waters_e2695_training

1、-中心實驗室 唐翠娥Waters High Performance Liquid Chromatography（HPLC） Training52341目目 錄錄HPLC 基礎知識簡介基礎知識簡介 HPLC 系統(tǒng)組成部件系統(tǒng)組成部件 軟件操作軟件操作 Waters e2695實驗操作實驗操作常見色儀器和色譜圖故障常見色儀器和色譜圖故障正相色譜法反相色譜法固定相極性高低中低流動相極性低中中高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出適用范圍溶于有機溶劑的極性至中等極性的分子型化合物較廣，非極性至中等極性的組分表表1.1.正相色譜法與反相色譜法比較表 HPLC 基礎知識簡介基礎知識簡介3HPLC 基礎知識

2、簡介基礎知識簡介Chromatogram3HPLC 基礎知識簡介基礎知識簡介PeakPeak BasePeak HeightPeak WidthPeak Width at Half HeightPeak AreaTailing Peak: 后沿較前沿平緩的不對稱峰后沿較前沿平緩的不對稱峰Leading Peak:前沿較后沿平緩的不對稱峰前沿較后沿平緩的不對稱峰Ghost Peak: 假峰假峰BaselineBaseline Drift:Baseline Noise:Band Broadening:組分在色譜柱組分在色譜柱內移動過程中譜帶寬度增加的現(xiàn)象內移動過程中譜帶寬度增加的現(xiàn)象。色譜圖名詞術

3、語色譜圖名詞術語3HPLC 基礎知識簡介基礎知識簡介3HPLC 基礎知識簡介基礎知識簡介理論塔板數(shù)(N): 分離效率的量度, 3HPLC 基礎知識簡介基礎知識簡介3 容量因子容量因子k3分離因子分離因子 3HPLC 基礎知識簡介基礎知識簡介理論塔板數(shù)(N): 分離效率的量度, 填料顆粒度越小填料顆粒度越小,N 越大；流動相流速越大；流動相流速V 越高越高,N 越大。柱長越廠，越大。柱長越廠，N越大。越大。3k， 和和N N，如何控制？，如何控制？ HPLC 系統(tǒng)系統(tǒng)組成部件組成部件 Waters HPLC 系統(tǒng)系統(tǒng)組成組成 硬件系統(tǒng)：泵(515,1515,1525,600,616,626)進樣

4、器(7725i,717Plus)色譜柱(Symmetry C18, NovaPakC18,)檢測器(2698/2996, 2487,2475,EMD)2695/2795分離單元(溶劑管理與樣品管理集成為一體)軟件系統(tǒng)：軟件系統(tǒng)：積分儀(746)、工作站(PC800）數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)Breeze、Millennium32、EmpowerMasslynx4.0軟件平臺(LC-MS)Waters HPLC 系統(tǒng)系統(tǒng)1525-717-2487-Breeze系統(tǒng)1525-717-2998-Empower系統(tǒng)Waters 1525泵系統(tǒng)泵系統(tǒng)Waters 717自動進樣器自動進樣器48 or 96位樣品樣品盤

5、位樣品樣品盤可單獨操作也可外部控制可單獨操作也可外部控制(IEEE)Waters 2998 PDA檢測器檢測器PDA檢測器的三維檢測器的三維(3D)圖圖Waters HPLC 系統(tǒng)系統(tǒng)Alliance 系統(tǒng):-2690/5分離單元-2998檢測器-Empower2 控制軟件Waters的的HPLC系統(tǒng)系統(tǒng)Waters e2695系統(tǒng)系統(tǒng)-1.梯度比例閥(GPV);2.進口閥;3.主柱塞（傳送溶液）;4.主壓力傳感器;5.蓄積柱塞（向系統(tǒng)輸送液體）;6.系統(tǒng)壓力傳感器;7.獨立的線性柱塞驅動馬達（與傳統(tǒng)一個馬達驅動串聯(lián)或并聯(lián)泵相比，無壓力波動，沒有出口閥，減少故障率）流速精度達到0.075%Wa

6、ters e2695 進樣系統(tǒng)系統(tǒng)進樣系統(tǒng)系統(tǒng)五個獨立的24位樣品盤Waters 2998 PDA檢測器檢測器PDA檢測器的三維檢測器的三維(3D)圖圖Waters液相操作液相操作1、溶劑準備、溶劑準備：色譜純級別色譜純級別a): 過濾過濾0.45m濾膜（濾膜（纖維素膜水溶液，纖維素膜水溶液， 尼龍、尼龍、PTFE通用型通用型）b):脫氣脫氣超聲超聲3-5min，排除，排除O2，N2等。等。保證流量準確，提高色譜圖重現(xiàn)保證流量準確，提高色譜圖重現(xiàn)性，增加信噪比（低紫外去氧氣吸收），保護色譜柱（填料氧化）。性，增加信噪比（低紫外去氧氣吸收），保護色譜柱（填料氧化）。c):溶劑截止波長溶劑截止波長

7、：最好避免，如乙腈和水：最好避免，如乙腈和水190nm, 甲醇和乙醇甲醇和乙醇210nm,等。等。d):緩沖鹽流動相緩沖鹽流動相：需現(xiàn)配現(xiàn)用，低溫密封保存最多：需現(xiàn)配現(xiàn)用，低溫密封保存最多3天；天； 有機溶劑和緩沖鹽（水）混配流動相，需低溫保存。有機溶劑和緩沖鹽（水）混配流動相，需低溫保存。e):溶劑混溶性溶劑混溶性：建議用色譜純：建議用色譜純10%異丙醇異丙醇or水作為過渡溶劑。水作為過渡溶劑。Waters液相操作液相操作1、溶劑準備、溶劑準備： 1525系統(tǒng)系統(tǒng)：A,B兩通道流動相，針頭清洗液（綠色）。兩通道流動相，針頭清洗液（綠色）。 e2695系統(tǒng)系統(tǒng)： 流動相流動相-最多可以做最多可

8、以做A,B,C,D四通道梯度混合洗脫四通道梯度混合洗脫。灌注柱塞密封清洗液（灌注柱塞密封清洗液（seal wash）-一般建議使用一般建議使用10%20%甲醇甲醇水溶液。水溶液。針頭清洗液（綠色）針頭清洗液（綠色）- 一般選擇樣品最后幾分鐘洗脫相似的溶劑一般選擇樣品最后幾分鐘洗脫相似的溶劑作為洗脫溶劑。作為洗脫溶劑。 Waters液相操作液相操作2、開機一般流程：、開機一般流程：開啟開啟HPLC系統(tǒng)各個設備的電源。系統(tǒng)各個設備的電源。 1525系統(tǒng)系統(tǒng)：開泵、柱溫箱、自動進樣器開泵、柱溫箱、自動進樣器:待設備通過自檢后，打開計待設備通過自檢后，打開計算機。算機。打開檢測器電源打開檢測器電源:檢

9、測器通過自檢后（檢測器通過自檢后（3-5min）,才能被軟才能被軟件控制件控制, 建議有流動相流經(jīng)檢測器后再開啟電源建議有流動相流經(jīng)檢測器后再開啟電源。啟動色譜管理軟件啟動色譜管理軟件,1525系統(tǒng)沒有控制版面，所有操作都系統(tǒng)沒有控制版面，所有操作都需在軟件上執(zhí)行。需在軟件上執(zhí)行。 Waters液相操作液相操作 e2695系統(tǒng)系統(tǒng)：1）打開電源開關）打開電源開關，儀器啟動診斷程序會開，儀器啟動診斷程序會開始始屏幕上會顯示Main界面，繼續(xù)進行針頭、注射器和閥門，樣品轉盤托架和溶劑管理系統(tǒng)這些機械部件進行診斷測試，測試成功后，系統(tǒng)進入“Idle”狀態(tài)。常見問題：“plunger homing o

10、ver pressure ”，初始化中斷。解決辦法：打開排液閥，重新初始化。Waters液相操作液相操作 2）打開在線脫氣機）打開在線脫氣機：在面板中直接操作或者軟件中打開。 Waters液相操作液相操作3）色譜泵排氣：）色譜泵排氣：3.1）dry prime: 干抽，儀器停放很長干抽，儀器停放很長時間后管路空了，無法時間后管路空了，無法wet prime時，時，用于快速排空氣泡。用于快速排空氣泡。Waters液相操作液相操作3.2） Wet prime: 濕抽濕抽， 快速替換管路中溶劑用的。注意：快速替換管路中溶劑用的。注意：溶劑的互溶性，溶劑的互溶性，如：如：在由緩沖溶劑改為高有機物含量的

11、溶劑在由緩沖溶劑改為高有機物含量的溶劑時，為避免時，為避免“分離單元分離單元”內出現(xiàn)鹽沉淀，請使用中間溶劑內出現(xiàn)鹽沉淀，請使用中間溶劑（如水）。（如水）。在在 Main （主）屏幕中，按（主）屏幕中，按 Menu/Status 顯示顯示 Status （狀態(tài)）屏幕。按（狀態(tài)）屏幕。按 Direct Functions 菜單。菜單。排氣后系統(tǒng)輸液溫度，壓力波動小排氣后系統(tǒng)輸液溫度，壓力波動小,一般在幾十一般在幾十Psi以內以內),否則否則,需重做排氣操作需重做排氣操作Waters液相操作液相操作4）清洗進樣器系統(tǒng)：清洗進樣器系統(tǒng)：當更換流動相或者發(fā)現(xiàn)注射器內有氣泡當更換流動相或者發(fā)現(xiàn)注射器內有氣

12、泡時（時（純甲醇清洗純甲醇清洗），需要對進樣系統(tǒng)進），需要對進樣系統(tǒng)進行清洗，主要包括對定量環(huán)和注射器的行清洗，主要包括對定量環(huán)和注射器的清洗清洗 。Waters液相操作液相操作2、系統(tǒng)平衡：跑基線系統(tǒng)平衡：跑基線 正確安裝色譜柱后，用準備好的流動相平衡系統(tǒng)，大約正確安裝色譜柱后，用準備好的流動相平衡系統(tǒng)，大約0.51h.3、樣品準備樣品準備：過濾，樣品瓶中應有超過過濾，樣品瓶中應有超過1/3高度高度 的樣品量。的樣品量。4、編制儀器方法，開始試驗，編制儀器方法，開始試驗，軟件操作。軟件操作。5、清洗清洗：實驗結束后，應對液相系統(tǒng)（進樣器、泵、檢測器等）、實驗結束后，應對液相系統(tǒng)（進樣器、泵、

13、檢測器等）、色譜柱進行清洗色譜柱進行清洗。建議批量進樣后，最后進一針建議批量進樣后，最后進一針50ul流動相，如果流動流動相，如果流動相中有鹽，則用純水代替緩沖鹽那部分比例相中有鹽，則用純水代替緩沖鹽那部分比例。清洗后色譜柱和系統(tǒng)中需。清洗后色譜柱和系統(tǒng)中需填充需要的溶劑。填充需要的溶劑。6、關機關機：退出：退出Empower控制軟件，依次關閉泵，檢測器，電腦等電控制軟件，依次關閉泵，檢測器，電腦等電源。源。Waters軟件操作軟件操作1、登入登入2、項目建立項目建立 3、方法編輯、方法編輯。Empower中所有功能都需要相應的中所有功能都需要相應的“方法方法”去實去實現(xiàn)?，F(xiàn)。 儀器方法儀器方

14、法：設置儀器參數(shù)采集樣品：設置儀器參數(shù)采集樣品 處理方法處理方法：對色譜數(shù)據(jù)進行處理計算：對色譜數(shù)據(jù)進行處理計算 報告方法報告方法：對色譜結果打印報告：對色譜結果打印報告 輸出方法輸出方法：輸出色譜數(shù)據(jù)。：輸出色譜數(shù)據(jù)。 方法組方法組：將上述方法組合，從而可以進行數(shù)據(jù)的批處理。：將上述方法組合，從而可以進行數(shù)據(jù)的批處理。4、單次進樣和樣品組進樣5、3D數(shù)據(jù)處理6、打印報告Waters軟件操作軟件操作常見儀器故障常見儀器故障-Troubleshooting1、流動相及溶劑瓶流動相及溶劑瓶 流動相脫氣不充分易引起噪聲大，出現(xiàn)毛刺峰。溶劑過濾器流動相脫氣不充分易引起噪聲大，出現(xiàn)毛刺峰。溶劑過濾器堵塞

15、會引起流動相供給不暢，壓力不穩(wěn)。流動相被污染了會引堵塞會引起流動相供給不暢，壓力不穩(wěn)。流動相被污染了會引起基線上升，梯度洗脫出現(xiàn)鬼峰。起基線上升，梯度洗脫出現(xiàn)鬼峰。2、初始化錯誤初始化錯誤：Plunger homing over pressure-在線過在線過濾器堵塞。濾器堵塞。3、泵常見故障、泵常見故障：Lost Prime-單向閥堵死。單向閥堵死。4、進樣器故障進樣器故障：需使用匹配的進樣瓶，易出現(xiàn)進樣針堵塞，：需使用匹配的進樣瓶，易出現(xiàn)進樣針堵塞，空白溶劑出現(xiàn)色譜峰時，需加倍清洗或者調整樣品濃度順序空白溶劑出現(xiàn)色譜峰時，需加倍清洗或者調整樣品濃度順序（L-H）。）。 常見儀器故障常見儀器

16、故障-Troubleshooting5、色譜柱故障：、色譜柱故障：6、檢測器故障、檢測器故障：燈故障易引起噪聲大，靈敏度下降。燈故障易引起噪聲大，靈敏度下降。流動相和樣品臟易引起流通池污染和堵塞故障流動相和樣品臟易引起流通池污染和堵塞故障。常見儀器故障常見儀器故障-Troubleshooting7、堵堵-壓力高壓力高柱壓升高，升高的依據(jù)應該跟之前相同條件下所得的柱壓進行柱壓升高，升高的依據(jù)應該跟之前相同條件下所得的柱壓進行對比。對比。堵應該先排除是系統(tǒng)堵還是柱子堵，首先斷開色譜柱，連接兩堵應該先排除是系統(tǒng)堵還是柱子堵，首先斷開色譜柱，連接兩通，如果壓力超過通，如果壓力超過1500psi，那么系

17、統(tǒng)肯定是堵了，滯后逐一，那么系統(tǒng)肯定是堵了，滯后逐一排查，清洗或者更換被堵部件。排查，清洗或者更換被堵部件。Notes:溶劑吸濾頭溶劑吸濾頭,進出口閥及管路進出口閥及管路(包括進樣器和檢測池包括進樣器和檢測池)若被污染若被污染,應作清應作清洗和鈍化處理。一般采用洗和鈍化處理。一般采用30磷酸水溶液作為清洗劑，用磷酸水溶液作為清洗劑，用6M硝酸作為鈍硝酸作為鈍化劑，先清洗再鈍化化劑，先清洗再鈍化。清洗的目的是去除不銹鋼管路及系統(tǒng)內的污垢。鈍。清洗的目的是去除不銹鋼管路及系統(tǒng)內的污垢。鈍化的目的是使不銹鋼管路的內表面形成光滑均勻的氧化膜?；哪康氖鞘共讳P鋼管路的內表面形成光滑均勻的氧化膜。（清洗鈍

18、化步驟：設（清洗鈍化步驟：設ABCD25% 1ml/min 水水-30%磷酸磷酸or6M硝酸硝酸 45min-水至中性水至中性-甲醇）甲醇）常見儀器故障常見儀器故障-Troubleshooting 色譜柱堵塞引起壓力高色譜柱堵塞引起壓力高，可能由于填料表面物質吸附，可能由于填料表面物質吸附或沉淀引起，則需對色譜柱進行清洗，建議方法低流速或沉淀引起，則需對色譜柱進行清洗，建議方法低流速清洗。清洗。反相色譜柱：水，甲醇，四氫呋喃，二氯甲烷反相色譜柱：水，甲醇，四氫呋喃，二氯甲烷, 甲醇甲醇 和水和水正相色譜柱：二氯甲烷，四氫呋喃正相色譜柱：二氯甲烷，四氫呋喃THF, 水水,甲醇，甲醇， 二氯甲烷。二氯甲烷。如果還是不行，則可考慮反沖或者購買新柱如果還是不行，則可考慮反沖或者購買新柱。常見色譜圖故障常見色譜圖故障-Troubleshooting1、色譜圖保留時間變化問題、色譜圖保留時間變化問題A）前后兩針進