第十章電泳技術(shù)

1、第第 十十 章章電電 泳泳 技技 術(shù)術(shù)電泳電泳是荷電溶質(zhì)（電解質(zhì)）在是荷電溶質(zhì)（電解質(zhì)）在電場作用下發(fā)生定向泳動的現(xiàn)象。電場作用下發(fā)生定向泳動的現(xiàn)象。電泳分離電泳分離則是利用荷電溶質(zhì)在則是利用荷電溶質(zhì)在電場中泳動速度的差別進行分離電場中泳動速度的差別進行分離的方法。的方法。電泳為生化物質(zhì)的分離提供了一個有電泳為生化物質(zhì)的分離提供了一個有效的和多功能的方法。效的和多功能的方法。傳統(tǒng)上，各類電泳僅用于常規(guī)的生化傳統(tǒng)上，各類電泳僅用于常規(guī)的生化分析，直至上世紀分析，直至上世紀7070年代以后，各種以分年代以后，各種以分離回收為目的的電泳法發(fā)展很快，已達到離回收為目的的電泳法發(fā)展很快，已達到一定的分離

2、制備規(guī)模。一定的分離制備規(guī)模。 與超濾等膜分離法一樣，電泳分離中不與超濾等膜分離法一樣，電泳分離中不存在相平衡，是一種速度分離法。存在相平衡，是一種速度分離法。但與膜過濾相比，電泳操作的剪切作用但與膜過濾相比，電泳操作的剪切作用較小，可以使蛋白質(zhì)等生物大分子保持較高較小，可以使蛋白質(zhì)等生物大分子保持較高的生物活性。的生物活性。分辨率高和能夠保持產(chǎn)物的生物活性這分辨率高和能夠保持產(chǎn)物的生物活性這兩個突出的優(yōu)點使得電泳技術(shù)愈來愈受到人兩個突出的優(yōu)點使得電泳技術(shù)愈來愈受到人們的重視。們的重視。 10.1 電泳的理論基礎電泳的理論基礎當一個帶有效電荷當一個帶有效電荷Q的質(zhì)點，在黏的質(zhì)點，在黏性介質(zhì)中性

3、介質(zhì)中(液體或凝膠液體或凝膠)受到電場受到電場(電位電位梯度梯度)E正的作用恒速遷移時，質(zhì)點在正的作用恒速遷移時，質(zhì)點在受到一個驅(qū)動力受到一個驅(qū)動力(其值為其值為QE)的同時還的同時還受到一個與其相平衡的摩擦阻力受到一個與其相平衡的摩擦阻力f。 （10-1）fQE 在自由溶液中，摩擦阻力服從在自由溶液中，摩擦阻力服從Stokes定律：定律： （10-2）式中式中r為質(zhì)點半徑；為質(zhì)點半徑；v為質(zhì)點的遷移為質(zhì)點的遷移速度；速度；為介質(zhì)黏度。為介質(zhì)黏度。 rvf6合并上述兩式，可求得質(zhì)點合并上述兩式，可求得質(zhì)點的遷移速度的遷移速度v （10-3）rEQv6如果電量如果電量Q按照電子電量按照電子電量e

4、（=1.610-19C）乘上電荷數(shù)）乘上電荷數(shù)Z來來計算，則上式可寫成：計算，則上式可寫成： （10-4）reZEv6質(zhì)點的質(zhì)點的電泳遷移率電泳遷移率（電泳度）（電泳度）u被定義為在單位電位梯度（被定義為在單位電位梯度（E）的作用下，單位時間內(nèi)質(zhì)點所移的作用下，單位時間內(nèi)質(zhì)點所移動的距離（動的距離（d）：）： 或或 （10-5）tEdu Evu 所以可以得到所以可以得到 （10-6） 從上述公式可知，電泳遷移率與從上述公式可知，電泳遷移率與帶電顆粒的凈電荷量成正比，而與帶電顆粒的凈電荷量成正比，而與顆粒半徑和介質(zhì)黏度成反比。顆粒半徑和介質(zhì)黏度成反比。 rZerQu66對于兩種離子型物質(zhì)對于兩種

5、離子型物質(zhì)A和和B的混的混合物的分離來說。如果它們的遷移合物的分離來說。如果它們的遷移率由實驗測得是率由實驗測得是uA和和uB，根據(jù)遷移，根據(jù)遷移率的定義可知：率的定義可知： 和和 dA和和dB分別為各物質(zhì)在電位梯度分別為各物質(zhì)在電位梯度E下經(jīng)過下經(jīng)過t時間后所移動的距離。時間后所移動的距離。 tEduAAtEduBB由上式可得到：由上式可得到： （10-7） （10-8）上式表明，用實驗最終所得的上式表明，用實驗最終所得的（dA-dB），來確定），來確定A和和B兩種物質(zhì)兩種物質(zhì)的分離，電泳需要持續(xù)的時間的分離，電泳需要持續(xù)的時間t。 )(BABAuuEtdd)(BABAuuEddt10.2

6、影響電泳遷移率的因素影響電泳遷移率的因素1顆粒的性質(zhì)顆粒的性質(zhì) 顆粒所帶凈電荷量越大，直徑越顆粒所帶凈電荷量越大，直徑越小或其形狀越接近于球形，在電場小或其形狀越接近于球形，在電場中的遷移率就越大。中的遷移率就越大。2電場強度電場強度 電場強度越高，帶電顆粒的遷電場強度越高，帶電顆粒的遷移速度越快。移速度越快。 常壓電泳控制的電場強度為常壓電泳控制的電場強度為2-2-10V/cm10V/cm。3溶液的性質(zhì)溶液的性質(zhì) 主要是指電極室緩沖溶液和目標主要是指電極室緩沖溶液和目標產(chǎn)物樣品溶液的產(chǎn)物樣品溶液的pHpH值、離子強度和黏值、離子強度和黏度等。度等。 溶液的溶液的pH值值 溶液的溶液的pHpH

7、值決定著電解質(zhì)的解離程值決定著電解質(zhì)的解離程度和其所帶凈電荷的量，對于氨基酸或度和其所帶凈電荷的量，對于氨基酸或蛋白質(zhì)，溶液的蛋白質(zhì)，溶液的pHpH值應遠離其等電點，值應遠離其等電點，使其凈電荷量變大，遷移速度加快。使其凈電荷量變大，遷移速度加快。 離子強度離子強度 組分的分離取決于緩沖液的離子組分的分離取決于緩沖液的離子強度，如果離子強度高，可獲得良好強度，如果離子強度高，可獲得良好的分離效果，但是電泳遷移率會降低，的分離效果，但是電泳遷移率會降低，所以溶液的離子強度一般維持在所以溶液的離子強度一般維持在0.050.050.1mo1/L0.1mo1/L范圍內(nèi)。范圍內(nèi)。溶液的黏度溶液的黏度 電

8、泳遷移率與溶液的黏度成反電泳遷移率與溶液的黏度成反比，所以黏度不能過大或過小。比，所以黏度不能過大或過小。4其它因素其它因素 焦耳效應焦耳效應 電泳過程中由于電流會產(chǎn)生熱量，電泳過程中由于電流會產(chǎn)生熱量，使溫度增加。使溫度增加。 溫度增加，一是使電泳流動性增加，溫度增加，一是使電泳流動性增加，二是使支持介質(zhì)中緩沖液的溶劑蒸發(fā)，二是使支持介質(zhì)中緩沖液的溶劑蒸發(fā)，從而促進或延緩電泳遷移，三是溶劑的從而促進或延緩電泳遷移，三是溶劑的損失會引起電解質(zhì)濃度的增加，離子強損失會引起電解質(zhì)濃度的增加，離子強度增加和支持介質(zhì)導電率增加。度增加和支持介質(zhì)導電率增加。 (2) 電滲電滲 電滲現(xiàn)象是一種在外加電壓作

9、電滲現(xiàn)象是一種在外加電壓作用下，和固體支持物接觸的液體的用下，和固體支持物接觸的液體的移動現(xiàn)象。移動現(xiàn)象。如果支持物質(zhì)帶有羧基、磺酸基、羥基如果支持物質(zhì)帶有羧基、磺酸基、羥基等功能團時，在一定的等功能團時，在一定的pHpH值溶液中，它們會值溶液中，它們會電離，使支持物帶負電荷，與支持物相接觸電離，使支持物帶負電荷，與支持物相接觸的溶液的溶液( (通常是水通常是水) )帶正電荷，在電場的作用帶正電荷，在電場的作用下，此溶液層會向負極移動。下，此溶液層會向負極移動。反之，若支持物帶上正電荷，與支持物反之，若支持物帶上正電荷，與支持物相接觸的溶液就帶上負電荷，溶液層會向正相接觸的溶液就帶上負電荷，溶

10、液層會向正極移動。極移動。電滲會對樣品的遷移率造成影響。電滲會對樣品的遷移率造成影響。如果電滲方向與樣品的電泳遷移方向如果電滲方向與樣品的電泳遷移方向一致，樣品的表觀遷移率就加快，如一致，樣品的表觀遷移率就加快，如果二者的方向不一致，樣品的表觀遷果二者的方向不一致，樣品的表觀遷移率就降低。移率就降低。(3) 吸附吸附 支持物吸附溶質(zhì)，會延緩電泳分離。支持物吸附溶質(zhì)，會延緩電泳分離。 在某些情況下，如果它們能選擇性的在某些情況下，如果它們能選擇性的吸附低電泳遷移率的組分，則可以提高吸附低電泳遷移率的組分，則可以提高分離的質(zhì)量。分離的質(zhì)量。(4) 分子篩分離分子篩分離 當采用凝膠如淀粉、聚丙烯酰胺

11、、葡聚糖當采用凝膠如淀粉、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠作支持物，在伸展的凝膠中，其空間屬于凝膠作支持物，在伸展的凝膠中，其空間屬于大分子尺寸，這樣就表現(xiàn)出分子篩的效應。大分子尺寸，這樣就表現(xiàn)出分子篩的效應。相應地，最小的分子透入凝膠結(jié)構(gòu)中，由相應地，最小的分子透入凝膠結(jié)構(gòu)中，由于它們沿著一條非常曲折且較長的路程移動，于它們沿著一條非常曲折且較長的路程移動，所以遷移被延緩。所以遷移被延緩。根據(jù)這一現(xiàn)象，可在樣品組分分離時，調(diào)根據(jù)這一現(xiàn)象，可在樣品組分分離時，調(diào)整諸如凝膠的聚合程度和濃度，孔的尺寸等因整諸如凝膠的聚合程度和濃度，孔的尺寸等因素，就能得到一個高的分辨率。素，就能得到一個高的分辨率。 (5)

12、 (5) 擴散擴散 擴散會影響分離的分辨率，這擴散會影響分離的分辨率，這是因為擴散可使幾個分離的區(qū)帶相是因為擴散可使幾個分離的區(qū)帶相互重疊?；ブ丿B。(6) 緩沖液的性質(zhì)緩沖液的性質(zhì) 分離效果有時取決于所用緩沖液分離效果有時取決于所用緩沖液的性質(zhì)。的性質(zhì)。 例如，對于不帶電荷的蔗糖可用例如，對于不帶電荷的蔗糖可用硼酸緩沖液分離，形成絡合的蔗糖硼酸緩沖液分離，形成絡合的蔗糖硼酸鹽離子。硼酸鹽離子。 10.3 電泳的類型電泳的類型在任何電泳設備中，在任何電泳設備中，都有三個意義明確的都有三個意義明確的部件，陰極、陽極和部件，陰極、陽極和實現(xiàn)帶電粒子分離的實現(xiàn)帶電粒子分離的電泳室。電泳室。根據(jù)在電泳室

13、中使用的電解質(zhì)系根據(jù)在電泳室中使用的電解質(zhì)系統(tǒng)，可以對電泳作如下的分類：統(tǒng)，可以對電泳作如下的分類：自由界面電泳；自由界面電泳；自由溶液中的區(qū)帶電泳；自由溶液中的區(qū)帶電泳；在不同支持物上的區(qū)帶電泳；在不同支持物上的區(qū)帶電泳；在有機溶劑中的凝膠電泳；在有機溶劑中的凝膠電泳；親和電泳；親和電泳；等速電泳；等速電泳；等電聚焦；等電聚焦；免疫電泳。免疫電泳。 一自由界面電泳一自由界面電泳19371937年瑞典科學家年瑞典科學家TiseliusTiselius建立了建立了“移界電泳法移界電泳法(moving boundary EP)(moving boundary EP)”，成功地將血清蛋白質(zhì)分成清蛋白

14、、成功地將血清蛋白質(zhì)分成清蛋白、11、22、和和球蛋白球蛋白5 5個主要成分，由于他個主要成分，由于他的突出貢獻，的突出貢獻，19481948年榮獲諾貝爾獎金。年榮獲諾貝爾獎金。在自由界面電泳中，樣品被放置在在自由界面電泳中，樣品被放置在U U型型電泳管的緩沖溶液中，然后外加電場。電泳管的緩沖溶液中，然后外加電場。 在幾種組分的混合物中，由于不同離子在幾種組分的混合物中，由于不同離子的電量、大小和形狀的不同導致它們在緩沖的電量、大小和形狀的不同導致它們在緩沖液中的移動速度不同，結(jié)果在整個管子中出液中的移動速度不同，結(jié)果在整個管子中出現(xiàn)了不同的分隔界面。現(xiàn)了不同的分隔界面。在一系列的分界范圍中，

15、是以組分的濃在一系列的分界范圍中，是以組分的濃度變化參差而排列的，這樣的濃度梯度可用度變化參差而排列的，這樣的濃度梯度可用一個適宜的光學系統(tǒng)進行測量。一個適宜的光學系統(tǒng)進行測量。 通過整個管子的連續(xù)量析技術(shù)，就可通過整個管子的連續(xù)量析技術(shù)，就可以確定不同界面的位置、數(shù)量以及區(qū)域的以確定不同界面的位置、數(shù)量以及區(qū)域的濃度，因此可用來測量電泳遷移率，進行濃度，因此可用來測量電泳遷移率，進行混合組分的分離和分析等?；旌辖M分的分離和分析等。 自由界面電泳由于儀器裝置復雜、價自由界面電泳由于儀器裝置復雜、價格昂貴，因此只限于實驗室規(guī)模操作。格昂貴，因此只限于實驗室規(guī)模操作。二自由溶液中的區(qū)域電泳二自由溶

16、液中的區(qū)域電泳1微量電泳微量電泳微量電泳是一種基于單個粒微量電泳是一種基于單個粒子受到電場作用時會移動非常小子受到電場作用時會移動非常小的距離的事實來測量帶電粒子遷的距離的事實來測量帶電粒子遷移率的高度專業(yè)化方法。移率的高度專業(yè)化方法。 電泳遷移率可通過電泳遷移率可通過測量一個粒子走過一定測量一個粒子走過一定距離所需的時間來計算距離所需的時間來計算求得。所走的距離可從求得。所走的距離可從顯微鏡目鏡的分度尺上顯微鏡目鏡的分度尺上讀出，可調(diào)節(jié)元件兩端讀出，可調(diào)節(jié)元件兩端間的電位，使測量時間間的電位，使測量時間控制在控制在1010秒左右。秒左右。2自由流動電泳自由流動電泳 這是一種較大規(guī)模的分離帶電

17、粒這是一種較大規(guī)模的分離帶電粒子的方法，與其它電泳方法相比，可子的方法，與其它電泳方法相比，可溶物質(zhì)的分辨溶物質(zhì)的分辨( (例如蛋白質(zhì)例如蛋白質(zhì)) )非常差，非常差，它在細胞分離操作上的主要優(yōu)點是能它在細胞分離操作上的主要優(yōu)點是能很好地保持細胞的存活力。很好地保持細胞的存活力。電泳儀有一個分離槽，電泳儀有一個分離槽，分離的樣品被緩沖溶液圍分離的樣品被緩沖溶液圍著，在槽的頂端一小口中著，在槽的頂端一小口中注入樣品，隨著樣品的移注入樣品，隨著樣品的移動，不同的成分分離成單動，不同的成分分離成單個區(qū)帶按不同的偏斜方向個區(qū)帶按不同的偏斜方向經(jīng)過分離槽，如果樣品不經(jīng)過分離槽，如果樣品不斷地從槽的上端泵入

18、，組斷地從槽的上端泵入，組分沿一系列對角線方向移分沿一系列對角線方向移動，可在另一端不同部位動，可在另一端不同部位上收集到被分離的組分。上收集到被分離的組分。 3密度梯度區(qū)域電泳密度梯度區(qū)域電泳如果區(qū)域電泳是在簡單緩沖液中如果區(qū)域電泳是在簡單緩沖液中進行的，由于被分離區(qū)域的擴散和進行的，由于被分離區(qū)域的擴散和沉降，會發(fā)生分辨率的嚴重下降，沉降，會發(fā)生分辨率的嚴重下降，但利用密度梯度電泳時，這兩種因但利用密度梯度電泳時，這兩種因素產(chǎn)生的影響會大大降低。素產(chǎn)生的影響會大大降低。 密度梯度區(qū)域電泳幾乎總是在密度梯度區(qū)域電泳幾乎總是在垂直柱中進行，典型的蔗糖密度梯垂直柱中進行，典型的蔗糖密度梯度從度從

19、10105050左右，密度梯度越左右，密度梯度越陡斜，阻止對流和樣品區(qū)帶重力沉陡斜，阻止對流和樣品區(qū)帶重力沉降的穩(wěn)定能力越大，所以，樣品承降的穩(wěn)定能力越大，所以，樣品承載能力也越大。載能力也越大。 4葡聚糖凝膠柱上的區(qū)域電泳葡聚糖凝膠柱上的區(qū)域電泳多數(shù)情況下，樣品組分被完全排斥在多數(shù)情況下，樣品組分被完全排斥在葡聚糖凝膠珠體外，因此按大小分級分離葡聚糖凝膠珠體外，因此按大小分級分離沒有發(fā)生，樣品實質(zhì)上在珠體外的溶劑相沒有發(fā)生，樣品實質(zhì)上在珠體外的溶劑相中進行自由溶液電泳，葡聚糖凝膠的作用中進行自由溶液電泳，葡聚糖凝膠的作用只是用來阻止對流只是用來阻止對流( (由于緩沖液黏度不增加，由于緩沖液黏

20、度不增加，所以不會減少擴散所以不會減少擴散) ) 。三在不同支持物上的區(qū)帶電泳三在不同支持物上的區(qū)帶電泳應用支持介質(zhì)的電泳稱為應用支持介質(zhì)的電泳稱為區(qū)帶電區(qū)帶電泳泳，它表示在一個電場的作用下，在，它表示在一個電場的作用下，在某一種支持物上能將一個樣品組成徹某一種支持物上能將一個樣品組成徹底分離成若干條區(qū)帶底分離成若干條區(qū)帶( (組分組分) )的過程。的過程。 根據(jù)支持介質(zhì)不同的分類根據(jù)支持介質(zhì)不同的分類 紙電泳紙電泳( (濾紙、玻璃纖維濾紙、玻璃纖維) )； 醋酸纖維電泳；醋酸纖維電泳； 凝膠電泳凝膠電泳( (瓊脂、瓊脂糖、淀粉、聚丙烯瓊脂、瓊脂糖、淀粉、聚丙烯酰胺等酰胺等) )； 粉末電泳粉

21、末電泳( (淀粉、纖維素、葡聚糖凝膠、淀粉、纖維素、葡聚糖凝膠、聚氯乙烯、玻璃等聚氯乙烯、玻璃等) )。電泳槽的分室中充滿著緩沖液，目的是保持電泳槽的分室中充滿著緩沖液，目的是保持pHpH值在一定范圍內(nèi)，多組分離子性物料樣品常值在一定范圍內(nèi)，多組分離子性物料樣品常置于分室的中心區(qū)內(nèi)。置于分室的中心區(qū)內(nèi)。在一定的電場作用下，所有系統(tǒng)中的離子按在一定的電場作用下，所有系統(tǒng)中的離子按恒定的速度遷移，實現(xiàn)分離，其效果取決于實恒定的速度遷移，實現(xiàn)分離，其效果取決于實驗條件和離子所帶電荷的符號和大小。驗條件和離子所帶電荷的符號和大小。 1濾紙電泳濾紙電泳以濾紙作為帶電質(zhì)點溶液的支持物來以濾紙作為帶電質(zhì)點溶

22、液的支持物來進行的電泳稱為進行的電泳稱為( (濾濾) )紙電泳紙電泳。在化學成分分離鑒定中，紙電泳常常在化學成分分離鑒定中，紙電泳常常與其他層析方法配合使用以達到預期的效與其他層析方法配合使用以達到預期的效果。它除了用做常規(guī)分析方法外，還常用果。它除了用做常規(guī)分析方法外，還常用做對物質(zhì)的帶電特性進行試探性摸索。做對物質(zhì)的帶電特性進行試探性摸索。用醋酸纖維素條帶或塑料薄膜做支持物來進用醋酸纖維素條帶或塑料薄膜做支持物來進行的電泳。行的電泳。醋酸纖維是由纖維素的羥基經(jīng)乙?；?。醋酸纖維是由纖維素的羥基經(jīng)乙酰化而成。將之溶于丙酮等有機溶劑中，將之溶于丙酮等有機溶劑中， 即可涂布成均一即可涂布成均一

23、細密的微孔薄膜，厚度約以細密的微孔薄膜，厚度約以0.1-0.15mm0.1-0.15mm為宜。為宜。太厚吸水性差，分離效果不好；太薄則膜片缺太厚吸水性差，分離效果不好；太薄則膜片缺少應有的機械強度而易碎。少應有的機械強度而易碎。目前，國內(nèi)有醋酸纖維薄膜商品出售。目前，國內(nèi)有醋酸纖維薄膜商品出售。 2 2醋酸纖維素電泳醋酸纖維素電泳醋酸纖維素薄膜與濾紙相比較，有以下優(yōu)點：醋酸纖維素薄膜與濾紙相比較，有以下優(yōu)點：(1)(1)分離效果好。對蛋白質(zhì)樣品吸附極少，無分離效果好。對蛋白質(zhì)樣品吸附極少，無“拖尾拖尾”現(xiàn)象，染色后背景能完全脫色，各種蛋白現(xiàn)象，染色后背景能完全脫色，各種蛋白質(zhì)染色帶分離清晰，因

24、而提高了定量測定的精確性。質(zhì)染色帶分離清晰，因而提高了定量測定的精確性。(2)(2)快速省時。由于親水性較濾紙小，電滲作快速省時。由于親水性較濾紙小，電滲作用小，電泳時大部分電流是由樣品傳導的，所以分用小，電泳時大部分電流是由樣品傳導的，所以分離速度快，電泳時間短，一般電泳離速度快，電泳時間短，一般電泳45-60min45-60min即可，即可，加上染色、脫色，整個電泳完成僅需加上染色、脫色，整個電泳完成僅需90min90min左右。左右。(3)(3)靈敏度高，樣品用量少。血清蛋白電泳僅靈敏度高，樣品用量少。血清蛋白電泳僅需需2L2L血清，故常用于檢測在病理情況下微量異常血清，故常用于檢測在病

25、理情況下微量異常蛋白的改變。蛋白的改變。(4)(4)應用面廣。某些蛋白在紙上電泳不易分離，應用面廣。某些蛋白在紙上電泳不易分離，如胎兒甲種球蛋白、溶菌酶、胰島素、組蛋白等用如胎兒甲種球蛋白、溶菌酶、胰島素、組蛋白等用醋酸纖維素薄膜電泳能較好地分離。醋酸纖維素薄膜電泳能較好地分離。(5)(5)易保存，易定量。醋酸纖維素薄膜電泳染易保存，易定量。醋酸纖維素薄膜電泳染色后，經(jīng)冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡后可色后，經(jīng)冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于掃描定量及長期保存。制成透明的干板，有利于掃描定量及長期保存。由于醋酸纖維素薄膜電泳操作簡單、快速、價由于醋酸纖維素薄膜電泳操

26、作簡單、快速、價廉。目前已廣泛用于分析檢測血漿蛋白、脂蛋白、廉。目前已廣泛用于分析檢測血漿蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎兒甲種球蛋白、酶、多肽、核酸及其他糖蛋白、胎兒甲種球蛋白、酶、多肽、核酸及其他生物大分子。生物大分子。 3瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳利用環(huán)氧丙烷與中性的瓊脂糖進利用環(huán)氧丙烷與中性的瓊脂糖進行聚合可得瓊脂糖凝膠。行聚合可得瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠電泳分辨率高，分離瓊脂糖凝膠電泳分辨率高，分離速度極快、機械強度大，加上操作條速度極快、機械強度大，加上操作條件方便和裝置簡單，所以瓊脂糖凝膠件方便和裝置簡單，所以瓊脂糖凝膠電泳應用面更廣泛。電泳應用面更廣泛。 由于凝膠是透明的，因此可與免由

27、于凝膠是透明的，因此可與免疫法技術(shù)結(jié)合進行免疫電泳和對流免疫法技術(shù)結(jié)合進行免疫電泳和對流免疫電泳。疫電泳。瓊脂糖凝膠不吸收紫外線，給電瓊脂糖凝膠不吸收紫外線，給電泳分離核苷酸同系物泳分離核苷酸同系物ATPATP、ADPADP、AMPAMP帶帶來方便，只要分離完畢，就可直接置來方便，只要分離完畢，就可直接置于紫外光密度掃描儀中定量測定。于紫外光密度掃描儀中定量測定。4淀粉電泳淀粉電泳是以天然淀粉為支持物進行的電泳。是以天然淀粉為支持物進行的電泳。作為天然產(chǎn)品，淀粉的組成是會變化作為天然產(chǎn)品，淀粉的組成是會變化的，直鏈和支鏈淀粉可能占有不同的比例，的，直鏈和支鏈淀粉可能占有不同的比例，從而影響它的

28、凝膠能力和分辨率。因此，從而影響它的凝膠能力和分辨率。因此，對每批原材料應進行預備實驗，以確定淀對每批原材料應進行預備實驗，以確定淀粉的最佳濃度。粉的最佳濃度。5聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)以聚丙烯酰胺為支持介質(zhì)的電泳是目前以聚丙烯酰胺為支持介質(zhì)的電泳是目前分離分子的最好方法。分離分子的最好方法。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑聯(lián)劑N N，N-N-甲叉雙丙烯酰胺在加速劑和催化劑甲叉雙丙烯酰胺在加速劑和催化劑的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為以此凝膠為支持物的電泳稱為聚

29、丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝膠電泳膠電泳( (簡稱簡稱PAGE)PAGE)。PAGEPAGE分離是以物質(zhì)的物理差別、分子大分離是以物質(zhì)的物理差別、分子大小和凈電荷為基礎的，即分離除了利用物質(zhì)小和凈電荷為基礎的，即分離除了利用物質(zhì)所帶電位的差別外，還具有分子篩的特殊作所帶電位的差別外，還具有分子篩的特殊作用，這種性質(zhì)為分開電泳率很相近的大分子用，這種性質(zhì)為分開電泳率很相近的大分子提供了簡單而有效的方法。提供了簡單而有效的方法。 聚丙烯酰胺凝膠有下列優(yōu)點：聚丙烯酰胺凝膠有下列優(yōu)點：(1)(1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好。在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好。(2)(2)化學性能穩(wěn)定

30、，與被分離物不發(fā)生化學反應?；瘜W性能穩(wěn)定，與被分離物不發(fā)生化學反應。(3)(3)對對pHpH和溫度變化較穩(wěn)定。和溫度變化較穩(wěn)定。(4)(4)幾乎無電滲作用，只要丙烯酰胺純度高，操作條件一致，幾乎無電滲作用，只要丙烯酰胺純度高，操作條件一致，則樣品分離重復性好。則樣品分離重復性好。(5)(5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達1010-6-6g g。(6)(6)凝膠孔徑可通過選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)。凝膠孔徑可通過選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)。(7)(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷

31、效應為一體，因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳電荷效應為一體，因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。等有更高的分辨率。PAGEPAGE的缺點是聚合反應必須用高的缺點是聚合反應必須用高純度的試劑在沒有空氣的情況下進行，純度的試劑在沒有空氣的情況下進行，此外丙烯酰胺毒性也很大。此外丙烯酰胺毒性也很大。 PAGEPAGE應用范圍廣，可用于蛋白質(zhì)、應用范圍廣，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，定量及少量的制備， 還可測定相對還可測定相對分子質(zhì)量、等電點等。分子質(zhì)量、等電點等。 聚丙烯酰胺凝膠電泳的種類很聚丙烯酰胺凝膠電泳的種類

32、很多，有不連續(xù)凝膠電泳、制備凝膠多，有不連續(xù)凝膠電泳、制備凝膠電泳、電泳、SDS-SDS-聚丙烯酰胺電泳等。聚丙烯酰胺電泳等。 （1）不連續(xù)凝膠電泳）不連續(xù)凝膠電泳不連續(xù)凝膠電泳按支持物不連續(xù)凝膠電泳按支持物的形式可分為的形式可分為圓盤電泳圓盤電泳( (柱型柱型) )和和垂直板型電泳垂直板型電泳。所謂不連續(xù)是指凝膠的孔所謂不連續(xù)是指凝膠的孔大小、緩沖液成分及其大小、緩沖液成分及其pHpH值均值均為不連續(xù)的，并在電場中形成為不連續(xù)的，并在電場中形成電位梯度的不連續(xù)性，這樣可電位梯度的不連續(xù)性，這樣可使樣品濃縮成一個極窄的起始使樣品濃縮成一個極窄的起始區(qū)帶以提高分辨率。區(qū)帶以提高分辨率。 不連續(xù)圓

33、盤電泳主不連續(xù)圓盤電泳主要特點是在圓柱玻璃要特點是在圓柱玻璃管內(nèi)有三種不連續(xù)的管內(nèi)有三種不連續(xù)的凝膠，大孔徑的樣品凝膠，大孔徑的樣品膠、濃縮膠和小孔徑膠、濃縮膠和小孔徑的分離膠，并通過三的分離膠，并通過三種效應，濃縮效應、種效應，濃縮效應、分子篩效應和電荷效分子篩效應和電荷效應，使物質(zhì)達到高效應，使物質(zhì)達到高效的分離。的分離。 （2）制備凝膠電泳）制備凝膠電泳制備凝膠電泳有兩種方法：制備凝膠電泳有兩種方法：第一種方法，電泳在常規(guī)方法下操第一種方法，電泳在常規(guī)方法下操作，待凝膠上需分離組分分開后，分段作，待凝膠上需分離組分分開后，分段切開并萃取物質(zhì)；切開并萃取物質(zhì)；第二種方法，被分離組分在整個凝

34、第二種方法，被分離組分在整個凝膠柱上移動使分離區(qū)帶從凝膠管下端流膠柱上移動使分離區(qū)帶從凝膠管下端流出，同時用連續(xù)的沖洗緩沖液從外側(cè)將出，同時用連續(xù)的沖洗緩沖液從外側(cè)將各分離區(qū)帶洗脫到分部收集器中。各分離區(qū)帶洗脫到分部收集器中。（3）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，其聚丙烯酰胺凝膠電泳，其主要用途是分離蛋白質(zhì)和測定它的主要用途是分離蛋白質(zhì)和測定它的相對分子質(zhì)量。相對分子質(zhì)量。 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理是陰離子去聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理是陰離子去污劑污劑SDSSDS（十二烷基磺酸鈉）能以一定比例和蛋（十二烷基磺酸鈉）能以一定比例和蛋白

35、質(zhì)結(jié)合并使蛋白質(zhì)分子帶有大量的負電荷，白質(zhì)結(jié)合并使蛋白質(zhì)分子帶有大量的負電荷，大大超過其原來所帶電荷，從而使各天然蛋白大大超過其原來所帶電荷，從而使各天然蛋白質(zhì)分子間的電荷差別下降乃至消除。質(zhì)分子間的電荷差別下降乃至消除。同時蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)也在同時蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)也在SDSSDS作用下變得松散，作用下變得松散，形狀趨于一致，排除了電泳過程中電荷的影響，形狀趨于一致，排除了電泳過程中電荷的影響，使使SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳時，蛋白質(zhì)遷移率聚丙烯酰胺凝膠電泳時，蛋白質(zhì)遷移率的差異僅是相對分子質(zhì)量的函數(shù)。的差異僅是相對分子質(zhì)量的函數(shù)。 （10-9） 式中式中M為相對分子質(zhì)量；為相對分子質(zhì)量；A為

36、為常數(shù)；常數(shù)；K為斜率；為斜率；Rm為遷移率。為遷移率。mKRAMlg由于蛋白質(zhì)結(jié)合由于蛋白質(zhì)結(jié)合SDSSDS的量與蛋白質(zhì)的的量與蛋白質(zhì)的種類有關(guān)，并受溶液種類有關(guān)，并受溶液pHpH值、離子強度和值、離子強度和緩沖液組分的影響，這些因素使相對分緩沖液組分的影響，這些因素使相對分子質(zhì)量的測定產(chǎn)生偏差，所以一般都必子質(zhì)量的測定產(chǎn)生偏差，所以一般都必須用已知相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)作為須用已知相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)作為“指示蛋白指示蛋白”與被測樣品在同一條件下與被測樣品在同一條件下進行電泳，然后標繪出進行電泳，然后標繪出lgM-lgM-R Rm m曲線，求曲線，求出樣品的出樣品的R Rm m值對應的值對應的lgMlgM值，計算出被測值，計算出被測樣品的相對分子質(zhì)量。樣品的相對分子質(zhì)量。 四等電聚焦四等電聚焦等電聚焦等電聚焦簡稱電聚焦，是簡稱電聚焦，是2020世紀世紀6060年代后期發(fā)展起來的新技術(shù)，也是一種年代后期發(fā)展起來的新技術(shù)，也是一種依據(jù)凈電荷的