電泳標(biāo)準(zhǔn)操作流程

1、SDS-PAGE電泳標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（網(wǎng)上）3.程序：3.1. 制膠3.1.1組裝膠架 將潔凈、無(wú)水的玻片對(duì)齊，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭頭向上，并確保下端平齊。放于制膠架上夾緊，下端緊貼密封條。3.1.2 分離膠的配置 3.1.2.1 10%分離膠配方如下表：10%膠蒸餾水30%Acr-Bis(29:1)1.5M Tris-Hcl PH 8.810%SDS10%AP(過(guò)硫酸銨)TEMED5 ml1.3 ml1.7 ml1.9 ml0.05 ml0.05 ml0.007ml3.1.2.2 灌膠 混勻后用移液槍將凝膠溶液沿玻棒小心注入到長(zhǎng)、短玻璃板間的狹縫內(nèi)(膠高度距樣品模板梳齒下緣約1c

2、m)。 3.12.3液封 在凝膠表面沿短玻板邊緣輕輕加一層水以隔絕空氣，使膠面平整。靜置約30min觀察膠面變化，當(dāng)看到水與凝固的膠面有折射率不同的界限時(shí)，表明膠已完全凝固，倒掉上層水，并用濾紙吸干殘留的水液。3.1.3濃縮膠的配置 .1 5%濃縮膠配方下表：5%膠蒸餾水30%Acr-Bis(29:1)0.5M Tris-Hcl PH 6.810%SDS10%AP(過(guò)硫酸銨)TEMED2 ml1.4 ml0.33 ml0.25ml0.02 ml0.02 ml0.02 ml3.1.3.2插入制膠梳 混勻后用移液槍將凝膠溶液注入到長(zhǎng)、短玻璃板間的狹縫內(nèi)(分離膠上方)，輕輕加入樣品模板梳，小心避免氣

3、泡的出現(xiàn)。約30分鐘，聚合完全。3.2. 電泳 安裝電泳槽 將制備好的凝膠板取下，小心拔下梳子。兩塊10%的凝膠板分別插到U形橡膠框的兩邊凹形槽中，可往上提起使凝膠板緊貼橡膠。將裝好玻璃板的膠?？蚱椒旁谘龇诺馁A槽框上，其下緣與貯槽框下緣對(duì)齊，放入電泳槽內(nèi)。倒入1X tris-gly電泳緩沖液。3.2.2 樣品處理 對(duì)于蛋白樣品直接取80µl的樣品，依次加上20µl 5x buffer (加了B-巰基乙醇)，混勻。對(duì)于菌體或組織等固體樣品，取少量樣品加100ul 2x buffer (加了B-巰基乙醇)煮沸10分鐘。 加樣 用移液槍取處理過(guò)的樣品溶液10l，小心地依次加入到各

4、凝膠凹形樣品槽內(nèi)，marker 加入到其中一個(gè)槽內(nèi)，為區(qū)別兩塊板，marker可加在不同的孔槽中。3.2.4 電泳 將電泳槽放置電泳儀上，接通電源，正負(fù)極對(duì)好。電壓調(diào)至約150v保持恒壓。待溴酚藍(lán)標(biāo)記移動(dòng)到凝膠底部時(shí)，關(guān)電源，把電泳緩沖液倒回瓶中。3.2.5剝離膠 把電泳槽取出，兩塊板拿下來(lái)，用刮片從長(zhǎng)短玻片中間翹起，再把濃縮膠刮掉，取下。3.3. 染色放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫過(guò)膠即可，置于搖床上，轉(zhuǎn)速約為45r/min，時(shí)間約1小時(shí)，完成后染液倒掉并用水洗掉染液。3.4.脫色取出染色過(guò)的膠放于加有脫色液的染缸里，脫色液漫過(guò)膠即可，置于搖床上，轉(zhuǎn)速約為45r/min，時(shí)間約1小

5、時(shí)，本底色脫凈，條帶清晰可見(jiàn)即可，完成后倒掉脫色液。3.5.拍照 將脫色后的膠置于透明文件夾中，把膠上面的氣泡趕出（用前也可用酒精棉球擦干凈文件夾），放到掃描儀上，拍照。4. 注意事項(xiàng)4.1 根據(jù)目的蛋白的大小選擇合適的膠片濃度。一般為100KD-50KD選用10%膠；50KD-30KD選用12%膠；30KD-10KD選用15%膠。4.2 要根據(jù)樣品濃度來(lái)加樣品溶解液。每加一個(gè)樣品后換一支吸頭或清洗吸頭后再點(diǎn)另一個(gè)樣品。4.3 制備聚丙烯酰胺凝膠時(shí)，倒膠后常漏出膠液，那是因?yàn)槎K玻璃板與塑料條之間沒(méi)封緊，留有空隙，所以這步要特別留心操作.4.4 電泳完畢撬板取凝膠時(shí)要小心細(xì)致不能把膠弄破。4.

6、5 電泳緩沖液可重復(fù)利用，如果膠上出現(xiàn)不正常痕跡，就要及時(shí)更換新液。4.6 分離膠高度控制得當(dāng)，確保有大約1cm左右的濃縮膠空間。過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短均不能得到理想的電泳結(jié)果。4.7 電泳染色液注意進(jìn)行回收再利用，一般可重復(fù)使用2-3次。4.8 AP和TEMED是催化劑，加入的量要合適，過(guò)少則凝膠聚合很慢甚至不聚合，過(guò)多則聚合過(guò)快，影響倒膠。l 配膠用的試劑，要提前配好：30%丙烯酰胺貯存液丙烯酰胺29.2g，亞甲雙丙烯酰胺0.8g，混勻后加ddH2O，37溶解，定容至100ml，棕色瓶存于4。1.5MTris-HCl(pH 8.0)：Tris base 18.17g加ddH2O溶解，濃鹽酸調(diào)pH至8.

7、0，定容至100ml，4保存。1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris base12.11g加ddH2O溶解, 濃鹽酸調(diào)pH至6.8，定容至100ml，4保存。10% SDS：電泳級(jí)SDS 10.0 g加ddH2O 68助溶，濃鹽酸調(diào)至pH 7.2，定容至100ml。10%過(guò)硫酸銨（AP）：1g過(guò)硫酸銨加ddH2O至10ml。l 跑膠用試劑：電泳緩沖液(pH 8.3Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解，定容至1000ml。2´SDS電泳上樣緩沖液：1M Tris-HCl (pH 6.8) 1.0ml，b-巰基乙醇1.0ml，S

8、DS 0.4 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚藍(lán) 1.0ml，ddH2O 5.0ml?？捡R斯亮藍(lán)染色液：考馬斯亮藍(lán)R250 0.25 g，甲醇45ml，冰醋酸 10ml，ddH2O 45ml脫色液甲醇45ml，冰醋酸 10ml，ddH2O 45ml。操作步驟：采用垂直式電泳槽裝置1、 安裝電泳槽2、 配制分離膠(12%)（10ml）：ddH2O 3.3ml30%丙烯酰胺貯存膠 4.0ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1mlTEMED4.0l混勻后灌入玻璃板間，以水封頂，注意使液面水平。（凝膠完全聚合需30-60min）。3、 配制積層膠（5%

9、）（3ml）：ddH2O 2.1 ml30%丙烯酰胺貯存膠0.5 ml1M Tris-HCl 0.38 ml10%SDS 0.03 ml10%AP 0.03 mlTEMED 3.0 l將分離膠上的水倒去，并用濾紙吸干多余水份，加入上述混合液，立即將梳子插入玻璃板間，完全聚合需15-30min。4、待積層膠完全聚合后，小心拔出梳子，然后將玻璃板固定在電泳槽上。5、樣品處理：將樣品加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100加熱3-5min， 12000g離心1min，取上清作SDS-PAGE分析，同時(shí)將SDS低分子量蛋白質(zhì)Marker作平行處理。6、上樣：取10l誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)的處理后的樣品加

10、入樣品池中，并加入20l低分子量蛋白Marker作對(duì)照。7、電泳：在電泳槽中加入1´電泳緩沖液，連接電源，電泳時(shí)，積層膠電壓80V，分離膠電壓120V，電泳至溴酚藍(lán)行至電泳槽下端停止（約需2-3h）。8、染色：將膠從玻璃板中取出，置于考馬斯亮藍(lán)染色液中染色，室溫4-6h。9、脫色：將膠從染色液中取出，放入脫色液中，多次脫色至蛋白帶清晰。10、凝膠攝像和保存：將脫色好的凝膠攝像，凝膠可保存于雙蒸水中或7%乙酸溶液中。注意事項(xiàng)：1、實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組所加總蛋白含量要相等。2、為達(dá)到較好的凝膠聚合效果，緩沖液的pH值要準(zhǔn)確，10%AP在一周內(nèi)使用。室溫較低時(shí)，TEMED的量可加倍。3、未聚合的

11、丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，可通過(guò)皮膚和呼吸道吸收，應(yīng)注意防護(hù)。周師姐 試劑配制：l 30%丙烯酰胺(29:1)配制：稱(chēng)取Acrylamide 29 g、Bisacrylamide 1 g，加入約60 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?。加去離子水將溶液定容至100 mL，用0.45um濾膜濾去雜質(zhì)，于中4避光保存。l 5×Tris-Glycine電泳緩沖液的配制：稱(chēng)取Tris-base 15.1 g、Glycine 94 g、SDS 5 g置于1 L燒杯中，加入約800 mL的去離子水，攪拌溶解；加去離子水將溶液定容至1 L后，室溫保存。l 10 %過(guò)硫酸胺(AP)的配制：稱(chēng)取

12、過(guò)硫酸胺0.1 g 溶于1.0 mL 滅菌的去離子水中，充分混勻后于4 避光保存，保存時(shí)間不能超過(guò)1周。 l 10 % SDS的配制：稱(chēng)取SDS 10 g溶于100 mL滅菌的去離子水中并于50水浴下溶解，室溫保存。如在長(zhǎng)期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 l 1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)：稱(chēng)取Tris-base 45.43 g，加入約200 mL去離子水，攪拌溶解；用濃鹽酸調(diào)pH至8.8，最后用去離子水定容至250 mL，室溫下保存。 l 0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)：稱(chēng)取Tris-base 15.14 g，加入約200 mL去離子水，攪拌溶解；

13、用濃鹽酸調(diào)pH至6.8，最后用去離子水定容至250 mL，室溫下保存。 l 12 % SDS-PAGE 分離膠：30%丙烯酰胺4 mL、去離子水3.3 mL、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)2.5 mL、10 % AP 100 L、10 % SDS 100 L和TEMED 5 L充分混勻后灌膠。l 15 % SDS-PAGE 分離膠：30%丙烯酰胺5 mL、去離子水2.3 mL、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)2.5 mL、10 % AP 100 L、10 % SDS 100 L和TEMED 5 L充分混勻后灌膠。l 5 % SDS-PAGE 濃膠：30%丙烯酰

14、胺0.5 mL、去離子水2.1 mL、0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)0.375 mL、10 % AP 30 L、10 % SDS 30 L和TEMED 5 L充分混勻后灌膠。l 考馬斯亮藍(lán)染色液的配制：稱(chēng)取1 g考馬斯亮藍(lán)R-250，置于1 L燒杯中；量取250 mL異丙醇加入上述燒杯中，攪拌溶解；加入100 mL的冰醋酸，攪拌均勻；加入650 mL去離子水，攪拌均勻；用濾紙除去顆粒物質(zhì)后，室溫保存?zhèn)溆?。l 脫色液的配制：量取冰醋酸 100 mL、乙醇50 mL，加去離子水定溶至1L，攪拌均勻，室溫保存?zhèn)溆?。l 轉(zhuǎn)移緩沖液的配制：稱(chēng)取Tris-base 1.45 g、甘氨酸7

15、.2 g，加入約200 mL去離子水，攪拌溶解；加入100 mL甲醇，最后用去離子水定容至500 mL，室溫下保存?zhèn)溆谩?l 洗膜緩沖液(TBST)的配制：稱(chēng)取NaCl 8.8 g、Tris-base 2.42 g，向燒杯中加入約800 mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?；? M HCl將溶液的pH值調(diào)至7.5，加入0.5 mL Tween 20后充分混勻；加去離子水將溶液定容至1 L后，于4 保存?zhèn)溆?。l 封閉緩沖液的配制：稱(chēng)取0.5 g脫脂奶粉溶于10 mL TBST緩沖液中，充分混勻后備用。0.1 M 甘氨酸緩沖液配制：稱(chēng)取0.75 g甘氨酸加入90 mL去離子水，充分溶解后用pH計(jì)將pH值調(diào)至2.5，用去離子水定容至100mL后用0.22 µm 微孔慮膜過(guò)濾除菌后，將其分裝