DNA復(fù)制的起始和終止

1、 第二章第二章 DNA復(fù)制復(fù)制 (DNA Replication) 第一節(jié)第一節(jié) 基本概念基本概念第二節(jié)第二節(jié) 復(fù)制概況復(fù)制概況第三節(jié)第三節(jié) DNA復(fù)制的酶學(xué)復(fù)制的酶學(xué) 第四節(jié)第四節(jié) DNA復(fù)制的半不連續(xù)性復(fù)制的半不連續(xù)性第五節(jié)第五節(jié) DNA復(fù)制復(fù)制第六節(jié)第六節(jié) DNA損傷修復(fù)損傷修復(fù) 第五節(jié)第五節(jié) DNA的復(fù)制的復(fù)制 (DNA replication in ProkaryoteDNA replication in Prokaryote) DNA復(fù)制結(jié)構(gòu)的研究復(fù)制結(jié)構(gòu)的研究 利用突變表型來考察基因的功能利用突變表型來考察基因的功能 但只能利用條件型突變但只能利用條件型突變溫度敏感突變體溫度敏感

2、突變體 材料材料: E.coli 或噬菌體或噬菌體一、復(fù)制的起始一、復(fù)制的起始二、復(fù)制的延伸二、復(fù)制的延伸三、復(fù)制的終止三、復(fù)制的終止Antibodies of dnaA黑色點：黑色點： oriC electron microscopy. 一、復(fù)制的起始一、復(fù)制的起始 oriC 四個四個9bp的重復(fù)序列的重復(fù)序列 dnaA結(jié)合位點結(jié)合位點 三個三個13bp的重復(fù)序列的重復(fù)序列若干若干GATC位點位點一、復(fù)制的起始點一、復(fù)制的起始點 oriC一、復(fù)制的起始點一、復(fù)制的起始點1 3-OH1 3-OH引發(fā)末端的產(chǎn)生引發(fā)末端的產(chǎn)生2 2 單鏈單鏈DNADNA的產(chǎn)生的產(chǎn)生3 3 復(fù)制復(fù)合體的形成復(fù)制復(fù)合

3、體的形成一、復(fù)制的起始一、復(fù)制的起始1 1、3-OH3-OH引發(fā)末端的產(chǎn)生引發(fā)末端的產(chǎn)生X174 噬菌體的噬菌體的DNA在在三種功能蛋白先后作用下三種功能蛋白先后作用下分開成為單鏈：分開成為單鏈：在復(fù)制起始點在復(fù)制起始點，噬菌體，噬菌體A蛋白蛋白使病毒（使病毒（+）鏈產(chǎn)生）鏈產(chǎn)生缺口。缺口。Three proteins unwind X174 DNA A蛋白（蛋白（gpA）：）： x 174基因基因A的產(chǎn)物的產(chǎn)物 結(jié)合到結(jié)合到 RFDNADNA的復(fù)制原點的結(jié)合位點的復(fù)制原點的結(jié)合位點 （引發(fā)體的幫助）（引發(fā)體的幫助） 誘導(dǎo)相鄰的識別位點的熔解誘導(dǎo)相鄰的識別位點的熔解(負(fù)超螺旋、富含負(fù)超螺旋、富

4、含A/T) 其核酸內(nèi)切酶活力切割（）鏈的其核酸內(nèi)切酶活力切割（）鏈的4305與與4306堿基堿基 的酯鍵，并共價連接于的酯鍵，并共價連接于5端（端（A），另一端為自由的），另一端為自由的 3OH（G）2 2 單鏈單鏈DNADNA的產(chǎn)生的產(chǎn)生解旋酶解旋酶(helicase): (helicase): 使使DNADNA的兩條鏈分開，它通常利用的兩條鏈分開，它通常利用ATPATP水解水解 來提供必需的能量來提供必需的能量X174 噬菌體的噬菌體的DNA在在三種功能蛋白先后作用下三種功能蛋白先后作用下分開成為單鏈：分開成為單鏈：Rep蛋白蛋白提供解旋酶活性，提供解旋酶活性，它使兩鏈分離。它使兩鏈分離。

5、Three proteins unwind X174 DNA Rep蛋白蛋白解旋酶解旋酶 1)1)3)3)2)2)3 復(fù)制復(fù)合體的形成復(fù)制復(fù)合體的形成16DNADNA雙鏈復(fù)制起始點雙鏈復(fù)制起始點 dnaADNADNA雙鏈解開成雙鏈解開成單鏈單鏈DNADNASSB引物酶引物酶RNARNA引物引物/3-/3-OHOHDNADNA聚合酶聚合酶dNTP和和3-OH3-OH形成形成3535磷酸二酯磷酸二酯鍵鍵解旋酶解旋酶解鏈酶SSBSSB引發(fā)體引發(fā)體解鏈、解鏈、解旋酶解旋酶拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 涉及的主要酶系：涉及的主要酶系： DnaA、RNApol是必不可少的，此外涉及到是必不可少的，此外涉及到 Dn

6、aB（解旋酶）、（解旋酶）、 DnaC、Hu、Gyrase、 SSB、 DnaG、Top和和 DNApol 全酶全酶 二、延伸過程二、延伸過程 進(jìn)入的標(biāo)志：進(jìn)入的標(biāo)志：DNApol 把第一個核苷酸加到引物把第一個核苷酸加到引物 的的3OH端端1.在在DNA聚合酶聚合酶的作用下，的作用下，2.前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈合成合成1000-2000個核苷酸后，個核苷酸后，3.隨從鏈隨從鏈開始合成，崗崎片段的長度開始合成，崗崎片段的長度 為為1000-2000個（大腸桿菌）個（大腸桿菌） 4. Pol為不對稱二聚體，為不對稱二聚體， 一個作用于前導(dǎo)鏈，一個作用于前導(dǎo)鏈， 另一個作用于隨從鏈另一個作用于隨從鏈(loo

7、p)。參與復(fù)制延伸的蛋白質(zhì)因子參與復(fù)制延伸的蛋白質(zhì)因子(Dna G)(DnaB)復(fù)制體復(fù)制體21圖12-14 位于復(fù)制叉處的多酶復(fù)合體（引發(fā)體）位于復(fù)制叉處的多酶復(fù)合體（引發(fā)體）必須快速必須快速 從一個岡崎片段移到另一岡崎片段從一個岡崎片段移到另一岡崎片段 In lagging Strand 上多酶系統(tǒng)上多酶系統(tǒng) 必須完成多次反復(fù)的啟動與擴(kuò)展必須完成多次反復(fù)的啟動與擴(kuò)展 E.coli 啟動啟動20004000次的岡崎片段復(fù)制次的岡崎片段復(fù)制復(fù)制叉處的復(fù)制體復(fù)制叉處的復(fù)制體 前導(dǎo)鏈和后隨鏈的協(xié)同合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈的協(xié)同合成聚合酶聚合酶全酶全酶前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈后隨鏈后隨鏈螺旋酶螺旋酶引發(fā)體引發(fā)體引物引

8、物引發(fā)酶引發(fā)酶PriA清除清除SSB提供引發(fā)體移提供引發(fā)體移動動力動動力極性極性35一分子的一分子的 DNA pol III. 協(xié)同合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈協(xié)同合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈252635圖12-13 三、復(fù)制終止三、復(fù)制終止 1、環(huán)形、環(huán)形DNA復(fù)制的終止復(fù)制的終止 a、終止序列、終止序列 E.coli 有兩個終止區(qū)域，分別結(jié)合專一性的終有兩個終止區(qū)域，分別結(jié)合專一性的終 止蛋白止蛋白 序列一：序列一：terE terD terA 序列二：序列二：terF terB terC 每個區(qū)域只對一個方向的復(fù)制叉起作用每個區(qū)域只對一個方向的復(fù)制叉起作用 b、專一性終止蛋白、專一性終止蛋白 E.coli

9、中由中由 tus gene 編碼編碼 通過抑制通過抑制DNA螺旋酶而發(fā)揮終止作用螺旋酶而發(fā)揮終止作用 每次復(fù)制時只使用一個終止位點每次復(fù)制時只使用一個終止位點ter2 2 染色體染色體DNADNA的末端復(fù)制的末端復(fù)制RNA引物水解引物水解即即DNADNA復(fù)制過程不能復(fù)制過程不能 自始至終自始至終 完整地復(fù)制整個線性染色體，完整地復(fù)制整個線性染色體，而是每次都在其而是每次都在其55末端留下一個空缺未能填補(bǔ)（即末端留下一個空缺未能填補(bǔ)（即RNARNA引物降引物降解），如果細(xì)胞沒有辦法添補(bǔ)這些空隙，解），如果細(xì)胞沒有辦法添補(bǔ)這些空隙，染色體染色體DNADNA將隨著每一將隨著每一次的細(xì)胞分裂而不斷縮短

10、，次的細(xì)胞分裂而不斷縮短，直至這種缺隙侵蝕到染色體的結(jié)構(gòu)基直至這種缺隙侵蝕到染色體的結(jié)構(gòu)基因而使細(xì)胞消亡。因而使細(xì)胞消亡。端粒的功能端粒的功能端粒給染色體末端提供了一個保護(hù)性的端粒給染色體末端提供了一個保護(hù)性的“帽子帽子”，防止染色，防止染色體的融和、丟失和降解，并參與染色體和核基質(zhì)的結(jié)合。體的融和、丟失和降解，并參與染色體和核基質(zhì)的結(jié)合。DNADNA復(fù)制模型中存在復(fù)制模型中存在“末端復(fù)制問題末端復(fù)制問題”。真核細(xì)胞。真核細(xì)胞DNADNA復(fù)制需復(fù)制需要要RNARNA引物，復(fù)制完成時，引物，復(fù)制完成時，RNARNA引物被水解。這必然導(dǎo)致復(fù)制引物被水解。這必然導(dǎo)致復(fù)制的隨從鏈的隨從鏈55端有一段缺

11、損，而端有一段缺損，而DNADNA聚合酶無法填補(bǔ)。聚合酶無法填補(bǔ)。根據(jù)此復(fù)制模型，染色體根據(jù)此復(fù)制模型，染色體DNADNA面臨面臨55端縮短的趨勢。端縮短的趨勢。端粒的端粒的存在以其長度的縮短來阻止遺傳信息的丟失，從而維持了基存在以其長度的縮短來阻止遺傳信息的丟失，從而維持了基因組的完整性，解決因組的完整性，解決“末端復(fù)制問題末端復(fù)制問題” ” 。 RNA引物水解引物水解端粒端粒 染色體染色體DNA DNA 端粒端粒末端復(fù)制補(bǔ)齊過程末端復(fù)制補(bǔ)齊過程 通過通過TG鏈的回折形成鏈的回折形成 發(fā)夾結(jié)構(gòu)（發(fā)夾結(jié)構(gòu)（GG氫鍵）氫鍵） 尺蠖模型尺蠖模型 端粒酶（端粒酶（ Telomerase）1985.

12、Carol Greider & Blackburn, 1986. Gottchling Gottchling 四膜蟲四膜蟲 端粒酶端粒酶 （ telomerase ）將將T2G4 末端重復(fù)延伸末端重復(fù)延伸 游撲蟲游撲蟲 Telomerase = RNA CAAAACCCC 鏈鏈 + 末端結(jié)合蛋白末端結(jié)合蛋白 （TBP） 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶a、核蛋白（、核蛋白（ ribonucleoprotein RNP）b、含約長、含約長150NT的的RNA，其中含，其中含 15 拷貝的拷貝的CxAy重復(fù)序列，重復(fù)序列， 是合成端粒是合成端粒T2G4的模板的模板c、延長的、延長的3-T2G4

13、端（端（一段一段cDNA）作為）作為5-端端DNA合成的模板合成的模板端粒酶端粒酶以自身含有的以自身含有的RNA作為模板，合成和補(bǔ)充端粒作為模板，合成和補(bǔ)充端粒的重復(fù)序列，具有逆轉(zhuǎn)錄酶性質(zhì)，的重復(fù)序列，具有逆轉(zhuǎn)錄酶性質(zhì)，是一種是一種RNA依賴的依賴的DNA聚合酶，聚合酶，又稱為端粒末端轉(zhuǎn)移酶。又稱為端粒末端轉(zhuǎn)移酶?？梢源呋肆？梢源呋肆? 端的游離端的游離-OH基上連接新的基上連接新的dNTP以以延長端粒序列延長端粒序列。 端粒酶的功能端粒酶的功能端粒酶以其自身的端粒酶以其自身的RNARNA組分為模板，以原有的一條組分為模板，以原有的一條DNADNA單鏈的單鏈的33端游離端游離-OH-OH為

14、引物，在端粒末端添加新為引物，在端粒末端添加新的端粒重復(fù)序列使端粒延長。端粒酶的作用解決了的端粒重復(fù)序列使端粒延長。端粒酶的作用解決了“末端復(fù)制問題末端復(fù)制問題”，保證真核細(xì)胞線性染色體，保證真核細(xì)胞線性染色體DNADNA復(fù)復(fù)制得以完全制得以完全。端粒酶的活性決定了端粒的長度。端粒酶的活性決定了端粒的長度。無論單細(xì)胞或多細(xì)胞真核生物都存在各自特異的端無論單細(xì)胞或多細(xì)胞真核生物都存在各自特異的端粒酶粒酶RNARNA模板。模板。 染色體DNA端粒端粒39去除去除RNARNA引物引物補(bǔ)充空缺補(bǔ)充空缺連接連接 DNADNA聚合酶聚合酶的小片段的小片段 5 35 3外切酶外切酶DNADNA聚合酶聚合酶的大片段的大片