食管癌術(shù)前針刺誘導(dǎo)腦缺血耐受的研究

1、王晶余陳維袁佐鳴張春玲【摘要】目的探討針刺誘導(dǎo)缺血耐受的內(nèi)源性腦愛惜機制。方式應(yīng)用線栓法制做大鼠局灶腦缺血模型，選用百會穴進行針刺預(yù)處置。通過神經(jīng)學(xué)評分、腦梗死體積測定、病理學(xué)及微小管相關(guān)蛋白2(map2)免疫組化染色對缺血耐受模型進行評判。結(jié)果針刺預(yù)處置一、3、5d都可對后續(xù)的大腦中動脈閉塞(mcao)產(chǎn)生愛惜作用，神經(jīng)病學(xué)評分降低，腦梗死體積縮小，病理損傷減輕，以5d最為明顯。結(jié)論成功復(fù)制針刺?局灶性腦缺血耐受模型，針刺可誘導(dǎo)腦缺血耐受。【關(guān)鍵詞】針刺；預(yù)處置；腦缺血耐受臨床和實驗研究說明，針刺可增加腦血流量，改善腦組織氧合，提精湛氧化物歧化酶活性，抑制興奮性氨基酸，誘導(dǎo)愛惜性基因表達，調(diào)

2、劑神經(jīng)內(nèi)分泌，對缺血性腦損傷有顯著的醫(yī)治作用和愛惜效應(yīng)1。有研究說明針刺能夠產(chǎn)生有效缺血耐受，對缺血性腦卒中有愛惜作用2，但針刺產(chǎn)生缺血耐受的機制尚不完全清楚，對其相關(guān)研究甚少。1材料與方式實驗動物與分組健康雄性wistar大鼠，體重250300g,由吉林大學(xué)實驗動物中心提供。模型評判30只，隨機分為正常對照組、單純?nèi)毖?4h組及針刺一、3、5d預(yù)處置后大腦中動脈閉塞(mcao)24h組，每組6只。針刺預(yù)處理方法應(yīng)用dm?a定量針麻儀，參照實驗針灸學(xué)給予wistar大鼠頂骨正中百會穴電針刺激，采用頻率為416hz的間斷疏密波，電流強度1ma,每次30min,1次/d。動物模型制備采用longa

3、線栓法：大鼠用10%水合氯醛(ml/100g)腹腔注射麻醉后仰臥于手術(shù)臺上，頸部正中切口，暴露頸總動脈，逐步分離出頸外動脈、頸內(nèi)動脈及分叉部，結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)端，用動脈夾夾閉頸總動脈，在頸內(nèi)動脈下方穿一提拉線以阻斷血流，在結(jié)扎線近端距分叉5mm處剪一約mm小口，將魚線前端用砂紙磨成圓形并用肝素涂布后從頸外動脈殘端插入，經(jīng)頸總動脈分叉部進入頸內(nèi)動脈，向上深入至分叉以上。平均進線（22士）mm直至感覺有阻力時，即阻斷大腦中動脈入口處，結(jié)扎頸外動脈近端完成mcaob正常對照組僅暴露頸總動脈分叉處，不插線阻斷大腦中動脈。神經(jīng)病學(xué)評分麻醉蘇醒后，將動物放回鼠籠，自由飲食，分別于mcao后24h，由不了解分

4、組情況的觀察者評估并記錄神經(jīng)行為評分，參照bederson評分標(biāo)準(zhǔn)3，0級：未見行為缺陷；1級：前肢屈曲（即提尾懸空試驗陽性）；2級：側(cè)推抵抗力下降（即側(cè)向推力試驗陽性），伴前肢屈曲，無轉(zhuǎn)圈行為；3級：同2級行為，伴自發(fā)性旋轉(zhuǎn)。梗死體積判定經(jīng)灌注固定大鼠整個腦組織后，從后至前進行石蠟冠狀切片，片厚4（1管每隔2mm切取一張行he染色，根據(jù)reempts介紹的公式4，拍照并用圖像分析軟件計算出腦片上梗塞灶體積與大腦半球體積的百分比。病理標(biāo)本制備大鼠以10%水合氯醛麻醉，暴露心臟，以12號穿刺針刺入左心室，眼科剪刀剪開右心房，首先灌注溫%生理鹽水約200ml，待從右心房流出液體清亮?xí)r，換用含4%多

5、聚甲醛的mol/lpbs（）緩沖液200ml進行灌注固定，斷頭取腦。取以視交叉為中心，相當(dāng)于前聯(lián)合連續(xù)腦片，繼續(xù)固定46h，常規(guī)脫水，透明，浸蠟，包埋。微小管相關(guān)蛋白2（map2）檢測方法采用免疫組化法。一抗來源為美國santancren試劑公司，染色采用sp法。統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果以x±s表示，均數(shù)的顯著性采用t檢驗，所有統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用統(tǒng)計軟件。2結(jié)果神經(jīng)功能評分正常對照組神經(jīng)病學(xué)評分為0，針刺本身不引起神經(jīng)功能缺損，針刺1、3、5d預(yù)處理后mcao24h神經(jīng)功能評分為±、±、±，與單純mcao24h組±相比差異顯著，針刺5d最為明顯（pv）。梗死

6、體積測定單純mcao24h腦梗死體積比為（±）%，針刺1、3、5dmcao24h腦梗死體積比分別為（±）%、（±）%、（±）%，其中針刺5dmcao24h組梗死灶體積減少了%，較單純mcao24h組明顯降低（p。病理形態(tài)學(xué)變化正常對照組：神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)分布正常。單純mcao組：缺血24h,中心區(qū)淡染，腦組織稀疏明顯，神經(jīng)元脫失嚴(yán)重，細(xì)胞周圍大空泡變，神經(jīng)細(xì)胞變形，核固縮，核碎裂，核溶解，并失去完整結(jié)構(gòu)，并有大量細(xì)胞殘骸，周邊區(qū)范圍明顯縮小，可見膠質(zhì)細(xì)胞浸潤。針刺預(yù)處理1、3、5dmcao缺血周邊區(qū)范圍縮小，其中形態(tài)完整的神經(jīng)細(xì)胞增多，充血及腦水腫程度較單

7、純mcao組輕，以針刺預(yù)處理5d最為明顯。map2表達免疫組化結(jié)果顯示：正常對照組可見腦組織中神經(jīng)元及樹突均呈陽性表達，以樹突表達更為明顯，染色均勻，突起排列完整呈束狀。缺血24h,梗死中心區(qū)可見明顯map2表達淡染區(qū)，無完整樹突，樹突排列不齊，散在斷裂狀，周邊區(qū)表達明顯，與中心區(qū)分界清楚，可見正常神經(jīng)元與缺血改變神經(jīng)元以及形態(tài)排列正常樹突與增粗、部分?jǐn)嗔褬渫唤惶娲嬖凇?、3、5d針刺預(yù)處理中心區(qū)與mcao表現(xiàn)一致，但針刺預(yù)處理使梗死范圍明顯縮小，map2正常表達神經(jīng)元增多，缺血改變神經(jīng)元減少，也可見形態(tài)排列正常樹突與增粗、部分?jǐn)嗔褬渫唤惶娲嬖冢Ｋ婪秶?d針刺預(yù)處理最小。3討論預(yù)處理是指在

8、嚴(yán)重缺血之前給予的各種保護性干預(yù)措施，缺血耐受是指經(jīng)預(yù)處理的腦組織對隨后嚴(yán)重缺血的耐受性明顯提高的現(xiàn)象。自發(fā)現(xiàn)缺血耐受現(xiàn)象以來，對腦缺血防治的認(rèn)識開辟了新的領(lǐng)域，為腦保護提供了新的思路，并已進行了相關(guān)動物實驗和臨床研究，這種通過激發(fā)機體的內(nèi)源性保護機制，以增強對下一次嚴(yán)重?fù)p傷抵抗能力的研究受到廣泛關(guān)注。研究表明，針刺預(yù)處理可誘導(dǎo)缺血耐受，減輕大鼠腦缺血損傷，可能通過影響自由基、細(xì)胞凋亡等機制起腦保護作用59。為進一步探討針刺誘導(dǎo)腦缺血耐受，本實驗選擇針刺預(yù)處理1、3、5d后行mcao，從神經(jīng)學(xué)評分、梗死體積等方面對其進行評價，結(jié)果顯示，針刺預(yù)處理1、3、5d后行mcao,均不同程度提高神經(jīng)功能

9、、縮小梗死體積，其中5d針刺預(yù)處理后，梗死體積縮小達%與單純mcao相比差異顯著，he染色顯示病灶部位缺血程度、缺血范圍及腦水腫程度均較單純mcao組輕，提示成功制備針刺誘導(dǎo)腦缺血耐受模型，為進一步研究針刺誘導(dǎo)缺血耐受相關(guān)機制奠定了基礎(chǔ)。本實驗還利用map2免疫組化染色，對此模型進行了評價，進一步證實了針刺預(yù)處理產(chǎn)生了缺血耐受。正常腦組織中map2神經(jīng)元及樹突均呈陽性表達，以樹突表達更為明顯，染色均勻，突起排列完整呈束狀。微管是一種重要的細(xì)胞骨架蛋白，它對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的維持和線粒體的軸突轉(zhuǎn)運具有重要意義，但微管具有動力學(xué)不穩(wěn)定性，極易發(fā)生解聚。map2主要存在于神經(jīng)元樹突和胞體，作為微管的輔助蛋白

10、可促進微管組裝，穩(wěn)定微管的結(jié)構(gòu)，它的活性下降可造成微管變性堆積，影響細(xì)胞骨架的完整，并可使線粒體的軸突轉(zhuǎn)運發(fā)生障礙，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。map2對缺血很敏感，可顯示缺血時神經(jīng)元損傷，缺血性神經(jīng)元map2抗原性消失可作為缺血損傷的模型判定標(biāo)準(zhǔn)之一?！緟⒖嘉墨I】1 litscherg，schwarzg，sandnerka，jneurosci,1998;95(1?2):1?15.2 郭佳,張莉.腦缺血耐受與針灸的腦保護作用j.中國臨床康復(fù),2002；6(1):116?7.3 berders

11、onjb，pittslh，tsujim,etmiddlecerebralarteryocclusion:evaluationofthemodelanddevelopmentofneurologicalexaminationj.stroke，1986；17:472?6.4 reemptsjv，deurenbv，venmv,etreducescerebralinfarctsizeafterphotochemicallyinducedthrombosisinspontaneouslyhypertensiveratsj.stroke，1987；18:1113?9.5 張民，劉劍波，張宏亮，等.單次電針預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠局灶性腦缺血耐受時程j.中華麻醉學(xué)雜志，2003；23（5）:355?7.6 熊利澤，路志紅.重復(fù)電針預(yù)處理可減輕大鼠急性短暫性腦缺血損傷j.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2001；22（21）:5?6.7 田代實，鄧醫(yī)宇，王光海，等.針