鏈DNA分子。（4）RNA:DNA雜合體中RNA鏈上的切口，也可將RNA末端與DNA鏈連接。2、大腸桿菌DNA連接酶：大腸桿菌DNA連接酶分子質(zhì)量為75Ku,需要NAD+作輔助因子。范圍大腸桿菌DNA連接酶可連接：（1）兩個(gè)帶有互補(bǔ)黏性末端的雙鏈DNA分子。（2）一條鏈帶有切口的雙鏈DNA分子。2. 影響連接的因素A、影響因素：反應(yīng)溫度、離子濃度、DNA末端的結(jié)構(gòu)、DNA末端的相對(duì)濃度、DNA片段的濃度和相對(duì)分子量等對(duì)連接效率都有影響。

20、連接反應(yīng)速度完全由互相匹配的DNA末端濃度所決定。在連接反應(yīng)體系中，一般可形成兩種不同構(gòu)型的DNA分子：線性分子；環(huán)狀分子。在基因克隆操作技術(shù)中，DNA分子的構(gòu)型直接影響轉(zhuǎn)化過(guò)程。對(duì)于兩個(gè)以上的DNA分子的連接，不僅要考慮反應(yīng)體系中DNA末端的總濃度，而且還要考慮載體與插入片段的末端濃度的比例。原則上，應(yīng)該保證一個(gè)DNA分子的未端具有較高的幾率與另一個(gè)DNA分子連接，以減少自連，從而達(dá)到重組的目的DNA分子間的連接。B、提高連接效率的方法：a適宜的溫度：為粘性末端的Tm與DNA連接酶最適溫度的折衷。b插入片段載體片段10-20倍。c適當(dāng)加大酶的用量，但單位含酶量低時(shí)，隨著用量的加大，甘油含量也

21、提高了，反而影響連接效率。d用堿性磷酸酶處理載體，使5'-P變?yōu)?'-OH,減少載體自連，提高重組分子形成比率。3. 平齊末端的連接方法A、直接用T4連接酶連接B、同聚物加尾法：不需模板鏈的存在，末端脫氧核昔酸轉(zhuǎn)移酶可將核昔酸加到DNA分子單鏈延伸末端的3'-OH上。故在反應(yīng)物中存在一種脫氧核昔酸的條件下，便構(gòu)成由同一種類型核昔酸組成的多聚核昔酸尾巴，當(dāng)兩種DNA分子帶有可互補(bǔ)配對(duì)的poly尾巴時(shí)，能彼此連接起來(lái)，此種連接方式稱為同聚物加尾（一般加10-40個(gè)堿基就足夠了）。應(yīng)用（1）、酶切后形成的平齊末端。（2）、機(jī)械切割大分子DNA產(chǎn)生平齊末端。（3）、RNA:cD

22、NA具有平齊末端。缺點(diǎn)：無(wú)法在尾巴處（原位）再進(jìn)行切割。C、銜接物連接法：所謂銜接物（linker）是指用化學(xué)方法合成的一段由10-12個(gè)核昔酸組成具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平齊末端的雙鏈寡聚核昔酸片段。將銜接物的5'末端和待克隆的DNA的5'末端用多核昔酸激酶處理使之磷酸化，然后通過(guò)T4連接酶的作用將兩者連接起來(lái)。接著用適當(dāng)?shù)腞E消化具有銜接物的DNA分子和克隆載體分子，這樣的結(jié)果使二者產(chǎn)生出了的互補(bǔ)的粘性末端，則可用連接酶將DNA分子和載體分子按常規(guī)的粘性末端連接法將二者連接起來(lái)。優(yōu)點(diǎn)：兼具同聚加尾法和粘性末端法各自的優(yōu)點(diǎn)；可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)計(jì)不同RE識(shí)別位點(diǎn)的銜接物，

23、從而大提高平齊末端DNA片段的連接效率；可實(shí)現(xiàn)外源片段定向克隆。缺點(diǎn)：基因內(nèi)部有相同酶位點(diǎn)時(shí)，酶切會(huì)把該基因切斷，從而給后續(xù)的亞克隆和其他操作帶來(lái)麻煩。»接頭連接法第六章轉(zhuǎn)化及重組體的鑒定1. 感受態(tài)感受態(tài)：凡是能吸收游離DNA片段的細(xì)菌稱為感受態(tài)細(xì)菌或者說(shuō)處于感受態(tài)；正常生長(zhǎng)條件下的一個(gè)或多個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期都處于高度感受態(tài)的細(xì)菌；經(jīng)過(guò)特殊處理才表現(xiàn)感受態(tài)；對(duì)于轉(zhuǎn)化表現(xiàn)強(qiáng)烈抑制的細(xì)菌。2. 在DNA水平上檢測(cè)轉(zhuǎn)化體的方法有哪些；RNA水平的檢測(cè)方法。答案不確宇DNA水平上質(zhì)粒DNA的提取和限制性酶切分析；質(zhì)粒DNA與分子雜交。觀察是否有表型變化的重組體。聯(lián)合運(yùn)用直接和間接的手段進(jìn)行快速

24、而準(zhǔn)確的鑒定。重組體的篩選：直接選擇法：抗藥性標(biāo)記選擇，插入失活法；標(biāo)志補(bǔ)救如a互補(bǔ)；分子雜交法原位雜交；Southern印跡。非直接選擇法：免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法酶免檢測(cè)法。第七章目的基因的獲得1. 什么是cNA?如何通過(guò)構(gòu)建cNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)獲得目的基因cDNA(complementaryDNA):是指與mRNA互補(bǔ)的DNA，是由mRNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄而成的。cDNA文庫(kù)的構(gòu)建基本過(guò)程：通過(guò)一系列的酶促作用，使總poly(A)mRNA制劑轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA群體，并插入到適當(dāng)?shù)妮d體cDNA基因文庫(kù)含重組DNA分子的受分子上，然后再轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主菌株的細(xì)胞內(nèi)。如此便構(gòu)成了包含

25、產(chǎn)所有基因編碼的(cDNAlibrary)。|mRNA|反轉(zhuǎn)錄酶|cDNA|復(fù)制版鏈cDNA|載體|重組DNA分子|受體菌具體步驟第一步：分離總RNA，然后從總RNA中分離出mRNA部分，約占細(xì)胞總RNA的1%-2%。第二步：以mRNA為模板，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA。第三步：將mRNA-cDNA雜交分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA分子。第四步：將合成的雙鏈cDNA重組到質(zhì)粒載體或噬菌體上。第五步：將重組分子轉(zhuǎn)入大腸桿菌主細(xì)胞中進(jìn)行增殖。應(yīng)用入噬菌體構(gòu)建基因組文庫(kù)：1、基本步驟：從供體基因組DNA產(chǎn)生適當(dāng)大小的DNA片段；在體外將這些DNA片段同適當(dāng)?shù)娜胧删w連接成重組分子；轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的受體細(xì)胞

26、中去；從轉(zhuǎn)化子克隆群體中挑選出含有目的基因的片段。2. 供體DNA制備：(1) 、機(jī)械切割產(chǎn)生合適大小的外源DNA片段。(2) 、RE的部分消化產(chǎn)生合適大小的外源DNA片段。從基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因：組織或細(xì)胞染色體DNA限制性內(nèi)切酶基因片段克隆載體回DNA分子|受體菌橢重組分子的轉(zhuǎn)化2.PCR的原理；引物；簡(jiǎn)并引物；RT-PCR;PCR的原理：實(shí)質(zhì)為體內(nèi)DNA復(fù)制的體外模擬。當(dāng)雙鏈DNA變性為單鏈后，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，并利用反應(yīng)混合物中的四種dNTPs,以與模板互補(bǔ)的核昔酸為引物，合成新生的DNA互補(bǔ)鏈。理想拷貝數(shù)=2n,(n：循環(huán)次數(shù))；實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)n,(X：

27、平均效率約為0.85,n：循環(huán)次數(shù))9引物定義：是(兩條)人工合成的與模板DNA£補(bǔ)的核苜酸鏈長(zhǎng)度：一般為15-30bp,且與單鏈DN模板互補(bǔ)，短的6-12bp,長(zhǎng)的35bp。兩引物與模板結(jié)合位點(diǎn)之間的距離決定了擴(kuò)增區(qū)段的長(zhǎng)度，1kb為理想的擴(kuò)增跨度，2kb左右為有效擴(kuò)增跨度。簡(jiǎn)并引物：簡(jiǎn)并引物是由多種寡核苜酸組成的混合物，彼此之間僅有一個(gè)或數(shù)個(gè)核苜酸的差異。RT-PCR先將RN敏錄成cDNA接著以cDN的棋板進(jìn)行PCIT增。這一技術(shù)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCRRT-PCR)。3. 設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單的引物；如何通過(guò)PCR獲得目的基因給出DNA序列，寫出引物

28、第八章凝膠電泳與分子雜交1.如何通過(guò)瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA(電泳的原理及影響因素)電泳原理在生理?xiàng)l件下，核酸分子是多聚陰離子當(dāng)核酸分子被放置在電場(chǎng)當(dāng)中時(shí)，它們就會(huì)向正電極的方向遷移。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNAb子的電泳遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越強(qiáng)；反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。瓊脂糖凝膠電泳(agrosegelelectrophisis)(1) 支持介質(zhì)：瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，系從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來(lái)的。(2) 分辨能力：瓊脂糖凝膠基質(zhì)的孔徑大小可以通過(guò)調(diào)整瓊脂糖的濃度來(lái)改變

29、。其分辨力為為0.250kb范圍之間的DNAt段；凝膠濃度越大，介質(zhì)孔徑越小，分辨能力越強(qiáng)。影響DNAfc泳的因素DN疥子大小、DN疥子構(gòu)型、凝膠濃度、電場(chǎng)強(qiáng)度、EB電泳緩沖液2. Southern雜交；缺口平移法制備探針Southern雜交：根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳中分離的DN后段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過(guò)同標(biāo)記的單鏈DNAJRN徐針的雜交作用檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DN后段，這種實(shí)驗(yàn)方法叫做DNAP跡雜交技術(shù)。由于它是由E.Southern于197弭首先設(shè)計(jì)出來(lái)的，故乂叫做SouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。缺口平移法制備探針：首先用適當(dāng)濃度的DNA酶I(DNAseI)在探針DNA雙

30、鏈上造成缺口，然后再借助于DNA聚合酶I(DNapolymerasI)的53,的外切酶活性，切去帶有5'磷酸的核昔酸；同時(shí)又利用該酶的5'3,聚酶活性，使32P標(biāo)記的互補(bǔ)核昔酸補(bǔ)入缺口，DNA聚合酶I的這兩種活性的交替作用，使缺口不斷向3'的方向移動(dòng)，同時(shí)DNA鏈上的核昔酸不斷為32P標(biāo)記的核昔酸所取代。3. 什么是Northern雜交和western雜交Northern雜交：將變性(用甲醛、乙二醇，防止RN形成二級(jí)結(jié)構(gòu))瓊脂糖膠電泳分離的RNA或mRNA轉(zhuǎn)移吸印到特殊(疊氮化的或其它化學(xué)修飾的)的活性濾膜或?yàn)V紙上，通過(guò)共價(jià)交聯(lián)作用而使它們永久地結(jié)合在一起，與標(biāo)記的探針

31、RN威DN厥交，然后放射自顯影以分析RNA(大小、數(shù)量)的方法，這種方法同薩瑟恩的DNAP跡雜交技術(shù)十分類似，所以叫做諾塞恩RNA吸印雜交技術(shù)（Northernblotting）。western雜交:將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移并結(jié)合到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射同位素125I標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)行反應(yīng)，以檢測(cè)蛋白質(zhì)的雜交技術(shù)，這種技術(shù)叫做韋斯頓蛋白質(zhì)雜交技術(shù)（Westernblotting）。第九章測(cè)序Sanger測(cè)序的原理（2分題）利用DN原合酶和雙脫氧鏈終止物測(cè)定核苜酸順序的方法。也稱為引物合成法或酶催引物合成法。原理：DN>e合酶能利用單鏈DN的棋板，離體合成出其互補(bǔ)鏈，當(dāng)反應(yīng)液

32、中存在23'-雙脫氧核苜三磷酸（ddNTB,它可以象2'-脫氧核苜三磷酸（dNTP那樣直接摻入新合成的DN側(cè)中，但因ddNTP3'端不具-OHtt團(tuán)，所以寡核苜酸鏈就不能再繼續(xù)延長(zhǎng)了即DNA1合成中止了。第十章植物基因工程1.反義核酸Ti質(zhì)粒GFP反義核酸是指能與特定mRNA精確互補(bǔ)、特異阻斷其翻譯的RNA或DNA分子。利用反義核酸特異地封閉某些基因表達(dá)，使之低表達(dá)或不表達(dá)，這種技術(shù)即為反義核酸技術(shù)。Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價(jià)閉合的環(huán)狀DN疥子,其分子量為95156X106D,約有200kb左右。具有接合轉(zhuǎn)移特性GFP（綠色熒光蛋白基因）：這種蛋

33、白質(zhì)最早是由下村修等人在1962年在一種學(xué)名Aequoreavictoria的水母中發(fā)現(xiàn)。其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光線激發(fā)下，會(huì)發(fā)出綠色螢光。這個(gè)發(fā)光的過(guò)程中還需要冷光蛋白質(zhì)Aequorin的幫助，且這個(gè)冷光蛋白質(zhì)與鈣離子（Ca2+）可產(chǎn)生交互作用。2. Ti質(zhì)粒的改造應(yīng)掌握以下幾個(gè)原則：a、保留TDNA勺轉(zhuǎn)移功能和vir區(qū)。b、除去TDNA勺致瘤性（激素基因）。c、通過(guò)簡(jiǎn)便手段使外源DN®入TDNA,并可隨之整合到植物染色體上。3. 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的原理農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法最早是由Marton等（1979年）以原生質(zhì)體為受體建立起來(lái)的，經(jīng)過(guò)一系列改進(jìn)后，目前已經(jīng)成為最常用的轉(zhuǎn)化方法。共培養(yǎng)法是利用Ti質(zhì)粒系統(tǒng)，將農(nóng)桿菌與植物原生質(zhì)體、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、葉盤、莖段等共同培養(yǎng)的一種轉(zhuǎn)化方法。轉(zhuǎn)化過(guò)程：再生體系的建立轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)法