誘生型一氧化氮合酶在白色和雜色豚鼠脈沖噪聲損傷耳蝸中的表達(dá)

1、誘生型一氧化氮合酶在白色和雜色豚鼠脈沖噪聲損傷耳蝸中的表達(dá)                      作者：何青蓮 ,熊敏,李云英石靈春 ,譚敏,李華 【摘要】  【目的】 觀察誘生型一氧化氮合酶(iNOS)在脈沖噪聲暴露白色和雜色豚鼠耳蝸中的表達(dá),以探討黑色素對(duì)耳蝸損傷的保護(hù)作用機(jī)理。【方法】將白色和雜色豚鼠暴露于脈沖噪聲,復(fù)制耳蝸損傷的模型。采用免疫組織化學(xué)的方法觀察iNO

2、S在兩組豚鼠耳蝸的表達(dá)。 【結(jié)果】iNOS在兩組脈沖噪聲暴露豚鼠耳蝸中均呈陽性表達(dá),以血管紋和螺旋神經(jīng)節(jié)的表達(dá)較強(qiáng),而且iNOS在白色豚鼠耳蝸的表達(dá)顯著強(qiáng)于雜色豚鼠?！窘Y(jié)論】耳蝸黑色素拮抗耳蝸損傷的作用可能是通過抑制耳蝸iNOS表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。 【關(guān)鍵詞】  耳蝸/損傷;耳蝸/病理學(xué);脈沖噪聲;黑色素;疾病模型，動(dòng)物;豚鼠 一氧化氮(nitric oxide, NO)有多種生物學(xué)作用,由L?精氨酸在一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)的催化作用下產(chǎn)生。有研究表明誘生型NOS(iNOS)參與噪聲的耳蝸損傷機(jī)制1,而黑色素對(duì)雜色豚鼠耳蝸的損傷有拮抗作用2。

3、目前有關(guān)黑色素拮抗豚鼠耳蝸損傷的機(jī)理尚不清楚3,本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察iNOS在脈沖噪聲暴露損傷白色和雜色豚鼠耳蝸的表達(dá),以探討黑色素是否通過抑制iNOS的表達(dá)而拮抗耳蝸損傷。現(xiàn)報(bào)道如下。 1材料與方法 1?1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康白色紅目豚鼠(白色組)和雜色豚鼠(雜色組)各8只,耳鏡檢查鼓膜正常,耳廓反射靈敏。豚鼠來源于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,3月齡,體質(zhì)量250 g左右,雌雄兼用,合格證號(hào)：0017410。 1?2主要試劑與儀器抗iNOS抗體、鏈酶親和素生物素過氧化物酶復(fù)合物(SABC)免疫組化試劑盒(SA1022)均為Sigma公司產(chǎn)品。86式自動(dòng)步槍來源于廣東省軍區(qū)軍訓(xùn)靶場(chǎng)，Path

4、finder I型聽功能測(cè)試儀(Nicolet公司)。 1?3造模方法4-5脈沖噪聲發(fā)生源為86式自動(dòng)步槍,脈沖噪聲發(fā)生環(huán)境為軍訓(xùn)靶場(chǎng),將豚鼠置于距步槍口15 cm處,測(cè)得該處聲壓為170 dB。步槍連續(xù)激發(fā)6發(fā),每次激發(fā)間隙10 s。 1?4聽覺腦干誘發(fā)電位(ABR)檢測(cè)ABR閾值采用聽功能測(cè)試儀記錄,短聲刺激,聲音由耳機(jī)通過與豚鼠外耳道耦合的塑料小管輸入,以第3波為基準(zhǔn)測(cè)反應(yīng)閾,測(cè)定脈沖噪聲暴露前后聽閾值。兩組豚鼠在脈沖噪聲暴露前及暴露后24 h行ABR檢測(cè)。 1?5取材最后1次檢測(cè)ABR后,豚鼠在全麻下開胸,以磷酸鹽緩沖液(PBS)心臟灌流,在灌流液清亮?xí)r,改用40 g/L多聚甲醛灌注固

5、定5 min。迅速取下雙側(cè)顳骨,將耳蝸置于4、40 g/L多聚甲醛液中,在解剖顯微鏡下摘除鐙骨,用細(xì)針于蝸頂鉆一小孔,輕輕以40 g/L多聚甲醛灌流耳蝸,耳蝸在40 g/L多聚甲醛固定12 h以上,PBS漂洗數(shù)次,100 g/L乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣,石蠟包埋,切片,每片厚度6 m。    1?6免疫組織化學(xué)染色兩組豚鼠耳蝸切片以二甲苯及酒精脫石蠟后,Tris緩沖鹽溶液(TBS)漂洗10 min×3次,體積分?jǐn)?shù)2%雙氧水處理20 min。TBS漂洗10 min×2 次后,2 g/L Triton處理10 min。TBS漂洗10

6、min×2次,50 g/L胎牛蛋白封閉60 min。加抗iNOS抗體(以8 g/L胎牛蛋白稀釋為1800,Sigma公司,從兔血清制備)，在4冰箱過夜。加入二抗(羊抗兔, 用TBS稀釋為1400)1 h,TBS漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素(Strep?HRP,用TBS稀釋為1100)1 h,TBS漂洗10 min×4次后,用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液顯色,顯色在光鏡下控制進(jìn)行。陰性對(duì)照以8 g/L胎牛蛋白代替抗iNOS抗體,以慶大霉素?fù)p傷豚鼠腎臟切片為陽性對(duì)照。iNOS在兩組豚鼠耳蝸的表達(dá)強(qiáng)度以+表示進(jìn)行半定量分析6。 1?7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 11?5軟件

7、進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 2結(jié)果 2?1兩組豚鼠ABR聽閾變化由表1可知,兩組豚鼠在脈沖噪聲暴露后ABR比較差異具有顯著性意義(P<0?01),雜色豚鼠的平均聽閾比白色豚鼠約低17 dB左右。表1兩組豚鼠ABR聽閾變化比較2?2兩組豚鼠耳蝸iNOS表達(dá)比較 iNOS在兩組豚鼠耳蝸反應(yīng)均呈陽性,而且在耳蝸的各轉(zhuǎn)都呈陽性,iNOS在白色豚鼠耳蝸的表達(dá)明顯強(qiáng)于雜色豚鼠。在Corti氏器,支持細(xì)胞如：Hensen細(xì)胞、Deiter細(xì)胞、內(nèi)外柱細(xì)胞、邊緣細(xì)胞iNOS反應(yīng)均呈陽性。感覺細(xì)胞(內(nèi)、外毛細(xì)胞)iNOS染色呈陽性,外毛細(xì)胞染色較強(qiáng),內(nèi)毛細(xì)胞染色較弱。蝸神經(jīng)的iNOS染色在光鏡下呈陰性。圖1結(jié)

8、果顯示：白色豚鼠耳蝸血管紋和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞iNOS反應(yīng)均呈強(qiáng)陽性 (圖1-a,b),雜色豚鼠耳蝸血管紋和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞iNOS反應(yīng)均呈弱陽性 (圖1-c,d)。iNOS在兩組豚鼠耳蝸的表達(dá)強(qiáng)度見表2。表2兩組豚鼠iNOS耳蝸表達(dá)強(qiáng)度比較 3討論 噪聲能導(dǎo)致耳蝸的損傷,噪聲引起耳蝸的損傷包括機(jī)械性和代謝性兩種機(jī)制,一般認(rèn)為先有機(jī)械性損傷,之后繼發(fā)代謝性損傷。雜色豚鼠耳蝸黑色素能拮抗噪聲對(duì)耳蝸的損傷作用,但是黑色素拮抗耳蝸損傷的作用機(jī)理不清楚3。研究證實(shí)iNOS是參與噪聲耳蝸損傷的主要病理因素之一1。本研究結(jié)果表明在脈沖噪聲損傷時(shí)iNOS在雜色豚鼠耳蝸的表達(dá)強(qiáng)度顯著低于白色豚鼠耳蝸的強(qiáng)度,證明雜色

9、豚鼠耳蝸黑色素通過代謝途徑抑制iNOS活性,從而拮抗豚鼠耳蝸的損傷。iNOS在脈沖噪聲損傷耳蝸中表達(dá)陽性,尤以血管紋和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞為甚。iNOS在正常的組織中不表達(dá),一旦在病理因素的刺激下表達(dá)則持續(xù)催化產(chǎn)生大量NO7,而大量NO則對(duì)組織產(chǎn)生損傷作用。另外,NO與過氧化物反應(yīng)產(chǎn)生過氧亞硝酸鹽8-9,過氧亞硝酸鹽能迅速解離氫氧根自由基,亦導(dǎo)致細(xì)胞損傷。同時(shí),NO能激活N-甲基-D-天冬氨酸受體的負(fù)反饋機(jī)制,而導(dǎo)致內(nèi)耳的神經(jīng)阻滯10。豚鼠耳蝸在暴露脈沖噪聲后血管紋和螺旋神經(jīng)節(jié)iNOS的表達(dá)較強(qiáng),從而產(chǎn)生大量NO而損傷血管紋和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。血管紋是整個(gè)耳蝸包括內(nèi)外毛細(xì)胞及支持細(xì)胞能量的主要來源11

10、,血管紋的損傷導(dǎo)致耳蝸功能的失調(diào)。螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是聽覺傳導(dǎo)路的一級(jí)神經(jīng)原,其損傷導(dǎo)致聽覺傳導(dǎo)的阻滯。綜上所述,脈沖噪聲能引起耳蝸iNOS的表達(dá),而雜色豚鼠耳蝸黑色素通過代謝途徑抑制iNOS活性,從而拮抗脈沖噪聲耳蝸的損傷。    【參考文獻(xiàn)】  1Shi X, Nuttall A l. Upregulated iNOS and oxidative damage to the cochlear stria vascularis due to noise stressJ.Brain Res,2003,967(1-2)：1.2 朱明,黃以樂,龍孝斌,

11、等。內(nèi)耳色素與爆震性聽損傷J聽力學(xué)及言語疾病雜志,2000,8(3)：140.3 Bartels S, Ito S, Trune D R, et al. Noise?induced hearing loss: the effect of melanin in the stria vascularisJ. Hear Res, 2001,154(1-2),116.4Sendowski I, Abaamrane L, Raffin F, et al. Therapeutic efficacy of intra?cochlear administration of methylprednisolone

12、 after acoustic trauma caused by gunshot noise in guinea pigsJ. Hear Res, 2006, 221(1-2):119.2010年第27卷廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)5 Sendowski I, Raffin F, Braillon Cros A. Therapeutic efficacy of magnesium after acoustic trauma caused by gunshot noise in guinea pigsJ. Acta Otolaryngol, 2006, 126(2):122.6于萍,步宏,王華,等. 免疫

13、組化結(jié)果的圖像分析與人工計(jì)數(shù)方法的對(duì)比研究J. 生物醫(yī)學(xué)工程雜志, 2003,20(2):288.7 Cattell V. Nitric oxide and glomerulonephritisJ. Semin Nephrol, 1999, 19: 277.8 Huie R E, Padmaja S. The reaction of NO with superoxideJ. Free Rad Res Commun, 1993, 118: 195.9 Cayevieille C, Muller A, Meynier F, et al. Superoxide and nitric oxide cooperation in hypoxia/reoxygeneration induced neuron injuryJ. Free Rad Biol Med, 1993, 14: 389.10Soto E, Flores A, Erostegui C, et al. Evidence for NMDA receptor in the afferent synaptic transmission of the vestibular systemJ. Brain Res, 1994,