氨基酸的分析分離 為了測(cè)定蛋白質(zhì)中氨基酸的含量、組成或從蛋

1、 氨基酸的分析分離 為了測(cè)定蛋白質(zhì)中氨基酸的含量、組成或從蛋白質(zhì)水解液中制取氨基酸，都需要對(duì)氨基酸混合物進(jìn)行分析和分離工作。其方法較多，而目前使用較多的是層析法。（1）分配層析的一般原理：所有的層析系統(tǒng)都有兩個(gè)相組成，一個(gè)為固定相或靜相（stationary phase），一個(gè)為流動(dòng)相或動(dòng)相（mobile phase）。混合物在兩相中的分離決定于混合物的組分在這兩相中的分配情況，一般用分配系數(shù)（ partition or distribution coefficient）來(lái)描述：當(dāng)一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中進(jìn)行分配時(shí)，在一定溫度下達(dá)到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比值為一常數(shù)，即分配系數(shù)（Kd

2、）。用下式表示： CA 表示某一物質(zhì)在動(dòng)相中的濃度 Kd= CB 表示某一物質(zhì)在靜相中的濃度 物質(zhì)分配不僅可以在互不相溶的兩種溶劑即液相-液相系統(tǒng)中進(jìn)行，也可在固相-液相或氣相-液相間發(fā)生。其系統(tǒng)中的靜相可以是固相、液相或固-液混合相（半液體相）；動(dòng)相可以是液相或氣相，它充滿于靜相的空隙中，并能流過(guò)靜相。 在實(shí)際層析時(shí)，其層析行為一般并不直接決定于它的分配系數(shù)，而是取決于有效分配系數(shù)Keffo： 某一物質(zhì)在A相中的總量 Keffo= 某一物質(zhì)在B相中的總量對(duì)液相-液相層析系統(tǒng)來(lái)說(shuō)： CAVA Keffo = = KdRV CBVB這里，CA和CB的意義同前；VA和VB分別為A相B相的體積；RV

3、為A、B兩相的體積比。由此可見(jiàn)， Keffo 是RV的函數(shù)，溶質(zhì)的有效分配系數(shù)可以調(diào)整兩相的體積比而加以改變。 利用層析法分離混合氨基酸，其先決條件是各種氨基酸成分的分配系數(shù)要有差異，哪怕是很小的差異。一般差異越大，越容易分開(kāi)。 若是逆流分溶或逆流分配，當(dāng)轉(zhuǎn)移n次后，某一物質(zhì)在（n+1）個(gè)管中分布的分?jǐn)?shù)含量是（p+q)n=1展開(kāi)式的相應(yīng)項(xiàng)的值。這里p和q分別為某一物質(zhì)在靜相和動(dòng)相中的分?jǐn)?shù)含量，即p+q=1。例如物質(zhì)Y的 Kd=q(動(dòng)相)/(靜相)p=1 即: p+q=1/2+1/2=1轉(zhuǎn)移n次后,在第k號(hào)管中某一物質(zhì)的含量可由下式計(jì)算: n！ pn-k+1 qk-1 Tn,k= （n-k+1）

4、?。╧-1）！怎么辦？例題：當(dāng)某一物質(zhì)在一個(gè)層析系統(tǒng)中的分配系數(shù)為3時(shí)，物質(zhì)被轉(zhuǎn)移4次后在第四管中的含量是多少？解：根據(jù)分配系數(shù)公式可知： p+q=1/4+3/4=1，即在靜相中的分?jǐn)?shù)含量為1/4，在動(dòng)相中的分?jǐn)?shù)含量3/4，則可由上述公式計(jì)算如下： 4！1/4 （3/4)3 T4,4=27/64 3！假若該物質(zhì)的總量為96，則該管中的含量應(yīng)為：（27/64） 96=40.56461813123641216486481616161632329271688816逆流分溶原理分配系數(shù)為1分配系數(shù)為3上相為動(dòng)相（A），下相為靜相（B） 2 4 6 8 10 12 14 16 管號(hào)302010Kd=1K

5、d=3管中物質(zhì)的總量分溶曲線結(jié)論：分配系數(shù)大的物質(zhì)沿一系列分溶管的移動(dòng)速度快與分配系數(shù)小的物質(zhì)n=600n=100n=10相對(duì)濃度溶劑系統(tǒng)體積 分溶曲線與轉(zhuǎn)移次數(shù)（理論板數(shù)）的依賴關(guān)系(2)分配柱層析 層析柱中的填充劑或支持劑都是一些具有親水性的不溶物質(zhì)，如纖維素、淀粉、硅膠等。支持劑表面附著一層不會(huì)流動(dòng)的結(jié)合水作為固定相，沿固定相流過(guò)的與它互不相溶的溶劑（如苯酚、正丁醇等）是流動(dòng)相。由填充劑構(gòu)成的柱床可以設(shè)想為由無(wú)數(shù)的連續(xù)的板層組成，每一板層起著微觀的“分溶管”作用。當(dāng)用洗脫劑洗脫時(shí)，在柱上端的氨基酸混合物在兩相之間按不同的分配系數(shù)進(jìn)行連續(xù)不斷的進(jìn)行分配移動(dòng)。分部收集層析柱下端的洗脫液，然后

6、分別用茚三酮顯色定量，以氨基酸量對(duì)洗脫液體積作圖得洗脫曲線，曲線中的每個(gè)峰相當(dāng)于某一種氨基酸。加洗脫劑氨基酸樣品支持劑層析柱分部收集1.00.50.1光吸收值 20 40 60 80 100 120 流出液（毫升）（3）濾紙層析 濾紙層析也是分配層析的一種。這里的濾紙纖維素吸附水作為固定相，展層用的溶劑是流動(dòng)相。層析時(shí)，混合氨基酸在這兩相中不斷分配，使它們分布在濾紙的不同位置上。 層析時(shí)，將樣品點(diǎn)在濾紙的一個(gè)角上，稱為原點(diǎn)。然后將其放入一個(gè)密閉的容器中，用一種溶劑系統(tǒng)進(jìn)行展層，層析后烘干濾紙，再將其旋轉(zhuǎn)90度采用第二種溶劑系統(tǒng)進(jìn)行第二相展層。由于各種氨基酸在兩個(gè)不同的溶劑系統(tǒng)中具有不同的遷移率

7、（ Rf ），因此它們就會(huì)彼此分開(kāi)，當(dāng)用茚三酮顯色時(shí)，就會(huì)在濾紙上面出現(xiàn)各種氨基酸的斑點(diǎn)。當(dāng)然，若氨基酸種類(lèi)較少或一相就能分開(kāi)，進(jìn)行一相層析即可。 溶劑前沿氨基酸顯色點(diǎn)濾紙?jiān)c(diǎn)XY濾紙層析中的Rf值， Rf =X/Y丁醇-醋酸酚-甲酚-水氨基酸的雙向?yàn)V紙層析圖譜（4）薄層層析（thin-layer chromatography)：該層析分辨率高，需量極少，層析速度快，可使用的支持劑種類(lèi)多，如纖維素粉、硅膠、氧化鋁等。其步驟大體如下：把支持物涂布在玻璃板上使其成為一個(gè)均勻的薄層，把要分析的樣品滴加在薄層的一端，然后用合適的溶劑在密閉的容器中進(jìn)行展層，使樣品中各個(gè)成分分開(kāi)，最后進(jìn)行鑒定和定量分析。

8、蓋子層析缸溶劑薄層板（側(cè)面）薄層層析裝置（5）離子交換層析（ion-exchange column chromatography) 這是一種用離子交換樹(shù)脂作支持劑的層析法。離子交換樹(shù)脂是具有酸性或堿性基團(tuán)的人工合成的聚苯乙烯-苯二乙烯等不溶性的高分子化合物。聚苯乙烯-苯二乙烯是由苯乙烯（單體）和苯二乙烯（交聯(lián)劑）進(jìn)行聚合和交聯(lián)反應(yīng)生成的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高聚物。它是離子交換樹(shù)脂的基質(zhì)，帶電基團(tuán)是通過(guò)后來(lái)的反應(yīng)引入基質(zhì)的，樹(shù)脂一般都制成球形顆粒。 CH2CH2CHCH2CH2CHSO3 CH CH2CH2CH苯環(huán)SO3有氫型和鈉型H+或Na+H+或Na+樹(shù)脂分陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂。陽(yáng)離子交

9、換樹(shù)脂含有的酸性基團(tuán)如SO3H（強(qiáng)酸型）或COOH（弱酸型）可解離出H+離子，當(dāng)溶液中含有其它陽(yáng)離子時(shí)，例如酸性環(huán)境中的氨基酸陽(yáng)離子，它們可以和H+發(fā)生交換而結(jié)合在樹(shù)脂上。同樣地陰離子交換樹(shù)脂含有的堿性基團(tuán)如N（CH3）3OH（強(qiáng)堿型）或NH3OH（弱堿型）可解離出OH-，它能和溶液中的陰離子如堿型環(huán)境中的氨基酸陰離子發(fā)生交換而結(jié)合在樹(shù)脂上。 氨基酸在樹(shù)脂上結(jié)合的牢固程度即氨基酸與樹(shù)脂的親和力，主要決定于：它們之間的靜電引力；氨基酸側(cè)鏈與樹(shù)脂基質(zhì)聚苯乙烯之間的疏水相互作用。在PH為3左右的氨基酸與陽(yáng)離子交換樹(shù)脂之間的靜電引力的大小次序是堿性氨基酸（R2+）大于中性氨基酸（R+），后者又大于酸型

10、氨基酸（R0）。因此，氨基酸的洗脫順序大體上是酸性氨基酸、中性氨基酸和堿性氨基酸。但有時(shí)并不是這樣，這是因?yàn)槟承┌被岷蜆?shù)脂之間還存在著疏水作用。 為了使氨基酸從樹(shù)脂上洗脫下來(lái)，需要降低它們之間的親和力，有效的方法是逐步提高洗脫劑的PH和鹽濃度（離子強(qiáng)度），這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來(lái)。（6）氣相色譜 當(dāng)層析系統(tǒng)的流動(dòng)相為氣體，固定相為涂漬在固體顆粒表面的液體時(shí)，此層析技術(shù)稱為氣-液色譜（gas-liquid chromatography）或簡(jiǎn)稱為氣相色譜。它是利用樣品組分在流動(dòng)的氣相和固定在顆粒表面的液相中的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離組分的目的。 氣相色譜需要?dú)庀嗌V儀進(jìn)行。 氣相色譜

11、具有微量快速的優(yōu)點(diǎn)。（7）高效液相色譜（high performance liquid chromatography，簡(jiǎn)稱HPLC）：這是近十幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種快速、靈敏、高效的分離技術(shù)。 HPLC的特點(diǎn)是：使用的固定相支持劑顆粒很細(xì)，因而表面積很大；溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。因此多種類(lèi)型的柱層析都可用HPLC來(lái)代替，例如分配層析、離子交換層析、吸附層析以及凝膠過(guò)濾等。 蛋白質(zhì)性質(zhì)鑒定蛋白質(zhì)性質(zhì)鑒定 1 1 蛋白質(zhì)分子量測(cè)定蛋白質(zhì)分子量測(cè)定 DSD-DSD-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 凝膠排阻層析凝膠排阻層析 電噴質(zhì)譜電噴質(zhì)譜 核磁共振核磁共振 2 2 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定

12、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定 聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳 PBE-SepharosePBE-Sepharose聚焦層析聚焦層析1 1概述概述1.11.1什么是蛋白質(zhì)性質(zhì)鑒定什么是蛋白質(zhì)性質(zhì)鑒定蛋白質(zhì)分析鑒定是蛋白質(zhì)研究中的一個(gè)最基本技術(shù)蛋白質(zhì)分析鑒定是蛋白質(zhì)研究中的一個(gè)最基本技術(shù), ,是確定是確定蛋白質(zhì)產(chǎn)品的是與非的問(wèn)題蛋白質(zhì)產(chǎn)品的是與非的問(wèn)題, ,尤其是在研究新的蛋白質(zhì)組分尤其是在研究新的蛋白質(zhì)組分時(shí)顯得更重要。研究一個(gè)新的蛋白質(zhì)首先要從它的基本性時(shí)顯得更重要。研究一個(gè)新的蛋白質(zhì)首先要從它的基本性質(zhì)作為突破口，然后根據(jù)它的基本性質(zhì)進(jìn)行分離純化，最質(zhì)作為突破口，然后根據(jù)它的基本

13、性質(zhì)進(jìn)行分離純化，最終用純品對(duì)其進(jìn)行分析鑒定。如果對(duì)蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)尚終用純品對(duì)其進(jìn)行分析鑒定。如果對(duì)蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)尚未搞清楚，工作起來(lái)將會(huì)困難重重。因此，蛋白質(zhì)研究技未搞清楚，工作起來(lái)將會(huì)困難重重。因此，蛋白質(zhì)研究技術(shù)主要是對(duì)蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)的進(jìn)行分析鑒定。術(shù)主要是對(duì)蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)的進(jìn)行分析鑒定。1.21.2蛋白質(zhì)鑒定的主要參數(shù)蛋白質(zhì)鑒定的主要參數(shù)蛋白質(zhì)分子是非常復(fù)雜的生物大分子蛋白質(zhì)分子是非常復(fù)雜的生物大分子, ,能代表其特征參數(shù)很多能代表其特征參數(shù)很多. .但在但在普通實(shí)驗(yàn)室能夠進(jìn)行測(cè)定的、最常用的參數(shù)，歸納起來(lái)主要有以下普通實(shí)驗(yàn)室能夠進(jìn)行測(cè)定的、最常用的參數(shù)，歸納起來(lái)主要有以下幾種

14、。幾種。(1)(1)蛋白質(zhì)的質(zhì)量鑒定蛋白質(zhì)的質(zhì)量鑒定( (分子量分子量) )(2)(2)蛋白質(zhì)帶電性鑒定（等電點(diǎn)）蛋白質(zhì)帶電性鑒定（等電點(diǎn)）(3)(3)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定( (一、二級(jí)結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)、肽譜、一、二級(jí)結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)、肽譜、N N和和C-C-末端末端) )(4)(4)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能鑒定蛋白質(zhì)生物學(xué)功能鑒定( (生物活性、比活、酶促動(dòng)力學(xué)生物活性、比活、酶促動(dòng)力學(xué)) )( (5)5)免疫學(xué)鑒定（抗原免疫學(xué)鑒定（抗原- -抗體反應(yīng)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)）抗體反應(yīng)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)） 2 2蛋白質(zhì)鑒定方法蛋白質(zhì)鑒定方法 蛋白質(zhì)可鑒定的參數(shù)很多，這里主要介紹蛋白質(zhì)的分子量和等電蛋白質(zhì)可鑒定

15、的參數(shù)很多，這里主要介紹蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)兩個(gè)主要參數(shù)。點(diǎn)兩個(gè)主要參數(shù)。2.12.1蛋白質(zhì)分子量測(cè)定蛋白質(zhì)分子量測(cè)定 早期測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法是采用超速離心和光散射等方法。早期測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法是采用超速離心和光散射等方法。由于這些方法需要高級(jí)的精密儀器設(shè)備和大量的蛋白樣品才能進(jìn)行由于這些方法需要高級(jí)的精密儀器設(shè)備和大量的蛋白樣品才能進(jìn)行測(cè)定，所以目前采用的不多了。測(cè)定，所以目前采用的不多了。 自從葡聚糖凝膠層析介質(zhì)自從葡聚糖凝膠層析介質(zhì)(Sephadex G(Sephadex G系列產(chǎn)品系列產(chǎn)品) )及排阻層析技術(shù)及排阻層析技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，就被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分子量測(cè)定。它是目前實(shí)

16、驗(yàn)室問(wèn)世以來(lái)，就被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分子量測(cè)定。它是目前實(shí)驗(yàn)室測(cè)定白質(zhì)分子量常用技術(shù)之一。但是這種層析介質(zhì)剛性較差，在層測(cè)定白質(zhì)分子量常用技術(shù)之一。但是這種層析介質(zhì)剛性較差，在層析過(guò)程流速較慢，分離時(shí)間長(zhǎng)。析過(guò)程流速較慢，分離時(shí)間長(zhǎng)。 近年來(lái)又研究出剛性的耐壓的凝膠層析介質(zhì)，被用于高效液相近年來(lái)又研究出剛性的耐壓的凝膠層析介質(zhì)，被用于高效液相色譜。大大的提高了工作效率和測(cè)定精度。色譜。大大的提高了工作效率和測(cè)定精度。 隨著聚丙烯酰胺凝膠電泳的出現(xiàn)和發(fā)展，隨著聚丙烯酰胺凝膠電泳的出現(xiàn)和發(fā)展，DSD-PAGEDSD-PAGE電泳成了常電泳成了常用的方法。從用的方法。從9090年代初期隨著毛細(xì)管電泳

17、的出現(xiàn)，應(yīng)用毛細(xì)管電泳年代初期隨著毛細(xì)管電泳的出現(xiàn)，應(yīng)用毛細(xì)管電泳無(wú)膠篩分技術(shù)來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)分子量，是一種較好的選擇。無(wú)膠篩分技術(shù)來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)分子量，是一種較好的選擇。 蛋白質(zhì)氨基酸測(cè)序技術(shù)，質(zhì)譜技術(shù)和核磁共振波譜技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)氨基酸測(cè)序技術(shù)，質(zhì)譜技術(shù)和核磁共振波譜技術(shù)的發(fā)展，給蛋白質(zhì)分子量測(cè)定技術(shù)增添了新的途徑。尤其是采用電噴質(zhì)譜測(cè)給蛋白質(zhì)分子量測(cè)定技術(shù)增添了新的途徑。尤其是采用電噴質(zhì)譜測(cè)定蛋白質(zhì)分子量，既快捷有準(zhǔn)確。該技術(shù)在生物領(lǐng)域應(yīng)用越來(lái)越廣，定蛋白質(zhì)分子量，既快捷有準(zhǔn)確。該技術(shù)在生物領(lǐng)域應(yīng)用越來(lái)越廣，是一種快速精確的好方法。是一種快速精確的好方法。 蛋白質(zhì)的分子量測(cè)定技術(shù)歸納起來(lái)大致

18、分三大類(lèi)電泳技術(shù)，層蛋白質(zhì)的分子量測(cè)定技術(shù)歸納起來(lái)大致分三大類(lèi)電泳技術(shù)，層析技術(shù)，光譜分析技術(shù)。析技術(shù)，光譜分析技術(shù)。2.1.1 SDS-2.1.1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定法聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定法 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，也稱為十二烷基酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，也稱為十二烷基酸鈉- -聚聚丙烯酰胺凝膠電泳丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)polyacrylamide gel electrophoresis

19、, SDS-PAGE)。主要用于蛋白質(zhì)亞基分子量的測(cè)定。它具有操作簡(jiǎn)單，主要用于蛋白質(zhì)亞基分子量的測(cè)定。它具有操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，對(duì)樣品的純度要求不高等特點(diǎn)，是目前使用重復(fù)性好，對(duì)樣品的純度要求不高等特點(diǎn)，是目前使用較為廣泛的測(cè)定蛋白質(zhì)亞基分子量的一種方法。較為廣泛的測(cè)定蛋白質(zhì)亞基分子量的一種方法。 (1)(1)原理：原理：a.a.蛋白質(zhì)分子狀態(tài)蛋白質(zhì)分子狀態(tài)在自然狀態(tài)下蛋白質(zhì)通過(guò)二硫鍵聚合形成高度折疊的生物大分子，在自然狀態(tài)下蛋白質(zhì)通過(guò)二硫鍵聚合形成高度折疊的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸殘基的解離作用使蛋白質(zhì)分子形成帶有一在水溶液中，由于氨基酸殘基的解離作用使蛋白質(zhì)分子形成帶有一定凈電

20、荷的分子。在電場(chǎng)下向自身電荷相反的方向移動(dòng)。定凈電荷的分子。在電場(chǎng)下向自身電荷相反的方向移動(dòng)。b. b. 還原劑的解聚作用還原劑的解聚作用 在蛋白溶液和分離凝膠介質(zhì)中加入還原劑在蛋白溶液和分離凝膠介質(zhì)中加入還原劑 - -巰基乙醇巰基乙醇( ( - mercaptoethanol)- mercaptoethanol)或二硫蘇糖醇或二硫蘇糖醇(Dithiothretiol, (Dithiothretiol, DTT)DTT)。蛋白質(zhì)分子在還原劑作用下二硫鍵被還原，將多聚。蛋白質(zhì)分子在還原劑作用下二硫鍵被還原，將多聚體或單鏈折疊的蛋白質(zhì)分子的二硫鍵打開(kāi)，形成長(zhǎng)短不一體或單鏈折疊的蛋白質(zhì)分子的二硫鍵打

21、開(kāi)，形成長(zhǎng)短不一的單鏈亞基。的單鏈亞基。c. SDSc. SDS的包裹作用的包裹作用 SDSSDS分子中含有大量的帶負(fù)電的磺酸基。蛋白質(zhì)分子解聚后形成分子中含有大量的帶負(fù)電的磺酸基。蛋白質(zhì)分子解聚后形成的氨基酸側(cè)鏈與的氨基酸側(cè)鏈與SDSSDS結(jié)合，在結(jié)合，在SDSSDS的重量達(dá)到蛋白重量的的重量達(dá)到蛋白重量的3-43-4倍時(shí)蛋倍時(shí)蛋白質(zhì)分子表面完全被白質(zhì)分子表面完全被SDSSDS包裹，形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)亞基分子，包裹，形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)亞基分子，稱之為蛋白質(zhì)稱之為蛋白質(zhì)-SDS-SDS復(fù)合物復(fù)合物( protein-SDS micelles)( protein-SDS micelles)。

22、由于蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)- -SDSSDS復(fù)合物所帶負(fù)電荷遠(yuǎn)大于蛋白質(zhì)分子自身有的凈電荷，這樣就復(fù)合物所帶負(fù)電荷遠(yuǎn)大于蛋白質(zhì)分子自身有的凈電荷，這樣就消除了不同分子之間原有的電荷差異。蛋白質(zhì)消除了不同分子之間原有的電荷差異。蛋白質(zhì)-SDS-SDS復(fù)合物在水溶液復(fù)合物在水溶液中的形狀象一個(gè)長(zhǎng)橢圓棒。這種棒狀物的長(zhǎng)短與亞基的分子量大小中的形狀象一個(gè)長(zhǎng)橢圓棒。這種棒狀物的長(zhǎng)短與亞基的分子量大小成正比。在電場(chǎng)下，蛋白質(zhì)成正比。在電場(chǎng)下，蛋白質(zhì)-SDS-SDS復(fù)合物就會(huì)向正極移動(dòng)，移動(dòng)的速?gòu)?fù)合物就會(huì)向正極移動(dòng)，移動(dòng)的速度與蛋白質(zhì)本身帶是什麼樣的電荷和帶多少電荷無(wú)關(guān)，只與橢圓棒度與蛋白質(zhì)本身帶是什麼樣的電荷

23、和帶多少電荷無(wú)關(guān)，只與橢圓棒狀的長(zhǎng)短有關(guān)，也就是與亞基的分子量的大小有關(guān)，利用這一性質(zhì)狀的長(zhǎng)短有關(guān)，也就是與亞基的分子量的大小有關(guān)，利用這一性質(zhì)可以測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量?？梢詼y(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。d. d. 聚丙烯酰胺凝膠分子篩作用聚丙烯酰胺凝膠分子篩作用 不同濃度的凝膠和交聯(lián)度，形成不同大小的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，它對(duì)蛋白不同濃度的凝膠和交聯(lián)度，形成不同大小的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，它對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)-SDS-SDS復(fù)合物具有阻滯作用。在電場(chǎng)下，分子量大的亞基受阻大，復(fù)合物具有阻滯作用。在電場(chǎng)下，分子量大的亞基受阻大，電泳速度慢，走在小分子的后面；分子量小的亞基受阻小，電泳速電泳速度慢，走在小分子的后面；分子量小的亞基受阻小，

24、電泳速度快，走在大分子的前面。不同分子量的亞基受阻程度不同，表現(xiàn)度快，走在大分子的前面。不同分子量的亞基受阻程度不同，表現(xiàn)出不同的電泳速度，這樣就把同一樣品中不同大小分子量的亞基分出不同的電泳速度，這樣就把同一樣品中不同大小分子量的亞基分開(kāi)。開(kāi)。 (2)(2)操作過(guò)程操作過(guò)程制膠制膠 加樣加樣 電泳電泳 固定固定 染色染色 脫色脫色 計(jì)算計(jì)算(3)(3)結(jié)果處理結(jié)果處理a. a. 電泳圖譜電泳圖譜1 2 3b. b. 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)log(M)log(M)為縱坐標(biāo)，為縱坐標(biāo)，RfRf值值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。為橫坐

25、標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。44.24.44.64.855.200.20.40.60.81mRlgMr兔肌動(dòng)蛋白牛血清白蛋白兔磷酸化酶牛碳酸酐酶胰蛋白酶抑制劑雞蛋清溶菌酶c.c.未知蛋白分子量計(jì)算：未知蛋白分子量計(jì)算： 將未知蛋白的將未知蛋白的mRmR值查到值查到log(M)log(M)值，便可知其分子量。計(jì)算分子量值，便可知其分子量。計(jì)算分子量方法除了用標(biāo)準(zhǔn)曲線法外方法除了用標(biāo)準(zhǔn)曲線法外, ,還可以用比較法和機(jī)讀法還可以用比較法和機(jī)讀法. .比較法比較法: : 通常標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)位置與未知蛋白的位置進(jìn)行比較，初步判通常標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)位置與未知蛋白的位置進(jìn)行比較，初步判斷。這是在發(fā)表論文時(shí)常用的表示方法

26、。斷。這是在發(fā)表論文時(shí)常用的表示方法。機(jī)讀法：機(jī)讀法： 用凝膠掃描儀用凝膠掃描儀, ,將凝膠圖譜掃描輸入計(jì)算機(jī)中，通過(guò)影像文件系將凝膠圖譜掃描輸入計(jì)算機(jī)中，通過(guò)影像文件系統(tǒng)處理，便很快得知未知樣品的分子量。但發(fā)表論文時(shí)統(tǒng)處理，便很快得知未知樣品的分子量。但發(fā)表論文時(shí), ,仍然要注仍然要注重原始圖譜，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理的圖譜有作假之嫌。重原始圖譜，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理的圖譜有作假之嫌。(4)(4)影響因素影響因素 影響影響SDS-SDS-復(fù)合物形成的主要因素。復(fù)合物形成的主要因素。SDS-SDS-電泳成敗關(guān)之一，是在電泳成敗關(guān)之一，是在制備樣品的過(guò)程中，蛋白質(zhì)與制備樣品的過(guò)程中，蛋白質(zhì)與SDSSDS結(jié)合的程度

27、直接影響電泳分離效結(jié)合的程度直接影響電泳分離效果。影響結(jié)合的因素主要有三個(gè)果。影響結(jié)合的因素主要有三個(gè): :A A、溶液中溶液中SDSSDS單體的濃度單體的濃度 SDSSDS在水溶液中以單體和在水溶液中以單體和SDSSDS復(fù)合物混合存在的，能與蛋白質(zhì)結(jié)復(fù)合物混合存在的，能與蛋白質(zhì)結(jié)合的只能是單體。單體的濃度與合的只能是單體。單體的濃度與SDSSDS總濃度，溫度和離子強(qiáng)度有關(guān)?？倽舛?，溫度和離子強(qiáng)度有關(guān)。在一定溫度和離子強(qiáng)度下，在一定溫度和離子強(qiáng)度下，SDSSDS處于一飽和值，即單體濃度不再隨處于一飽和值，即單體濃度不再隨SDSSDS中濃度增加而增加。為了使中濃度增加而增加。為了使SDSSDS與

28、蛋白質(zhì)結(jié)合充分，與蛋白質(zhì)結(jié)合充分，SDSSDS和蛋白和蛋白質(zhì)結(jié)合的重量比一般是質(zhì)結(jié)合的重量比一般是4:14:1或或3:13:1。B B、樣品緩沖液離子強(qiáng)度樣品緩沖液離子強(qiáng)度 因?yàn)橐驗(yàn)镾DSSDS結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的量取決于平衡時(shí)結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的量取決于平衡時(shí)SDSSDS單體濃度，單體濃度，而不是總濃度，只有在較低的離子強(qiáng)度溶液中，而不是總濃度，只有在較低的離子強(qiáng)度溶液中，SDSSDS單體才具有較單體才具有較高的平衡濃度，所以樣品緩沖液應(yīng)選用低離子強(qiáng)度，通常是高的平衡濃度，所以樣品緩沖液應(yīng)選用低離子強(qiáng)度，通常是10-10-100mmol/l100mmol/l之間。之間。C C、二硫鍵是否完全

29、打開(kāi)二硫鍵是否完全打開(kāi) 只有蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵完全被打開(kāi)，蛋白質(zhì)分子完全解聚，只有蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵完全被打開(kāi)，蛋白質(zhì)分子完全解聚，SDSSDS充分與亞基分子結(jié)合，才能準(zhǔn)確測(cè)定出亞基分子量。二硫鍵完充分與亞基分子結(jié)合，才能準(zhǔn)確測(cè)定出亞基分子量。二硫鍵完全被打開(kāi)要取決于巰基乙醇的質(zhì)量和使用的劑量。若蛋白質(zhì)分子的全被打開(kāi)要取決于巰基乙醇的質(zhì)量和使用的劑量。若蛋白質(zhì)分子的二硫鍵只是部分被打開(kāi)，這是測(cè)出的分子量是蛋白質(zhì)分子和亞基分二硫鍵只是部分被打開(kāi)，這是測(cè)出的分子量是蛋白質(zhì)分子和亞基分子的混合物。子的混合物。2.1.22.1.2凝膠排阻層析凝膠排阻層析(1)(1)原理：原理： 凝膠排阻色譜凝膠排

30、阻色譜( Exclusion chromatography)( Exclusion chromatography)，也稱為分子篩層，也稱為分子篩層析、凝膠過(guò)濾層析。凝膠排阻色譜介質(zhì)是以不同濃度的凝膠交聯(lián)聚析、凝膠過(guò)濾層析。凝膠排阻色譜介質(zhì)是以不同濃度的凝膠交聯(lián)聚合而成的多孔徑的，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的球體。在色譜柱內(nèi)不同大小凝膠的合而成的多孔徑的，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的球體。在色譜柱內(nèi)不同大小凝膠的孔徑可以通過(guò)不同大小的蛋白質(zhì)分子。因此，凝膠排阻色譜介質(zhì)對(duì)孔徑可以通過(guò)不同大小的蛋白質(zhì)分子。因此，凝膠排阻色譜介質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)分子具有排阻作用。在凝膠排阻色譜分離的分離過(guò)程中，大蛋白質(zhì)分子具有排阻作用。在凝膠排阻色譜分離的分離

31、過(guò)程中，大分子先流出，小分子后流出。分子先流出，小分子后流出。(2)(2)蛋白質(zhì)分子形狀：蛋白質(zhì)分子形狀： 蛋白質(zhì)分子一般有兩種形狀，一種是球形分子，另一種是線性蛋白質(zhì)分子一般有兩種形狀，一種是球形分子，另一種是線性分子。在色譜過(guò)程中，大分子不能進(jìn)入或不能完全進(jìn)入凝膠內(nèi)部孔分子。在色譜過(guò)程中，大分子不能進(jìn)入或不能完全進(jìn)入凝膠內(nèi)部孔徑而沿凝膠顆粒之間的空隙向前移動(dòng)，遷移距離短，最先流出柱外徑而沿凝膠顆粒之間的空隙向前移動(dòng)，遷移距離短，最先流出柱外來(lái)。小分子可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部孔徑慢慢向前移動(dòng)，遷移距離長(zhǎng)，最來(lái)。小分子可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部孔徑慢慢向前移動(dòng)，遷移距離長(zhǎng)，最后流出柱外來(lái)。線性蛋白質(zhì)分子與球形分

32、子比較，同樣大小分子量后流出柱外來(lái)。線性蛋白質(zhì)分子與球形分子比較，同樣大小分子量的蛋白質(zhì)，線性分子體積大流速快，球形分子體積小流速慢。因此，的蛋白質(zhì)，線性分子體積大流速快，球形分子體積小流速慢。因此，在凝膠色譜柱中無(wú)論是球形分子還是線性分子都可進(jìn)行分離，但是在凝膠色譜柱中無(wú)論是球形分子還是線性分子都可進(jìn)行分離，但是球形分子比線性分子的分離度好。球形分子比線性分子的分離度好。(3) (3) 凝膠層析介質(zhì)凝膠層析介質(zhì) 凝膠層析介質(zhì)主要有五類(lèi)凝膠層析介質(zhì)主要有五類(lèi)Sephadex, BioSephadex, Bio gel, Sepharose, gel, Sepharose, utrol gel,

33、 perfusonutrol gel, perfuson等。等。A A、葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠(Sephadex)(Sephadex) 葡聚糖凝膠是以葡聚糖為原料合成的珠狀凝膠，其主要技術(shù)指標(biāo)葡聚糖凝膠是以葡聚糖為原料合成的珠狀凝膠，其主要技術(shù)指標(biāo)介質(zhì)規(guī)格介質(zhì)規(guī)格溶脹體積溶脹體積(ml/mg)球形分子量范圍球形分子量范圍(Da)Sephardex G-102-3700Sephardex G-2541000-5000Sephardex G-5061500-30000Sephardex G-75103000-80000Sephardex G-10015-204000-100000Sephardex

34、G-20020-255000-250000 后面的阿拉伯?dāng)?shù)字越大，表示交聯(lián)越小，凝膠孔徑越大，分子量后面的阿拉伯?dāng)?shù)字越大，表示交聯(lián)越小，凝膠孔徑越大，分子量分離范圍越大。凝膠的溶脹體積。分離范圍越大。凝膠的溶脹體積。 凝膠性能：凝膠性能： 耐高溫耐高溫100 沸水煮沸水煮 pH范圍范圍pH2 11穩(wěn)定穩(wěn)定 在高鹽濃度下體積易收縮在高鹽濃度下體積易收縮B B、聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠(Boi(Boi gel)gel) Bio Bio gelgel是由丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)制成的球狀凝膠色是由丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)制成的球狀凝膠色譜介質(zhì)。根據(jù)溶脹性質(zhì)可分譜介質(zhì)。根據(jù)溶脹性質(zhì)可分Bi

35、oBio gel gel 、P P 2 2、P P 4 4 P P 300300等等1010種。種。其主要技術(shù)指標(biāo)是：其主要技術(shù)指標(biāo)是：介質(zhì)規(guī)格介質(zhì)規(guī)格溶脹體積溶脹體積(ml/mg)球形分子量范圍球形分子量范圍(Da)Bio-gel P-23.8200-2000Bio-gel P-45.8500-4000Bio-gel P-68.81000-5000Bio-gel P-1012.45000-17000Bio-gel P-3014.920000-50000Bio-gel P-6019.030000-70000Bio-gel P-10019.040000-100000Bio-gel P-15024

36、.050000-150000Bio-gel P-20034.080000-300000Bio-gel P-30040.0100000-400000 “P” “P”后面的拉伯?dāng)?shù)字越大，表示吸水性越大，凝膠的交聯(lián)度越后面的拉伯?dāng)?shù)字越大，表示吸水性越大，凝膠的交聯(lián)度越小，分子量分離范圍越大與小，分子量分離范圍越大與 SephadexSephadex相似。相似。 性能性能 ： 剛性好流速快剛性好流速快 在在pH 2-11pH 2-11的溶液中穩(wěn)定的溶液中穩(wěn)定 高溫下酰胺基易被水解產(chǎn)生羧酸高溫下酰胺基易被水解產(chǎn)生羧酸 對(duì)酸、堿性較強(qiáng)的物質(zhì)及芳香族化類(lèi)合物均用不同程度的吸附。對(duì)酸、堿性較強(qiáng)的物質(zhì)及芳香族化

37、類(lèi)合物均用不同程度的吸附。 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠SepharoseSepharose系列系列 瓊脂糖凝膠是由瓊脂糖經(jīng)特殊工藝制成的珠狀凝膠，瓊脂糖中凝瓊脂糖凝膠是由瓊脂糖經(jīng)特殊工藝制成的珠狀凝膠，瓊脂糖中凝膠的結(jié)構(gòu)是氫鍵而不是共價(jià)鍵，因此膠的結(jié)構(gòu)是氫鍵而不是共價(jià)鍵，因此, ,物理穩(wěn)定性較差。通常把瓊物理穩(wěn)定性較差。通常把瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)浸泡在水溶液中。其主要技術(shù)指標(biāo)是：脂糖凝膠層析介質(zhì)浸泡在水溶液中。其主要技術(shù)指標(biāo)是：型號(hào)凝膠濃度(w/v)分子量分離范圍sepharose2B2510515107sepharose4B4210515106sepharose6B651042106sepharos

38、e8B821047105sepharose12B1251035104 阿拉伯?dāng)?shù)字后面的阿拉伯?dāng)?shù)字后面的B B表示瓊脂糖凝膠的百分濃度，瓊脂糖濃度越大表示瓊脂糖凝膠的百分濃度，瓊脂糖濃度越大表交聯(lián)度越大，表交聯(lián)度越大， 分子量分離范圍越小。與此相反瓊脂糖濃度越小分子量分離范圍越小。與此相反瓊脂糖濃度越小表交聯(lián)度越小，分子量分離范圍越大。表交聯(lián)度越小，分子量分離范圍越大。 性能：性能： 耐溫：耐溫： 交聯(lián)交聯(lián)瓊脂糖凝膠可耐受瓊脂糖凝膠可耐受100100120120 耐酸堿：在耐酸堿：在pH3pH31212范圍內(nèi)穩(wěn)定范圍內(nèi)穩(wěn)定 耐鹽：在耐鹽：在6M6M尿素中穩(wěn)定尿素中穩(wěn)定(4)(4)方法方法介質(zhì)溶脹

39、介質(zhì)溶脹 裝柱裝柱 平衡平衡 上樣上樣 洗脫洗脫 計(jì)算分子量計(jì)算分子量 分離過(guò)程分離過(guò)程5) 5) 結(jié)果處理結(jié)果處理a a層析圖譜層析圖譜B B、 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線 分子量的測(cè)定方法，一般都采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。使用幾種不同分子分子量的測(cè)定方法，一般都采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。使用幾種不同分子量的混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白，經(jīng)排阻色譜進(jìn)行分離會(huì)得到不同標(biāo)留值的色譜量的混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白，經(jīng)排阻色譜進(jìn)行分離會(huì)得到不同標(biāo)留值的色譜峰，以分子量的對(duì)數(shù)值峰，以分子量的對(duì)數(shù)值(lgMr)(lgMr)為縱坐標(biāo)，以收集體積為縱坐標(biāo)，以收集體積(ml)(ml)為橫坐標(biāo)，為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。然后將未知樣的標(biāo)流體積在準(zhǔn)曲線先上查得分子繪制標(biāo)準(zhǔn)

40、曲線圖。然后將未知樣的標(biāo)流體積在準(zhǔn)曲線先上查得分子量。量。、C C、未知蛋白分子量計(jì)算未知蛋白分子量計(jì)算 將未知蛋白排阻層析的洗脫體積從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到相應(yīng)的將未知蛋白排阻層析的洗脫體積從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到相應(yīng)的log(M)log(M)值，便可求出其分子量。值，便可求出其分子量。(6)應(yīng)注意的問(wèn)題：應(yīng)注意的問(wèn)題：A、樣品、樣品: 前處理前處理: 樣液要進(jìn)行適當(dāng)?shù)那疤幚順右阂M(jìn)行適當(dāng)?shù)那疤幚? 如離心，沉淀，抽提等如離心，沉淀，抽提等濃度濃度: 樣液濃度不宜太稀樣液濃度不宜太稀組分組分: 樣液組分不宜太多，目標(biāo)組分與相鄰組分之間的分子量至少樣液組分不宜太多，目標(biāo)組分與相鄰組分之間的分子量至少要相差要相

41、差 2000以上。以上。B、上樣：、上樣：對(duì)組別分離對(duì)組別分離: 上樣體積不超過(guò)柱床體積的上樣體積不超過(guò)柱床體積的30左右左右對(duì)組分分離對(duì)組分分離: 上樣體積不超過(guò)柱床體積的上樣體積不超過(guò)柱床體積的1-2左右左右C C、流速流速: : 流速是指在單位面積液體所流過(guò)的量，排阻色譜要選擇較理想的流速是指在單位面積液體所流過(guò)的量，排阻色譜要選擇較理想的流速才能得到好的結(jié)果，選擇的原則是：流速才能得到好的結(jié)果，選擇的原則是：根據(jù)介質(zhì)顆粒大小選擇根據(jù)介質(zhì)顆粒大小選擇根據(jù)上樣體積根據(jù)上樣體積根據(jù)樣品中的組分多少。根據(jù)樣品中的組分多少。 2.32.3質(zhì)譜法質(zhì)譜法2.3.12.3.1原理：原理： 質(zhì)譜儀是利用

42、電磁學(xué)的原理，使帶電的樣品離子按質(zhì)荷比進(jìn)行質(zhì)譜儀是利用電磁學(xué)的原理，使帶電的樣品離子按質(zhì)荷比進(jìn)行分離的裝置。離子電離后經(jīng)過(guò)加速進(jìn)入磁場(chǎng)中。其動(dòng)能與加速電壓分離的裝置。離子電離后經(jīng)過(guò)加速進(jìn)入磁場(chǎng)中。其動(dòng)能與加速電壓及電荷及電荷Z Z有關(guān)。有關(guān)。Z Z：電荷數(shù)：電荷數(shù) ZeU=mvZeU=mv2 2/2 e/2 e：電荷：電荷(e = 1.60 x10(e = 1.60 x10-19-19C)C)U U：加速電壓：加速電壓m m：離子的質(zhì)量：離子的質(zhì)量v v：離子被加速后的運(yùn)動(dòng)速度：離子被加速后的運(yùn)動(dòng)速度 具有速度具有速度v v的帶電離子進(jìn)入質(zhì)譜儀的電磁場(chǎng)中，根據(jù)所選擇的分的帶電離子進(jìn)入質(zhì)譜儀的電

43、磁場(chǎng)中，根據(jù)所選擇的分離方式，最終實(shí)現(xiàn)各種離子按離方式，最終實(shí)現(xiàn)各種離子按m/zm/z進(jìn)行分離。進(jìn)行分離。 根據(jù)質(zhì)量分析器的工作原理，可將質(zhì)譜儀分為動(dòng)態(tài)和靜態(tài)儀器根據(jù)質(zhì)量分析器的工作原理，可將質(zhì)譜儀分為動(dòng)態(tài)和靜態(tài)儀器兩大類(lèi)，靜態(tài)儀器采用穩(wěn)定的電磁場(chǎng)，按空間位置來(lái)區(qū)別兩大類(lèi)，靜態(tài)儀器采用穩(wěn)定的電磁場(chǎng)，按空間位置來(lái)區(qū)別m/zm/z不同不同的離子。動(dòng)態(tài)儀器采用變化的電磁場(chǎng)，按時(shí)間不同來(lái)區(qū)分的離子。動(dòng)態(tài)儀器采用變化的電磁場(chǎng)，按時(shí)間不同來(lái)區(qū)分m/zm/z不同不同 的離子。的離子。 分離生物大分子多采用電噴質(zhì)譜法，屬于動(dòng)態(tài)質(zhì)譜儀?；驹蛛x生物大分子多采用電噴質(zhì)譜法，屬于動(dòng)態(tài)質(zhì)譜儀?；驹硎巧锎蠓肿釉?/p>

44、很高的電場(chǎng)下電離。樣品溶液以很低的流速，在理是生物大分子在很高的電場(chǎng)下電離。樣品溶液以很低的流速，在高的電場(chǎng)下使生物分子從毛細(xì)管中流出來(lái)。高的電場(chǎng)下使生物分子從毛細(xì)管中流出來(lái)。2.3.22.3.2方法：方法： 樣品溶液以很低的流速樣品溶液以很低的流速(1-20l/(1-20l/分鐘分鐘) )從毛細(xì)管中流出來(lái)。在毛從毛細(xì)管中流出來(lái)。在毛細(xì)管的柱頭上施加一個(gè)高電壓細(xì)管的柱頭上施加一個(gè)高電壓(1-5kv)(1-5kv)，是柱頭液體霧化成很細(xì)的，是柱頭液體霧化成很細(xì)的帶電液滴，這種帶電液滴在逆向干燥氣流中揮發(fā)，使液滴表面電荷帶電液滴，這種帶電液滴在逆向干燥氣流中揮發(fā)，使液滴表面電荷密度增大。直到產(chǎn)生的

45、庫(kù)侖斥與液滴表面張力的雷利極限值相等時(shí)，密度增大。直到產(chǎn)生的庫(kù)侖斥與液滴表面張力的雷利極限值相等時(shí)，液滴就會(huì)發(fā)生爆裂，形成更小的子液滴，這些子液滴又被蒸發(fā)，又液滴就會(huì)發(fā)生爆裂，形成更小的子液滴，這些子液滴又被蒸發(fā)，又會(huì)形成爆裂。如此循環(huán)下去，直到液滴變得非常小，它的表面的電會(huì)形成爆裂。如此循環(huán)下去，直到液滴變得非常小，它的表面的電荷密度變得非常大，形成很強(qiáng)的電場(chǎng)，并從液滴中解離出帶多電荷荷密度變得非常大，形成很強(qiáng)的電場(chǎng)，并從液滴中解離出帶多電荷的分子離子。這些離子是靠吸附上或丟失若干質(zhì)子而形成的，所以的分子離子。這些離子是靠吸附上或丟失若干質(zhì)子而形成的，所以正離子或負(fù)離子譜上會(huì)觀察到譜峰。生物

46、大分子在正離子或負(fù)離子譜上會(huì)觀察到譜峰。生物大分子在ESIESI譜上往往是譜上往往是一組帶不同的電荷的分子離子峰。一組帶不同的電荷的分子離子峰。2.3.32.3.3結(jié)果結(jié)果2.42.4核磁共振波譜核磁共振波譜 核磁共振波譜核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy, (nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR).NMR).是將具有磁矩的核放入磁場(chǎng)后，用適宜的頻率的電磁波照射，是將具有磁矩的核放入磁場(chǎng)后，用適宜的頻率的電磁波照射，它們就會(huì)吸收能量，發(fā)生原子核能級(jí)的躍遷，同時(shí)產(chǎn)生核磁共振信它們就會(huì)吸收

47、能量，發(fā)生原子核能級(jí)的躍遷，同時(shí)產(chǎn)生核磁共振信號(hào)，得到核磁共振波譜。在有機(jī)化合物中，經(jīng)常用于號(hào)，得到核磁共振波譜。在有機(jī)化合物中，經(jīng)常用于1 1H H和和1313C C核的共核的共振吸收波譜。在生物學(xué)方面主要研究生物大分子的結(jié)構(gòu)和分子量。振吸收波譜。在生物學(xué)方面主要研究生物大分子的結(jié)構(gòu)和分子量。到目前為止，采用到目前為止，采用1 1H 2D-NMRH 2D-NMR（二維（二維NMRNMR）能解決的最大蛋白質(zhì)分子）能解決的最大蛋白質(zhì)分子量在量在10000Da10000Da左右。如果采用雜核多維左右。如果采用雜核多維NMRNMR技術(shù)，能解決的最大蛋白技術(shù)，能解決的最大蛋白質(zhì)分子量大在質(zhì)分子量大在2

48、5000Da25000Da左右。左右。6 6幾種測(cè)定蛋白質(zhì)分子量方法的比較幾種測(cè)定蛋白質(zhì)分子量方法的比較方法方法機(jī)理機(jī)理分子量計(jì)算分子量計(jì)算關(guān)鍵技術(shù)關(guān)鍵技術(shù)特點(diǎn)特點(diǎn)電泳電泳分子表面電荷分子表面電荷電泳條帶電泳條帶(mR)SDS包裹包裹單鏈分子單鏈分子層析層析分子質(zhì)量分子質(zhì)量層析峰的位置層析峰的位置介質(zhì)交聯(lián)度介質(zhì)交聯(lián)度球形分子球形分子質(zhì)譜質(zhì)譜質(zhì)荷比質(zhì)荷比質(zhì)譜峰直接標(biāo)識(shí)質(zhì)譜峰直接標(biāo)識(shí)樣品質(zhì)子化樣品質(zhì)子化整體分子整體分子核磁核磁核磁共振波譜核磁共振波譜核磁譜線計(jì)算核磁譜線計(jì)算磁場(chǎng)能量磁場(chǎng)能量整體分子整體分子3 3蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測(cè)定技術(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測(cè)定技術(shù)3.13.1等電聚焦電泳等電聚焦電泳(Iso

49、electrofocusing(Isoelectrofocusing，簡(jiǎn)寫(xiě)，簡(jiǎn)寫(xiě)IEF)IEF)3.1.13.1.1原理原理 通常是指聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳。它是通常是指聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳。它是6060年代初建立起來(lái)年代初建立起來(lái)的一種蛋白質(zhì)分離手段，現(xiàn)在已經(jīng)成為單向蛋白質(zhì)電泳分辨率最高的一種蛋白質(zhì)分離手段，現(xiàn)在已經(jīng)成為單向蛋白質(zhì)電泳分辨率最高的一種分離技術(shù)，其分辨率可以達(dá)到的一種分離技術(shù)，其分辨率可以達(dá)到0.010.01個(gè)個(gè)pHpH值，有的文獻(xiàn)報(bào)道可值，有的文獻(xiàn)報(bào)道可以達(dá)到以達(dá)到0.0010.001個(gè)個(gè)pHpH值。它是利用蛋白質(zhì)分子或其它兩性分子的等電值。它是利用蛋白質(zhì)分子或其它

50、兩性分子的等電點(diǎn)的差異進(jìn)行電泳分離和分析。蛋白質(zhì)在一個(gè)穩(wěn)定的線性點(diǎn)的差異進(jìn)行電泳分離和分析。蛋白質(zhì)在一個(gè)穩(wěn)定的線性pHpH梯度的梯度的凝膠中電泳，蛋白質(zhì)朝著與自身電荷相反的方向移動(dòng)，在移動(dòng)的過(guò)凝膠中電泳，蛋白質(zhì)朝著與自身電荷相反的方向移動(dòng)，在移動(dòng)的過(guò)程中不斷被凝膠中的反離子中和，最后靜電荷完全被中和而停止運(yùn)程中不斷被凝膠中的反離子中和，最后靜電荷完全被中和而停止運(yùn)動(dòng)，聚焦在等電點(diǎn)的位置。動(dòng)，聚焦在等電點(diǎn)的位置。3.1.23.1.2蛋白質(zhì)與兩性電解質(zhì)蛋白質(zhì)與兩性電解質(zhì)(1)(1)載體兩性電解質(zhì)：載體兩性電解質(zhì)： 在等電聚焦電泳中，載體兩性電解質(zhì)具有以下兩種功能：在等電聚焦電泳中，載體兩性電解質(zhì)具

51、有以下兩種功能：A 中和功能：中和功能： 兩性電解質(zhì)的性質(zhì)在分離系統(tǒng)中形成一個(gè)平衡穩(wěn)定的兩性電解質(zhì)的性質(zhì)在分離系統(tǒng)中形成一個(gè)平衡穩(wěn)定的pHpH梯度，提梯度，提供中和蛋白質(zhì)電荷的離子，具有供中和蛋白質(zhì)電荷的離子，具有pHpH緩沖能。緩沖能。B 載電功能：載電功能： 兩性電解質(zhì)作為電的載體，具有運(yùn)載兩性電解質(zhì)作為電的載體，具有運(yùn)載“電流電流”的能力，有良好的能力，有良好的導(dǎo)電性能的導(dǎo)電性能(2)(2)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) 蛋白質(zhì)屬于一種兩性電解質(zhì)。在不同的蛋白質(zhì)屬于一種兩性電解質(zhì)。在不同的pHpH環(huán)境中所帶的正負(fù)電荷環(huán)境中所帶的正負(fù)電荷不同。若在某特定的不同。若在某特定的pHpH環(huán)境中其凈

52、電荷為零，此時(shí)的環(huán)境中其凈電荷為零，此時(shí)的pHpH為該蛋白質(zhì)為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，在電場(chǎng)下不泳動(dòng)。的等電點(diǎn)，在電場(chǎng)下不泳動(dòng)。3.1.33.1.3載體兩性電解質(zhì)分類(lèi)及載體兩性電解質(zhì)分類(lèi)及pHpH范圍范圍 根據(jù)建立根據(jù)建立pHpH梯度的原理的不同，可以分為載體兩性電解質(zhì)梯度的原理的不同，可以分為載體兩性電解質(zhì)pHpH梯度梯度(Carrier Ampholytes pH Gradient)(Carrier Ampholytes pH Gradient)和固相和固相pHpH梯度梯度(Immobilized (Immobilized pH Gradient)pH Gradient)。前者是在電場(chǎng)中通過(guò)兩性

53、緩沖離子建立。前者是在電場(chǎng)中通過(guò)兩性緩沖離子建立pHpH梯度，后梯度，后者將緩沖基團(tuán)作為凝膠介質(zhì)的一部分，分辨率比前者高一個(gè)數(shù)量級(jí)。者將緩沖基團(tuán)作為凝膠介質(zhì)的一部分，分辨率比前者高一個(gè)數(shù)量級(jí)。 名名 稱稱產(chǎn)產(chǎn) 家家組組 成成分子范圍分子范圍pH范圍范圍AmpholinePharmacia (LKB)脂肪族多氨基脂肪族多氨基,多多羧基的異構(gòu)體和羧基的異構(gòu)體和同系物組成同系物組成1000-6000Da2.5-4.5 4-6.5 5-8.0 3.5-9.5PharmalytePharmacia七氨基多羧基七氨基多羧基1000-15000Da2.5-5 4-5.55-8.0 8-10 3-10Serv

54、alyteServa丙烯基乙胺與乙丙烯基乙胺與乙烯基亞胺縮合烯基亞胺縮合800-1200Da2-4.04-6.0 6-8.0 2-11 載體兩性電載體兩性電解質(zhì)解質(zhì)國(guó)產(chǎn)國(guó)產(chǎn)脂肪族的多氨基脂肪族的多氨基,多羧基的異構(gòu)體多羧基的異構(gòu)體和同系物組成和同系物組成800-1200 Da3-9.5 3.5-5.54.0-6.0 6.0-9.0 7.0-103.1.43.1.4電極液電極液根據(jù)不同的根據(jù)不同的pHpH范圍范圍, ,選用不同的電極液選用不同的電極液, ,見(jiàn)下表見(jiàn)下表pH范圍范圍陽(yáng)極電極液陽(yáng)極電極液陰極電極液陰極電極液3.5-9.51mol/L 磷酸磷酸1 mol/L NaOH2.5-4.51

55、mol/L磷酸磷酸0.4M HEPES4.0-6.50.5 mol/L 醋酸醋酸0.5 mol/L NaOH5.0-8.00.5 mol/L 醋酸醋酸0.5mol/L NaOH2.5-4.01 mol/L 磷酸磷酸2%兩性電解質(zhì)兩性電解質(zhì) pH6-83.5-5.21 mol/L 磷酸磷酸2%兩性電解質(zhì)兩性電解質(zhì) pH5-74.5-7.01 mol/L 磷酸磷酸1 mol/L NaOH5.5-7.72%兩性電解質(zhì)兩性電解質(zhì) pH4-61 mol/L NaOH6.0-8.52%兩性電解質(zhì)兩性電解質(zhì) pH4-61 mol/L NaOH7.8-102%兩性電解質(zhì)兩性電解質(zhì) pH4-61 mol/L N

56、aOH3.1.53.1.5方法方法制膠制膠 加樣加樣 電泳電泳 固定固定 染色染色 脫色脫色 計(jì)算計(jì)算3.1.6 pH3.1.6 pH值測(cè)定值測(cè)定(1)(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法： 標(biāo)準(zhǔn)樣品參照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)樣品參照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(2)(2)微電極法：微電極法： 微電極直接測(cè)定微電極直接測(cè)定3.23.2聚焦層析聚焦層析(chromatofocusing)(chromatofocusing)3.2.13.2.1原理原理(1)pH(1)pH梯度的形成梯度的形成 一般的離子交換色譜中，一般的離子交換色譜中，pHpH梯度的產(chǎn)生，通常利用梯度的產(chǎn)生，通常利用pHpH梯度混合器梯度混合器來(lái)制造連續(xù)的

57、來(lái)制造連續(xù)的pHpH梯度。而聚焦色譜則是利用離子交換劑本身的帶電梯度。而聚焦色譜則是利用離子交換劑本身的帶電基團(tuán)的緩沖作用形成梯度。當(dāng)洗脫緩沖液通過(guò)聚焦離子交換介質(zhì)時(shí)，基團(tuán)的緩沖作用形成梯度。當(dāng)洗脫緩沖液通過(guò)聚焦離子交換介質(zhì)時(shí)，就會(huì)自動(dòng)形成就會(huì)自動(dòng)形成pHpH梯度。在高梯度。在高pHpH緩沖液的平衡，使色譜柱內(nèi)的介質(zhì)均緩沖液的平衡，使色譜柱內(nèi)的介質(zhì)均處于堿性條件，帶有電負(fù)性的堿性基團(tuán)，根據(jù)載體兩性電解質(zhì)的等處于堿性條件，帶有電負(fù)性的堿性基團(tuán)，根據(jù)載體兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)不同，所帶的電荷有差異而形成電點(diǎn)不同，所帶的電荷有差異而形成pHpH梯度。梯度。(2)(2)聚焦效應(yīng)聚焦效應(yīng) 當(dāng)一種蛋白質(zhì)在色譜

58、柱內(nèi)隨洗脫液前移至接近其當(dāng)一種蛋白質(zhì)在色譜柱內(nèi)隨洗脫液前移至接近其pIpI處時(shí)處時(shí), ,此時(shí)的此時(shí)的移動(dòng)速度明顯減慢。如果同樣的組分第二次加樣，起初它帶負(fù)電荷移動(dòng)速度明顯減慢。如果同樣的組分第二次加樣，起初它帶負(fù)電荷, ,向正電荷向正電荷( (低低pH)pH)方向移動(dòng)速度快，直至追上慢速移動(dòng)的第一次加樣方向移動(dòng)速度快，直至追上慢速移動(dòng)的第一次加樣的組分，而聚焦到一起，然后兩次加樣的同一組分一起前移，直至的組分，而聚焦到一起，然后兩次加樣的同一組分一起前移，直至停留在停留在pIpI處。處。3.2. 2 3.2. 2 聚焦介質(zhì)聚焦介質(zhì) 聚焦介質(zhì)是以交聯(lián)的瓊脂糖凝膠為載體合成的聚焦介質(zhì)是以交聯(lián)的瓊脂

59、糖凝膠為載體合成的, ,具有凝膠介質(zhì)的具有凝膠介質(zhì)的基本特性，也有兩性電解質(zhì)的特性。目前用的較多主要基本特性，也有兩性電解質(zhì)的特性。目前用的較多主要(1)PBE118(1)PBE118偏堿性介質(zhì)偏堿性介質(zhì)(2)PBE94(2)PBE94偏中性介質(zhì)偏中性介質(zhì)3.2.33.2.3緩沖液緩沖液(1)(1)緩沖液分類(lèi)緩沖液分類(lèi)a.a.起始緩沖液起始緩沖液(start buffer)(start buffer)， 如：乙醇胺如：乙醇胺-HCl-HClb.b.樣品緩沖液樣品緩沖液(sample buffer), (sample buffer), 如：如：Tris-HAcTris-HAcc.c.洗脫緩沖液洗

60、脫緩沖液(eluting buffer), (eluting buffer), 如：如： polybuffer 96-HClpolybuffer 96-HCl(1)(1)始緩沖液及洗脫緩沖液的配制方法始緩沖液及洗脫緩沖液的配制方法介質(zhì)介質(zhì)pH范圍范圍起始緩沖液起始緩沖液PBE118(pH10.5-7)三乙胺三乙胺-HCl pH11.0PBE 94(pH9-6)乙醇胺乙醇胺-HCl pH9.4PBE 94(pH8-5)Tris-HCl pH8.3PBE 94(pH7-4)咪唑咪唑-HAc pH7.4PBE 94(pH6-4)組氨酸組氨酸-HCl pH6.2PBE 94(pH5-4)哌嗪哌嗪-HC