細菌檢驗技術課件

1、微生物學微生物學(wi shn w xu)(wi shn w xu)檢驗檢驗第一頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第二頁，共六十八頁。第五章第五章 細菌檢驗細菌檢驗(jinyn)(jinyn)技術技術 第三頁，共六十八頁。細菌檢驗技術本本 章章 內(nèi)內(nèi) 容容第一節(jié)第一節(jié) 細菌形態(tài)檢驗技術細菌形態(tài)檢驗技術1第二節(jié)第二節(jié) 細菌接種與培養(yǎng)技術細菌接種與培養(yǎng)技術2第三節(jié)第三節(jié) 細菌生化鑒定技術細菌生化鑒定技術3第四節(jié)第四節(jié) 微生物檢驗的自動化與微型化微生物檢驗的自動化與微型化4第五節(jié)第五節(jié) 細菌的其他鑒定技術細菌的其他鑒定技術5第四頁，共六十八頁。細菌檢驗技術本章本章(bn zhn)(bn zhn)內(nèi)容內(nèi)容學

2、習目標學習目標： 掌握：掌握：革蘭染色的原理(yunl)、操作及結(jié)果判斷；細菌接種技 術、培養(yǎng)方法、細菌在不同培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象、生化反應的原理(yunl)。 熟悉：熟悉：細菌染色標本檢查的基本程序，細菌培養(yǎng)常用培養(yǎng)基和器材。 了解：了解：細菌不染色標本的檢查方法和用途；免疫學技術、分子生物學技術及自動化檢測技術等鑒定微生物。 本章重點本章重點：革蘭染色的原理、操作方法及意義 細菌培養(yǎng)及生長現(xiàn)象 細菌生化反應及臨床應用第五頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第一節(jié)第一節(jié) 細菌形態(tài)檢驗細菌形態(tài)檢驗(jinyn)(jinyn)技術技術一、染色一、染色(rns)(rns)標本鏡檢標本鏡檢 （一）染色標本檢查

3、的一般程序（一）染色標本檢查的一般程序第六頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第一節(jié)第一節(jié) 細菌形態(tài)細菌形態(tài)(xngti)(xngti)檢驗技術檢驗技術1.單染色法 細菌標本(biobn)經(jīng)涂片、干燥固定后，滴加染液染色1分鐘，水洗后待玻片燥后即可鏡檢（二）常用（二）常用(chn yn)的染色方法的染色方法第七頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第一節(jié)第一節(jié) 細菌細菌(xjn)(xjn)形態(tài)檢驗技術形態(tài)檢驗技術（二）常用（二）常用(chn yn)的染色方法的染色方法 2.革蘭染色法 【方法】 第八頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第一節(jié)第一節(jié) 細菌形態(tài)細菌形態(tài)(xngti)(xngti)檢驗技術檢驗技術（二）常用的

4、染色方法（二）常用的染色方法(fngf) 2.革蘭染色法【結(jié)果】紫色革蘭陽性菌（1000）紅色革蘭陰性菌（1000）第九頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第一節(jié)第一節(jié) 細菌形態(tài)檢驗細菌形態(tài)檢驗(jinyn)(jinyn)技術技術（二）常用的染色（二）常用的染色(rns)方法方法 3.抗酸染色法 【結(jié)果】 抗酸染色結(jié)果（1000）：紅色(hngs)為抗酸桿菌，藍色為非抗酸桿菌第十頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第一節(jié)第一節(jié) 細菌形態(tài)細菌形態(tài)(xngti)(xngti)檢驗技術檢驗技術（三）其他（三）其他(qt)染色法染色法 1.特殊結(jié)構染色法 （1）莢膜染色法莢膜染色(rns)結(jié)果，1000第十一頁，共六

5、十八頁。細菌檢驗技術第一節(jié)第一節(jié) 細菌細菌(xjn)(xjn)形態(tài)檢驗技術形態(tài)檢驗技術（三）其他（三）其他(qt)染色法染色法 1.特殊結(jié)構染色法 （2）鞭毛染色法鞭毛染色(rns)結(jié)果，1000第十二頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第一節(jié)第一節(jié) 細菌形態(tài)檢驗細菌形態(tài)檢驗(jinyn)(jinyn)技術技術（三）其他（三）其他(qt)染色法染色法 1.特殊結(jié)構染色法 （3）芽孢染色法芽孢染色(rns)結(jié)果，1000第十三頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第一節(jié)第一節(jié) 細菌形態(tài)細菌形態(tài)(xngti)(xngti)檢驗技術檢驗技術（三）其他染色法（三）其他染色法1.特殊結(jié)構(jigu)染色法 （4）異染顆粒

6、染色法 異染顆粒亞甲藍染色結(jié)果：白喉(bihu)棒狀桿菌，1000第十四頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第一節(jié)第一節(jié) 細菌細菌(xjn)(xjn)形態(tài)檢驗技術形態(tài)檢驗技術（三）其他（三）其他(qt)染色法染色法 2.負染色法 墨汁莢膜染色（腦脊液中的新型(xnxng)隱球菌，400）第十五頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第一節(jié)第一節(jié) 細菌形態(tài)檢驗細菌形態(tài)檢驗(jinyn)(jinyn)技術技術二、不染色二、不染色(rns)(rns)標本鏡檢標本鏡檢 1.壓滴法 壓滴法鏡檢結(jié)果(ji gu)：尿涂片，400第十六頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第一節(jié)第一節(jié) 細菌形態(tài)檢驗細菌形態(tài)檢驗(jinyn)(jinyn

7、)技術技術二、不染色二、不染色(rns)(rns)標本鏡檢標本鏡檢 2.懸滴法 第十七頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第一節(jié)第一節(jié) 細菌形態(tài)檢驗細菌形態(tài)檢驗(jinyn)(jinyn)技術技術二、不染色二、不染色(rns)(rns)標本鏡檢標本鏡檢 3.毛細管法 第十八頁，共六十八頁。細菌檢驗技術三、其他三、其他(qt)(qt)顯微鏡檢查顯微鏡檢查第一節(jié)第一節(jié) 細菌細菌(xjn)(xjn)形態(tài)檢驗技術形態(tài)檢驗技術第十九頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第二節(jié)第二節(jié) 細菌接種與培養(yǎng)細菌接種與培養(yǎng)(piyng)(piyng)技術技術一、基本一、基本(jbn)條件條件 接種接種(jizhng)環(huán)環(huán)培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿

8、紅外接種滅菌器紅外接種滅菌器第二十頁，共六十八頁。細菌檢驗技術培培 養(yǎng)養(yǎng) 箱箱生物生物(shngw)安全柜安全柜第二節(jié)第二節(jié) 細菌接種細菌接種(jizhng)(jizhng)與培養(yǎng)技術與培養(yǎng)技術一、基本一、基本(jbn)條條件件第二十一頁，共六十八頁。細菌檢驗技術 培養(yǎng)基成份培養(yǎng)基成份(chng fn)(chng fn)培養(yǎng)基：人工配制的適合細菌生長繁殖(fnzh)的綜合營養(yǎng)基質(zhì)。營養(yǎng)物質(zhì)：牛肉膏、蛋白胨、肉浸液、糖醇類、血液、雞蛋及動物血清、生長因子、無機鹽等水凝固劑：瓊脂、明膠抑制劑：孔雀綠、煌綠、膽鹽、抗生素等 指示劑：溴麝香草酚藍，溴甲酚紫、酚紅等 第二節(jié)第二節(jié) 細菌接種與培養(yǎng)細菌接種

9、與培養(yǎng)(piyng)(piyng)技術技術第二十二頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第二節(jié)第二節(jié) 細菌接種與培養(yǎng)細菌接種與培養(yǎng)(piyng)(piyng)技術技術基礎培養(yǎng)基：普通瓊脂平板營養(yǎng)培養(yǎng)基：滿足營養(yǎng)需求較高細菌的生長，如血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板等鑒別培養(yǎng)基：含有某些特定的底物，用于鑒別細菌，如克氏雙糖(shun tn)鐵培養(yǎng)基（KIA）及各種生化反應用培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基：具有選擇性抑制非目的菌生長作用，用于選擇性培養(yǎng)目的菌，如SS平板、中國藍瓊脂平板、伊紅美藍瓊脂平板等增菌培養(yǎng)基：用于含菌量較少的標本，如葡萄糖肉湯、GN增菌肉湯特殊培養(yǎng)基：厭氧培養(yǎng)基、L型細菌培養(yǎng)基培養(yǎng)基種類培養(yǎng)基種類(zh

10、ngli)（按用途分）（按用途分）第二十三頁，共六十八頁。細菌檢驗技術培養(yǎng)基培養(yǎng)基第二節(jié)第二節(jié) 細菌接種細菌接種(jizhng)(jizhng)與培養(yǎng)技術與培養(yǎng)技術第二十四頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第二節(jié)第二節(jié) 細菌接種細菌接種(jizhng)(jizhng)與培養(yǎng)技術與培養(yǎng)技術液體液體(yt)培養(yǎng)基培養(yǎng)基第二十五頁，共六十八頁。細菌檢驗技術培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基的種類(zhngli)(zhngli)（按物理性狀分類）（按物理性狀分類）液 體 培 養(yǎng) 基： 不 含 凝 固 劑 ， 用 于 增 菌 和 接 種 純 種 細 菌 。半 固 體 培 養(yǎng) 基 ： 含0 . 2 0 . 5 瓊 脂 ， 用

11、于 觀 察 細 菌 的 動 力 。固 體 培 養(yǎng) 基： 含2 3 瓊 脂 ， 用 于 細 菌 的 分 離( f n l )培 養(yǎng) 。第二節(jié)第二節(jié) 細菌接種與培養(yǎng)細菌接種與培養(yǎng)(piyng)(piyng)技術技術第二十六頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第二節(jié)第二節(jié) 細菌細菌(xjn)(xjn)接種與培養(yǎng)技術接種與培養(yǎng)技術培養(yǎng)基滅菌培養(yǎng)基滅菌(mi jn) 基礎基礎(jch)(jch)培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：121121高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌1515分鐘分鐘 含糖培養(yǎng)基：含糖培養(yǎng)基：113 113 滅菌滅菌1515分鐘分鐘 含雞蛋、血清培養(yǎng)基：間歇滅菌含雞蛋、血清培養(yǎng)基：間歇滅菌3 3天天3 3次次 不耐高

12、溫的液體成分：濾過除菌不耐高溫的液體成分：濾過除菌調(diào)配調(diào)配溶化溶化調(diào)調(diào)PhPh過濾澄清過濾澄清分裝分裝滅菌滅菌檢定檢定保存保存培養(yǎng)基制備程序培養(yǎng)基制備程序第二十七頁，共六十八頁。細菌檢驗技術 （一）無菌技術（一）無菌技術(jsh)(jsh)u 細菌檢驗的操作(cozu)應在無菌室或生物安全柜內(nèi)進行u 無菌室、生物安全柜使用前后均需進行消毒滅菌u 細菌檢驗使用過的物品使用前后需嚴格滅菌處理u 標本的采集嚴格無菌操作u 無菌試管、燒瓶的使用時注意管口滅菌第二節(jié)第二節(jié) 細菌細菌(xjn)(xjn)接種與培養(yǎng)技術接種與培養(yǎng)技術二、細菌接種與培養(yǎng)技術二、細菌接種與培養(yǎng)技術第二十八頁，共六十八頁。細菌檢驗

13、技術 （二）細菌接種（二）細菌接種(jizhng)與分離技術與分離技術第二節(jié)第二節(jié) 細菌接種細菌接種(jizhng)(jizhng)與培養(yǎng)技術與培養(yǎng)技術滅菌接種(jizhng)環(huán)（針）冷卻挑取標本（細菌）接種滅菌接種環(huán)（針）平板劃線法 分區(qū)劃線連續(xù)劃線 第二十九頁，共六十八頁。細菌檢驗技術分區(qū)分區(qū)(fn q)(fn q)劃線法劃線法第一第一(dy)區(qū)劃線區(qū)劃線滅菌滅菌(mi jn)接接種環(huán)種環(huán)第二區(qū)劃線第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)第二節(jié)第二節(jié) 細菌接種與培養(yǎng)技術細菌接種與培養(yǎng)技術第三十頁，共六十八頁。細菌檢驗技術連續(xù)連續(xù)(linx)(linx)劃線法劃

14、線法第二節(jié)第二節(jié) 細菌接種細菌接種(jizhng)(jizhng)與培養(yǎng)技術與培養(yǎng)技術第三十一頁，共六十八頁。細菌檢驗技術斜面(ximin)接種半固體(gt)穿刺接種液體(yt)接種第二節(jié)第二節(jié) 細菌接種與培養(yǎng)技術細菌接種與培養(yǎng)技術第三十二頁，共六十八頁。細菌檢驗技術（三）細菌培養(yǎng)（三）細菌培養(yǎng)(piyng)(piyng)方法方法一般培養(yǎng)（需氧培養(yǎng)）：培養(yǎng)需氧或兼性厭氧菌培養(yǎng)溫度：35 37 培養(yǎng)時間：1824小時二氧化碳培養(yǎng)法：燭缸法、二氧化碳(r yng hu tn)培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)法：厭氧培養(yǎng)箱、厭氧袋、厭氧罐、皰肉培養(yǎng)法、硫乙醇酸鹽法等培養(yǎng)厭氧菌第二節(jié)第二節(jié) 細菌接種與培養(yǎng)細菌接種與培養(yǎng)

15、(piyng)(piyng)技術技術第三十三頁，共六十八頁。細菌檢驗技術三、細菌(xjn)的生長現(xiàn)象第二節(jié)第二節(jié) 細菌接種細菌接種(jizhng)(jizhng)與培養(yǎng)技術與培養(yǎng)技術菌落(jnlu)與菌苔血平板上溶血現(xiàn)象第三十四頁，共六十八頁。細菌檢驗技術細菌在液體(yt)培養(yǎng)基中生長現(xiàn)象第二節(jié)第二節(jié) 細菌細菌(xjn)(xjn)接種與培養(yǎng)技術接種與培養(yǎng)技術菌膜對照沉淀渾濁沿穿剌線擴散沿穿剌線擴散(kusn)生長生長在穿剌線上生長在穿剌線上生長細菌在半固體培養(yǎng)基中的現(xiàn)象第三十五頁，共六十八頁。細菌檢驗技術一、碳水化合物的代謝一、碳水化合物的代謝(dixi)試驗試驗第三節(jié)第三節(jié) 細菌細菌(xjn

16、)(xjn)生化鑒定技術生化鑒定技術原理：多糖原理：多糖單糖單糖(dn tn)(dn tn)丙酮酸丙酮酸酸性產(chǎn)物酸性產(chǎn)物( (或產(chǎn)氣或產(chǎn)氣) )pH pH 呈酸性變色呈酸性變色( (或出現(xiàn)氣泡或出現(xiàn)氣泡) )方法：方法： 將待檢細菌以無菌操作接種到糖發(fā)酵管將待檢細菌以無菌操作接種到糖發(fā)酵管中，置中，置3535溫箱培養(yǎng)溫箱培養(yǎng)181824h24h，觀察結(jié)果。，觀察結(jié)果。1 1、糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗、糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗結(jié) 果第三十六頁，共六十八頁。細菌檢驗技術一、碳水化合物的代謝一、碳水化合物的代謝(dixi)試試驗驗第三節(jié)第三節(jié) 細菌生化細菌生化(shn hu)(shn hu)鑒定技術鑒定

17、技術原理：根據(jù)細菌在分解葡萄糖的代謝過程中對原理：根據(jù)細菌在分解葡萄糖的代謝過程中對氧分子需求氧分子需求(xqi)(xqi)的不同，將細菌分為氧化、的不同，將細菌分為氧化、發(fā)酵和產(chǎn)堿型三類發(fā)酵和產(chǎn)堿型三類 2 2、 O/FO/F試驗試驗結(jié) 果方法：取方法：取2 2支支HLHL葡萄糖培養(yǎng)管煮葡萄糖培養(yǎng)管煮沸驅(qū)氧，冷卻后接種細菌。將其中沸驅(qū)氧，冷卻后接種細菌。將其中一管敞開，另一管用液體石蠟封管，一管敞開，另一管用液體石蠟封管，培養(yǎng)培養(yǎng)18 18 24h24h觀察結(jié)果觀察結(jié)果第三十七頁，共六十八頁。細菌檢驗技術 3 3、甲基紅試驗、甲基紅試驗(shyn)(shyn)第三節(jié)第三節(jié) 細菌細菌(xjn)

18、(xjn)生化鑒定技術生化鑒定技術原理：細菌發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)生丙酮原理：細菌發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)生丙酮酸，進一步分解生成大量混合酸，酸，進一步分解生成大量混合酸，使培養(yǎng)使培養(yǎng)pHpH下降至下降至4.44.4以下，加入甲基紅以下，加入甲基紅后，呈現(xiàn)后，呈現(xiàn)(chngxin)(chngxin)紅色反應。為甲基紅紅色反應。為甲基紅試驗陽性。試驗陽性。方法：將待檢菌種接種于葡萄糖蛋白方法：將待檢菌種接種于葡萄糖蛋白胨水中胨水中,35,35培養(yǎng)培養(yǎng)18241824小時后小時后, ,往培養(yǎng)基往培養(yǎng)基中加入甲基紅指示劑少許中加入甲基紅指示劑少許, ,觀察結(jié)果。觀察結(jié)果。結(jié)結(jié) 果果第三十八頁，共六十八頁。細菌檢驗技術

19、 4 4、V-PV-P試驗試驗(shyn)(shyn)第三節(jié)第三節(jié) 細菌生化鑒定細菌生化鑒定(jindng)(jindng)技術技術原理：細菌分解葡萄糖原理：細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫羧生成乙酰甲基甲醇羧生成乙酰甲基甲醇(ji (ji chn)chn)，在堿性環(huán)境中，在堿性環(huán)境中，乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇(ji chn)(ji chn)被被氧化為二乙酰，二乙酰氧化為二乙酰，二乙酰與胍基化合物結(jié)合，生與胍基化合物結(jié)合，生成紅色化合物，是為成紅色化合物，是為V-V-P P試驗陽性。試驗陽性。方法：把待檢細菌接種在葡萄糖蛋白胨方法：把待檢細菌接種在葡萄糖蛋白胨水中，水中，

20、3535培養(yǎng)培養(yǎng)1824h1824h后，按每毫升培養(yǎng)后，按每毫升培養(yǎng)液加入液加入0.1ml0.1ml含含2 2肌酸或肌酐的肌酸或肌酐的4040KOHKOH溶溶液液, ,數(shù)分鐘或數(shù)小時后觀察結(jié)果。數(shù)分鐘或數(shù)小時后觀察結(jié)果。結(jié)結(jié) 果果空白對照空白對照 陰性陰性 陽性陽性第三十九頁，共六十八頁。細菌檢驗技術 5 5、 -半乳糖苷酶試驗半乳糖苷酶試驗(shyn)(shyn)（ONPGONPG）第三節(jié)第三節(jié) 細菌生化細菌生化(shn hu)(shn hu)鑒定技術鑒定技術原理：有的細菌可原理：有的細菌可產(chǎn)生產(chǎn)生-半乳糖苷酶，半乳糖苷酶，能分解能分解(fnji)(fnji)鄰硝鄰硝基酚基酚-D-D半乳糖苷

21、半乳糖苷(ONPG)(ONPG)而生成黃色而生成黃色的鄰硝基苯酚，該試的鄰硝基苯酚，該試驗也稱為驗也稱為ONPGONPG試驗試驗。 方法：將被檢制成菌懸液，加入方法：將被檢制成菌懸液，加入1 1滴甲苯充滴甲苯充分振搖，分振搖，3737水浴水浴5 5 分鐘，使酶釋放，然后再分鐘，使酶釋放，然后再加入加入0.25ml ONPG0.25ml ONPG，混勻后，置于，混勻后，置于3737水浴水浴中溫育，菌懸液呈黃色為陽性反應。中溫育，菌懸液呈黃色為陽性反應。 結(jié)結(jié) 果果陰性陰性 陽性陽性第四十頁，共六十八頁。細菌檢驗技術 6 6、七葉七葉(q y)(q y)苷水解試驗苷水解試驗 第三節(jié)第三節(jié) 細菌生化

22、鑒定細菌生化鑒定(jindng)(jindng)技術技術原理：原理：某些細菌能分解七葉苷產(chǎn)生某些細菌能分解七葉苷產(chǎn)生(chnshng)(chnshng)葡萄糖與七葉素，七葉素與培養(yǎng)葡萄糖與七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中的基中的Fe2+Fe2+結(jié)合后，形成黑色的化合物，使培結(jié)合后，形成黑色的化合物，使培養(yǎng)基變黑。養(yǎng)基變黑。 方法：將待檢細菌接方法：將待檢細菌接種到七葉苷培養(yǎng)基上，種到七葉苷培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察結(jié)果，培培養(yǎng)后觀察結(jié)果，培養(yǎng)基變黑色者為陽性，養(yǎng)基變黑色者為陽性，培養(yǎng)基不變色為陰性。培養(yǎng)基不變色為陰性。 結(jié)結(jié) 果果+-第四十一頁，共六十八頁。細菌檢驗技術 二、二、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝蛋白質(zhì)和

23、氨基酸的代謝(dixi)第三節(jié)第三節(jié) 細菌生化鑒定細菌生化鑒定(jindng)(jindng)技術技術原理：細菌產(chǎn)生色氨酸酶，分解培養(yǎng)基中原理：細菌產(chǎn)生色氨酸酶，分解培養(yǎng)基中色氨酸，生成靛基質(zhì)（吲哚），靛基質(zhì)與色氨酸，生成靛基質(zhì)（吲哚），靛基質(zhì)與對二甲基氨基苯甲醛作用對二甲基氨基苯甲醛作用(zuyng)(zuyng)，生成，生成玫瑰靛基質(zhì)，玫瑰靛基質(zhì)， 是為靛基質(zhì)試驗陽性。是為靛基質(zhì)試驗陽性。方法：將待檢菌接種于蛋白胨水中，方法：將待檢菌接種于蛋白胨水中，3535培養(yǎng)培養(yǎng)181824h24h，取出后沿試管壁加，取出后沿試管壁加入靛基質(zhì)試劑數(shù)滴，在兩液面觀察結(jié)果。入靛基質(zhì)試劑數(shù)滴，在兩液面觀察結(jié)

24、果。結(jié)結(jié) 果果1、靛基質(zhì)（吲哚）試驗靛基質(zhì)（吲哚）試驗第四十二頁，共六十八頁。細菌檢驗技術 二、二、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝(dixi)第三節(jié)第三節(jié) 細菌細菌(xjn)(xjn)生化鑒定技術生化鑒定技術原理原理(yunl)(yunl)：細菌產(chǎn)生酶，分解含硫氨細菌產(chǎn)生酶，分解含硫氨基酸生成硫化氫，硫化氫與培養(yǎng)基中的亞鐵基酸生成硫化氫，硫化氫與培養(yǎng)基中的亞鐵鹽或鉛鹽結(jié)合生成黑色化合物。鹽或鉛鹽結(jié)合生成黑色化合物。方法：方法：將細菌穿刺接種到醋將細菌穿刺接種到醋酸鉛培養(yǎng)基中，酸鉛培養(yǎng)基中， 3535、181824h24h，觀察結(jié)果。，觀察結(jié)果。結(jié)果：結(jié)果：黑色黑色管為陽性管為陽性2、

25、硫化氫試驗、硫化氫試驗第四十三頁，共六十八頁。細菌檢驗技術 二、二、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝(dixi)第三節(jié)第三節(jié) 細菌生化細菌生化(shn hu)(shn hu)鑒定技術鑒定技術原理：原理：細菌細菌(xjn)產(chǎn)生產(chǎn)生脲酶，水解尿素生成氨脲酶，水解尿素生成氨和二氧化碳，培養(yǎng)基呈和二氧化碳，培養(yǎng)基呈堿性反應堿性反應方法：將待檢菌接方法：將待檢菌接種于尿素培養(yǎng)基中，種于尿素培養(yǎng)基中，3535培養(yǎng)培養(yǎng)181824h24h取取出觀察。出觀察。結(jié)結(jié) 果果3、尿素酶試驗尿素酶試驗 - +第四十四頁，共六十八頁。細菌檢驗技術 二、二、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝(dixi)第三

26、節(jié)第三節(jié) 細菌生化細菌生化(shn hu)(shn hu)鑒定技術鑒定技術原理：原理：細菌產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使細菌產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫氨形成苯丙氨酸脫氨形成(xngchng)苯丙酮苯丙酮酸，苯丙酮酸與三氯化鐵作用，形成酸，苯丙酮酸與三氯化鐵作用，形成(xngchng)綠色化合物綠色化合物方法：將待檢菌接種于苯丙氨酸方法：將待檢菌接種于苯丙氨酸微量培養(yǎng)管中（接種量稍大），微量培養(yǎng)管中（接種量稍大），培養(yǎng)后在培養(yǎng)基上直接滴加培養(yǎng)后在培養(yǎng)基上直接滴加1010氯化鐵試劑，出現(xiàn)綠色反應者為陽氯化鐵試劑，出現(xiàn)綠色反應者為陽性。性。 結(jié)結(jié) 果果4、苯丙氨酸脫氨酶試驗苯丙氨酸脫氨酶試驗 - +第

27、四十五頁，共六十八頁。細菌檢驗技術 三、碳源利用三、碳源利用(lyng)(lyng)試驗試驗 第三節(jié)第三節(jié) 細菌生化細菌生化(shn hu)(shn hu)鑒定技術鑒定技術原理：原理：有的細菌能利用培養(yǎng)基中的枸櫞有的細菌能利用培養(yǎng)基中的枸櫞酸鹽作為唯一酸鹽作為唯一(wi y)的碳源，細菌在生的碳源，細菌在生長過程中分解枸櫞酸鹽產(chǎn)生碳酸鹽，使長過程中分解枸櫞酸鹽產(chǎn)生碳酸鹽，使培養(yǎng)基呈堿性反應培養(yǎng)基呈堿性反應方法：將待檢菌接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)方法：將待檢菌接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察結(jié)果。培養(yǎng)基由淡基上，培養(yǎng)后觀察結(jié)果。培養(yǎng)基由淡綠色變?yōu)樯钏{色者為陽性，培養(yǎng)基中綠色變?yōu)樯钏{色者為陽性，培養(yǎng)基中

28、無菌生長、仍為綠色者為陰性。無菌生長、仍為綠色者為陰性。結(jié)結(jié) 果果枸櫞酸鹽利用試驗枸櫞酸鹽利用試驗 + -第四十六頁，共六十八頁。細菌檢驗技術 四、酶類試驗四、酶類試驗(shyn)(shyn) 第三節(jié)第三節(jié) 細菌生化細菌生化(shn hu)(shn hu)鑒定技術鑒定技術原理：原理：某些某些(mu xi)(mu xi)細菌具有氧化酶細菌具有氧化酶（細胞色素氧化酶），能將二甲基（細胞色素氧化酶），能將二甲基對苯二胺或四甲基對苯二胺氧化生對苯二胺或四甲基對苯二胺氧化生成紅色的醌類化合物。成紅色的醌類化合物。 方法：方法：取潔凈濾紙條，粘取被檢取潔凈濾紙條，粘取被檢細菌菌落，滴加氧化酶試劑細菌菌落，

29、滴加氧化酶試劑1 1滴于滴于菌落上?；?qū)⒃噭┲苯拥渭釉诒粰z細菌菌落上?；?qū)⒃噭┲苯拥渭釉诒粰z細菌的菌落上。陽性者立即出現(xiàn)紅色，繼而的菌落上。陽性者立即出現(xiàn)紅色，繼而變?yōu)樯罴t色至深紫色。變?yōu)樯罴t色至深紫色。 結(jié)結(jié) 果果1、氧化酶（細胞色素氧化酶）試驗氧化酶（細胞色素氧化酶）試驗第四十七頁，共六十八頁。細菌檢驗技術 四、酶類試驗四、酶類試驗(shyn)(shyn) 第三節(jié)第三節(jié) 細菌生化鑒定細菌生化鑒定(jindng)(jindng)技術技術原理：細菌產(chǎn)生的觸酶（過氧化氫原理：細菌產(chǎn)生的觸酶（過氧化氫酶）能催化過氧化氫放出酶）能催化過氧化氫放出(fn ch)(fn ch)初生態(tài)氧，繼而形成氧分子出

30、現(xiàn)氣初生態(tài)氧，繼而形成氧分子出現(xiàn)氣泡。泡。 方法：方法： 取待檢細菌少許，置于取待檢細菌少許，置于潔凈的載玻片上，滴加潔凈的載玻片上，滴加3 3H2O2H2O2試劑試劑1 12 2滴，觀察結(jié)滴，觀察結(jié)果。一分鐘內(nèi)產(chǎn)生大量氣果。一分鐘內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡者為陽性，不產(chǎn)生氣泡泡者為陽性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性。者為陰性。 結(jié)結(jié) 果果2、觸酶試驗觸酶試驗 + -第四十八頁，共六十八頁。細菌檢驗技術 四、酶類試驗四、酶類試驗(shyn)(shyn) 第三節(jié)第三節(jié) 細菌生化鑒定細菌生化鑒定(jindng)(jindng)技術技術原理：原理：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生凝固金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生凝固酶，使血漿中的纖維蛋白酶，

31、使血漿中的纖維蛋白(xin wi (xin wi dn bi)dn bi)原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘睦w維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘睦w維蛋白(xin wi dn bi)(xin wi dn bi)。 方法：于方法：于3 3支試管中分別加入支試管中分別加入1:41:4稀釋的血漿稀釋的血漿0.5ml0.5ml，1 1支管加入待支管加入待檢菌肉湯培養(yǎng)物檢菌肉湯培養(yǎng)物0.5ml,0.5ml,另兩支分別另兩支分別加陰陽性對照菌肉湯培養(yǎng)物加陰陽性對照菌肉湯培養(yǎng)物0.5ml0.5ml，3535培養(yǎng)培養(yǎng)3 34h4h后觀察結(jié)果。后觀察結(jié)果。結(jié)結(jié) 果果3、凝固酶試驗（試管法）凝固酶試驗（試管法） 第四十九頁，共六十八頁。細菌檢驗

32、技術 四、酶類試驗四、酶類試驗(shyn)(shyn) 第三節(jié)第三節(jié) 細菌生化鑒定細菌生化鑒定(jindng)(jindng)技術技術原理：原理：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生凝固金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生凝固(nngg)酶，使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)酶，使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘睦w維蛋白變?yōu)椴蝗苄缘睦w維蛋白。 方法：取未稀釋的兔血漿方法：取未稀釋的兔血漿和生理鹽水各一滴分別置和生理鹽水各一滴分別置于載玻片的兩側(cè)，挑取金于載玻片的兩側(cè)，挑取金黃色葡萄球菌少許分別與黃色葡萄球菌少許分別與它們混合，立即觀察結(jié)果。它們混合，立即觀察結(jié)果。細菌在生理鹽水中無自凝，細菌在生理鹽水中無自凝，菌液呈均勻混濁狀態(tài)凝固菌液

33、呈均勻混濁狀態(tài)凝固酶試驗為陰性；菌液聚集酶試驗為陰性；菌液聚集成團塊或顆粒狀，則血漿成團塊或顆粒狀，則血漿凝固酶試驗為陽性。凝固酶試驗為陽性。 結(jié)結(jié) 果果4、凝固酶試驗（玻片法）凝固酶試驗（玻片法） 第五十頁，共六十八頁。細菌檢驗技術 四、酶類試驗四、酶類試驗(shyn)(shyn) 第三節(jié)第三節(jié) 細菌細菌(xjn)(xjn)生化鑒定技術生化鑒定技術原理：某些細菌能還原培原理：某些細菌能還原培養(yǎng)基中的硝酸鹽為亞硝酸養(yǎng)基中的硝酸鹽為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與醋酸鹽，亞硝酸鹽與醋酸(c sun)(c sun)作用，生成亞硝酸，亞硝作用，生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的對氨基苯磺酸與試劑中的對氨基苯磺酸作用生

34、成重氮磺酸，再酸作用生成重氮磺酸，再與與- -萘胺結(jié)合，生成萘胺結(jié)合，生成N-N-萘胺萘胺偶氮苯磺酸偶氮苯磺酸( (紅色化合物紅色化合物) )。 方法：方法：將被檢細菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，將被檢細菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，3535培養(yǎng)培養(yǎng)18182424小時，加入甲液（對氨基苯磺小時，加入甲液（對氨基苯磺酸酸0.8g0.8g、5mol5molL L醋酸醋酸100ml100ml）和乙液（）和乙液（- -萘胺萘胺0.5g0.5g、5mol5molL L、醋酸、醋酸100ml100ml）等量混合液，觀察）等量混合液，觀察結(jié)果。立即出現(xiàn)紅色者為陽性。若加入試劑不出現(xiàn)結(jié)果。立即出現(xiàn)紅色者為陽性。若加入試

35、劑不出現(xiàn)紅色，需要檢查硝酸鹽是否被還原，可于培養(yǎng)管內(nèi)紅色，需要檢查硝酸鹽是否被還原，可于培養(yǎng)管內(nèi)加入少許鋅粉，如無色，說明亞硝酸鹽進一步分解，加入少許鋅粉，如無色，說明亞硝酸鹽進一步分解，硝酸鹽還原試驗為陽性。若加鋅粉后出現(xiàn)紅色，說硝酸鹽還原試驗為陽性。若加鋅粉后出現(xiàn)紅色，說明鋅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，而待檢細菌無還原明鋅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，而待檢細菌無還原硝酸鹽的能力，硝酸鹽還原試驗為陰性。硝酸鹽的能力，硝酸鹽還原試驗為陰性。5、硝酸鹽還原試驗硝酸鹽還原試驗 第五十一頁，共六十八頁。細菌檢驗技術 紅色紅色(hngs)為陽性為陽性無色為陰性無色為陰性 四、酶類試驗四、酶類試驗(shyn)(

36、shyn) 第三節(jié)第三節(jié) 細菌生化細菌生化(shn hu)(shn hu)鑒定技術鑒定技術5、硝酸鹽還原試驗硝酸鹽還原試驗 -+無色無色+ +鋅粉鋅粉無色：陽性無色：陽性無色無色+ +鋅粉鋅粉紅色：陰性紅色：陰性+-結(jié)結(jié) 果果第五十二頁，共六十八頁。細菌檢驗技術 四、酶類試驗四、酶類試驗(shyn)(shyn) 第三節(jié)第三節(jié) 細菌細菌(xjn)(xjn)生化鑒定技術生化鑒定技術原理原理(yunl)(yunl)： B B群鏈球菌能產(chǎn)生群鏈球菌能產(chǎn)生CAMPCAMP因子，可促進金黃色葡萄球菌因子，可促進金黃色葡萄球菌 溶溶血素活性。其他鏈球菌不產(chǎn)生血素活性。其他鏈球菌不產(chǎn)生CAMPCAMP因子。因

37、子。方法：用產(chǎn)生方法：用產(chǎn)生-溶血素的金黃色溶血素的金黃色葡萄球菌在血平板上劃種一條直葡萄球菌在血平板上劃種一條直線，將待檢菌距金黃色葡萄球菌線，將待檢菌距金黃色葡萄球菌3mm3mm處垂直劃種一短線。用同樣處垂直劃種一短線。用同樣方法接種陰性和陽性對照菌株。方法接種陰性和陽性對照菌株。3535孵育孵育181824h24h。結(jié)結(jié) 果果6 6、CAMPCAMP試驗試驗對照陰性陽性檢測菌陽性陽性矢狀溶血第五十三頁，共六十八頁。細菌檢驗技術 五、復合生化五、復合生化(shn hu)(shn hu)反應反應 第三節(jié)第三節(jié) 細菌生化細菌生化(shn hu)(shn hu)鑒定技術鑒定技術 原理：原理：KI

38、A瓊脂中含有牛肉(ni ru)膏、酵母浸膏、蛋白胨、乳糖、葡萄糖、枸櫞酸銨鐵、酚紅指示劑等。乳糖的濃度為葡萄糖的10倍，若細菌只分解葡萄糖而不分解乳糖，培養(yǎng)基中的葡萄糖被分解后只能產(chǎn)生少量的酸，在最初培養(yǎng)的811小時內(nèi)，這些酸也足以使培養(yǎng)基的底層和斜面變黃色。但連續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時后，在細菌和氧的作用下，培養(yǎng)基的斜面所含氨基酸發(fā)生降解，釋放氨類，立即中和斜面部分的酸，培養(yǎng)1824小時后，整個斜面轉(zhuǎn)變成堿性，斜面又變成紅色。培養(yǎng)基深層中，氨基酸的降解作用不足以中和所形成的酸，故仍呈黃色。因此KIA斜面呈堿性，深層呈酸性反應，說明該菌只分解葡萄糖而不分解乳糖。若細菌分解乳糖則產(chǎn)生大量的酸，這些酸能中和斜

39、面產(chǎn)生的堿，使整個培養(yǎng)基呈黃色。若細菌能分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸，則可產(chǎn)生H2S，H2S與培養(yǎng)基中枸櫞酸銨鐵起反應，產(chǎn)生不溶性的黑色硫化亞鐵沉淀。 KIAKIA試驗試驗第五十四頁，共六十八頁。細菌檢驗技術 六、復合生化六、復合生化(shn hu)(shn hu)反應反應 第三節(jié)第三節(jié) 細菌生化細菌生化(shn hu)(shn hu)鑒定技術鑒定技術 方法：方法： 用接種針挑取待檢細菌(xjn)，先穿刺接種到KIA深層，距管底35mm為宜，再從深層向上提起，在斜面上由下至上劃線，35培養(yǎng)1824小時，觀察結(jié)果 KIAKIA試驗試驗 常見的反應結(jié)果：斜面堿性/底層堿性：不發(fā)酵糖類，如糞產(chǎn)堿桿菌。斜面

40、堿性/底層酸性：葡萄糖發(fā)酵，乳糖不發(fā)酵，如志賀菌。斜面堿性/底層酸性（黑色）：葡萄糖發(fā)酵、乳糖不發(fā)酵，產(chǎn)生H2S。如沙門菌、普通變形桿菌。斜面酸性/底層酸性：葡萄糖和乳糖發(fā)酵，如大腸埃希菌、克雷伯菌屬、腸桿菌屬。 第五十五頁，共六十八頁。細菌檢驗技術 六、復合六、復合(fh)(fh)生化反應生化反應 第三節(jié)第三節(jié) 細菌細菌(xjn)(xjn)生化鑒定技術生化鑒定技術 KIAKIA試驗試驗(shyn)(shyn)結(jié)果結(jié)果第五十六頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第四節(jié)第四節(jié) 微生物檢驗微生物檢驗(jinyn)(jinyn)的自動化和微型化的自動化和微型化一、一、 微生物自動微生物自動(zdng)(zd

41、ng)培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)（一）自動血培養(yǎng)檢測系統(tǒng)1.基本原理（1）放射性物質(zhì)標記法 一般采用放射性碳14標記法：細菌生長時利用標記底物產(chǎn)生含14C的CO2，當14C標記的CO2量超過界限時，檢測器報告陽性生長。（2）二氧化碳感受器 每一血液培養(yǎng)瓶底部都含有Novel顏色感應器，當血液培養(yǎng)瓶內(nèi)有微生物生長釋出之CO2后，感應器之酸堿值也跟著改變，從深綠色變?yōu)辄S色，檢測器報告陽性。（3）均質(zhì)熒光技術 在血培養(yǎng)基內(nèi)含有發(fā)熒光物質(zhì)。微生物生長代謝過程中產(chǎn)生各種帶電荷的原子團，培養(yǎng)瓶發(fā)出的熒光，即可檢測有細菌存在。第五十七頁，共六十八頁。細菌檢驗技術2儀器的基本結(jié)構和配套試劑 全自動恒溫孵育系統(tǒng)包括恒溫裝

42、置和震蕩培養(yǎng)裝置，儀器培養(yǎng)瓶容量常分為60瓶、120瓶、240瓶等，對培養(yǎng)瓶進行(jnxng)震蕩恒溫培養(yǎng)，溫度常設為37。儀器均配置電腦，在電腦上可設置培養(yǎng)時間、溫度等參數(shù)，顯示陽性或陰性瓶所在的位置，及自動分析。3注意事項及結(jié)果報告制度（1）培養(yǎng)瓶的選擇 如果患者未使用抗生素，可選擇一般需氧菌培養(yǎng)瓶，如果已經(jīng)使用抗生素則選用可中和血液中抗生素的培養(yǎng)瓶。如懷疑厭氧菌、L型菌、真菌、分枝桿感染，則選用厭氧菌培養(yǎng)瓶、L型菌培養(yǎng)瓶、真菌培養(yǎng)瓶、分枝桿菌培養(yǎng)瓶。（2）采血時間 對入院患者中有高熱、寒戰(zhàn)、白細胞增多或疑有感染者，最好在使用抗生素前采血送檢。住院患者出現(xiàn)發(fā)熱等敗血癥癥狀時，應及時采血，盡

43、可能在使用抗生素前采血。已使用抗生素的患者最好在下次使用抗生素前采血。第四節(jié)第四節(jié) 微生物檢驗微生物檢驗(jinyn)(jinyn)的自動化和微型化的自動化和微型化第五十八頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第四節(jié)第四節(jié) 微生物檢驗微生物檢驗(jinyn)(jinyn)的自動化和微型化的自動化和微型化（3）采血量 采血量一般為血培養(yǎng)瓶中肉湯培養(yǎng)基量的1/4-1/5為宜，成人一般每次采集3-10ml，以8-10ml最佳，小兒一般每次采集1-3ml即可。每天最好采血2-3次，以提高檢出率，并幫助判斷是感染菌或污染菌。（4）采血方法 一般多從肘靜脈采血，采集前應嚴格消毒采血部位，采血過程中注意無菌操作，否則

44、易被皮膚表面細菌污染，導致假陽性。使用真空采血系統(tǒng)，利用配套的一次性使用的無菌采血管，血液因負壓作用進入培養(yǎng)瓶中。（5）標本送檢 采血后應及時送檢，檢驗(jinyn)者收到血培養(yǎng)瓶后應盡快上機。如不能及時送檢，應將血培養(yǎng)瓶放置室溫保存。第五十九頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第四節(jié)第四節(jié) 微生物檢驗微生物檢驗(jinyn)(jinyn)的自動化和微型化的自動化和微型化（二）自動分枝桿菌培養(yǎng)檢測系統(tǒng) 多數(shù)自動血培養(yǎng)檢測系統(tǒng)可檢測血液中的分枝桿菌，目前針對分枝桿菌有專門的自動分枝桿菌培養(yǎng)檢測系統(tǒng)，可對各類標本中的分枝桿菌進行培養(yǎng)及檢測，原理基本同自動血培養(yǎng)檢測系統(tǒng)，配套專門的培養(yǎng)瓶。 一般將各類標本直

45、接送檢，檢驗者收到標本后，如為清亮的穿刺液標本，可直接注入(zh r)培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入儀器自動培養(yǎng)并檢測。如為痰液等其他含有雜菌或細胞的標本，應先進行消化、中和等處理后再注入(zh r)培養(yǎng)瓶，否則會導致假陽性結(jié)果。第六十頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第四節(jié)第四節(jié) 微生物檢驗微生物檢驗(jinyn)(jinyn)的自動化和微型化的自動化和微型化二、微生物鑒定的自動化和微型化（一）微生物數(shù)碼分類原理1數(shù)據(jù)庫 由許多細菌條目組成，每個條目代表(dibio)一個細菌種或一個細菌生物型。 2編碼 將細菌生化反應模式轉(zhuǎn)換成 數(shù)學模式，可把生化反應結(jié)果快速轉(zhuǎn)錄成數(shù)字（編碼），經(jīng)查閱編碼檢索本或電腦分析系統(tǒng)又可

46、將數(shù)字轉(zhuǎn)化成相應的細菌名稱。3查碼 在編碼檢索本內(nèi)尋找數(shù)碼信息：如菌名，鑒定結(jié)果的評價，生 化結(jié)果，陽性百分率，必須增加的補充試驗項目，指出注意要點等。第六十一頁，共六十八頁。細菌檢驗技術4 4解釋解釋(jish)(jish) 如果一個編碼只對應一種細菌，無論幾率大小，為該種細菌的可能性( ID %) 均為99. 99 %。如果一個編碼對應兩種或兩種以上種類的細菌，應計算每種細菌出現(xiàn)的幾率所占的百分比ID % 。如ID % 99 %，為該種菌的可能性非常大；如ID % 90 %，為該種菌的可能性較大；如ID %80 %，為該種菌的可能性也較大，但需做補充試驗進一步確證；如ID %80 %，則一般無法準確區(qū)分菌種，必須增加多個補充試驗才可得出準確結(jié)果。第四節(jié)第四節(jié) 微生物檢驗微生物檢驗(jinyn)(jinyn)的自動化和微型化的自動化和微型化第六十二頁，共六十八頁。細菌檢驗技術第四節(jié)第四節(jié) 微生物檢驗微生物檢驗(jinyn)(jinyn)的自動化和微型化的自動化和微型化（二）微生物自動鑒定儀器二）微生物自動鑒定儀器(yq)(yq)的基本結(jié)構和配套試劑的基本結(jié)構和配套試劑數(shù)碼分類鑒定系統(tǒng)的組成(z chn) 由鑒定卡、 添加試劑及檢索工具配套形成的完整 的微生物鑒定體系。（1）鑒定卡常用的生化反應有： 發(fā)酵試驗；同化試驗；同化或發(fā)酵