生物化學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)(二)3

1、生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-171第四節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其應(yīng)用一、蛋白質(zhì)的兩性解離和等到電點(diǎn)二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)三、蛋白質(zhì)的變性作用四、蛋白質(zhì)的沉淀作用五、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng) 六、蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì)生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-172蛋白質(zhì)分子的大小1.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量 1萬至幾萬. 2 .蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定方法根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子質(zhì)量用物理化學(xué)方法來測蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-173一、蛋白質(zhì)兩性解離和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的側(cè)鏈側(cè)鏈上存在游離的上存在游離的氨氨基基和和羧基羧基，因此蛋白質(zhì)與氨基酸一樣具有兩性解，因

2、此蛋白質(zhì)與氨基酸一樣具有兩性解離性質(zhì)，具有特定的離性質(zhì)，具有特定的等電點(diǎn)（等電點(diǎn)（pI）。溶液溶液pHpI時時，蛋白質(zhì)所帶正負(fù)電荷相等；，蛋白質(zhì)所帶正負(fù)電荷相等； pHpI時時，蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷；，蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷； pHpI時時，蛋白質(zhì)帶凈正電荷。，蛋白質(zhì)帶凈正電荷。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-174蛋白質(zhì)兩性解離和等電點(diǎn)主要由肽鏈中可解離的功能團(tuán)決定兩性解離：蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)PI：蛋白質(zhì)等離子點(diǎn)：蛋白質(zhì)電泳：用于蛋白質(zhì)的分離鑒定。 生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-175等電點(diǎn)時特點(diǎn)：等電點(diǎn)時特點(diǎn)：（1）凈電荷為零）凈電荷為零（2）一定離子強(qiáng)度的緩沖液：等離子點(diǎn)特征常數(shù)）一定離子強(qiáng)度的緩沖

3、液：等離子點(diǎn)特征常數(shù)（3）多數(shù)蛋白質(zhì)在水中等電點(diǎn)偏酸）多數(shù)蛋白質(zhì)在水中等電點(diǎn)偏酸 堿性堿性AA/酸性酸性AA 等電點(diǎn)等電點(diǎn) 胃蛋白酶胃蛋白酶 0.2 1. 血紅蛋白血紅蛋白 1.7 6 細(xì)胞色素細(xì)胞色素C 2.9 10.7 菊糖酶菊糖酶 0.34 8.2（4）導(dǎo)電性、溶解度、黏度及滲透壓都最小。）導(dǎo)電性、溶解度、黏度及滲透壓都最小。 等電沉淀和白泳：等電沉淀和白泳： 遷移率與凈電荷量、分子大小、分子形狀等有關(guān)遷移率與凈電荷量、分子大小、分子形狀等有關(guān)生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-176等電點(diǎn)沉淀和電泳：等電點(diǎn)沉淀和電泳：等電點(diǎn)沉淀：遷移率與凈電荷量、等電點(diǎn)沉淀：遷移率與凈電荷量、分子大小、分

4、子形狀等有關(guān)分子大小、分子形狀等有關(guān)電泳：電泳：帶電粒子在電場中移動的帶電粒子在電場中移動的現(xiàn)象稱為現(xiàn)象稱為電電泳泳生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-177蛋白質(zhì)分子在一定蛋白質(zhì)分子在一定pH的溶液中可帶凈的溶液中可帶凈的的負(fù)負(fù)電荷或電荷或正正電荷，故可在電場中發(fā)生電荷，故可在電場中發(fā)生移動。移動。不同蛋白質(zhì)分子所帶不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷量電荷量不同，且不同，且分分子大小子大小也不同，故在電場中的移動速度也不同，故在電場中的移動速度也不同，據(jù)此可互相分離。也不同，據(jù)此可互相分離。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-178二、蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)溶液是膠體溶液維持蛋白質(zhì)的膠體系統(tǒng)穩(wěn)定的因素1100nm

5、大小的質(zhì)點(diǎn)在動力學(xué)上是穩(wěn)定的. 某一pH下質(zhì)點(diǎn)帶有同種電荷，互相排斥?？蓸?gòu)成雙電層質(zhì)點(diǎn)能與溶劑（水）形成水化層，相互間不易靠攏。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-1792.蛋白質(zhì)具有膠體溶液的性質(zhì)蛋白質(zhì)具有膠體溶液的性質(zhì)蛋白質(zhì)分子的顆粒直徑已蛋白質(zhì)分子的顆粒直徑已達(dá)達(dá)1100nm，處于膠體，處于膠體顆粒的范圍。（親水膠體）顆粒的范圍。（親水膠體）蛋白質(zhì)具有膠體溶液的性質(zhì)：布朗運(yùn)動、丁道爾蛋白質(zhì)具有膠體溶液的性質(zhì)：布朗運(yùn)動、丁道爾現(xiàn)象、不能透過半透膜、具有吸附力等。現(xiàn)象、不能透過半透膜、具有吸附力等。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17103 3、穩(wěn)定蛋白質(zhì)親水溶膠的兩個重要、穩(wěn)定蛋白質(zhì)親水溶膠的

6、兩個重要因素：因素：|水化膜水化膜 - 通過通過氫鍵氫鍵與水結(jié)合與水結(jié)合|表面電荷表面電荷- 在非等電點(diǎn)狀態(tài)下，在非等電點(diǎn)狀態(tài)下，雙電層雙電層，帶，帶 同性電荷蛋白質(zhì)分子互相排斥。同性電荷蛋白質(zhì)分子互相排斥。 生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-1711蛋白質(zhì)顆粒的表面電荷和水化膜蛋白質(zhì)顆粒的表面電荷和水化膜+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)酸酸堿堿酸酸堿堿脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17124.4.蛋白質(zhì)凝膠蛋白質(zhì)凝膠凝膠具有脹潤作用：凝膠具有脹潤作用：分類：分類：（1）可逆性凝膠

7、可逆性凝膠 （2）不可逆性凝膠）不可逆性凝膠部分破壞水化膜、適當(dāng)加熱和遠(yuǎn)離等電點(diǎn)部分破壞水化膜、適當(dāng)加熱和遠(yuǎn)離等電點(diǎn)生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17135.5.蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用1、蛋白質(zhì)是生物大分子、蛋白質(zhì)是生物大分子 不能透不能透過半透膜過半透膜2、蛋白質(zhì)溶液是穩(wěn)定的膠體溶液、蛋白質(zhì)溶液是穩(wěn)定的膠體溶液 具有親水膠體性質(zhì)具有親水膠體性質(zhì)3、臨床應(yīng)用、臨床應(yīng)用 維持有效循環(huán)血量、維持有效循環(huán)血量、實(shí)驗(yàn)室透析技術(shù)實(shí)驗(yàn)室透析技術(shù) 生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-1714三、蛋白質(zhì)的變性作用吳憲教授是中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)(原北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院)生物化學(xué)系創(chuàng)始人，曾任中國生理學(xué)會會

8、長。他早在20世紀(jì)30年代就提出了蛋白質(zhì)變性理論，在中國和國際生物界有很高的學(xué)術(shù)地位和廣泛的影響。 變性復(fù)性生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17151.蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)蛋白質(zhì)分子中次級鍵被破壞，引起天然構(gòu)象松散。不涉用共價鍵的斷裂（肽鍵和二硫鍵），蛋白質(zhì)只有在比較溫和的條件下才傾向于穩(wěn)定。溫和條件指的是：溫度為040，pH范圍為5.59.0，沒有有機(jī)溶劑。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17162.導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的因素物理因素高溫、高壓、超聲波、劇烈振蕩、攪拌、X射線和紫外線等；化學(xué)因素強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、胍、去污劑、重金屬鹽、三氯乙酸、濃乙醇等都能蛋白質(zhì)變性。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-1

9、7173.常用的變性劑尿素：與多肽主鏈競爭氫鍵；增加非極性側(cè)鏈在水中的溶解度，從而降低疏水相互作用。CCCNNHHHHOOO蛋白質(zhì)肽鏈尿素分子生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17184.變性蛋白質(zhì)的特點(diǎn)生物活性喪失：某些物理化學(xué)性質(zhì)改變：易與相應(yīng)的試劑起化學(xué)反應(yīng)；溶解度降低，易形成沉淀析出；結(jié)晶能力喪失；分子不對稱性加大；粘度增加；紫外吸收光譜有所改變；肽鍵易被酶水解和消化。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17195.蛋白質(zhì)的復(fù)性當(dāng)變性因素除去后，變性蛋白質(zhì)又可重新回復(fù)到天然構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性?？赡孀冃裕ㄈ?、四級結(jié)構(gòu)）與不可逆變性（二、三、四）不是所有的變性蛋白都能復(fù)性。大部分蛋白

10、質(zhì)變性后不能恢復(fù)其原有的各種性質(zhì) 復(fù)性后的蛋白質(zhì)多數(shù)不能完全恢復(fù)活力。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-1720四、蛋白質(zhì)的沉淀改變穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的條件時，穩(wěn)定性就被破壞，蛋白質(zhì)分子相聚集而從溶液中析出，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的沉淀作用。帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)脫水作用脫水作用OH-H+在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)脫水作用脫水作用帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒聚不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒聚集而沉淀集而沉淀帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)+-OH-H+生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-1721沉淀蛋白質(zhì)的方法、鹽析法(salting out)：

11、定義，原理，應(yīng)用、重金屬鹽法：pHpI PrM PrM、生物堿試劑：三氯乙酸，單寧酸，苦味酸，鎢酸等。、有機(jī)溶劑法：定義，原理，注意5、加熱沉淀蛋白質(zhì) 生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17221.鹽析中性鹽沉淀定義：在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽，定義：在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽，以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，使蛋白質(zhì)從以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出，稱為鹽析溶液中沉淀析出，稱為鹽析作用機(jī)制作用機(jī)制:中和電荷的同時破壞水化膜中和電荷的同時破壞水化膜; ;生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17232.重金屬鹽沉淀重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)分子在蛋白質(zhì)分子在PH大于其等電點(diǎn)時，帶負(fù)電，易大于其等

12、電點(diǎn)時，帶負(fù)電，易與重金屬離子如與重金屬離子如Hg+、Cu2+等結(jié)合生成不溶于水等結(jié)合生成不溶于水的蛋白質(zhì)鹽沉淀，引起蛋白質(zhì)變性。的蛋白質(zhì)鹽沉淀，引起蛋白質(zhì)變性。人誤食重金屬鹽中毒是因?yàn)橹亟饘冫}與蛋白質(zhì)沉人誤食重金屬鹽中毒是因?yàn)橹亟饘冫}與蛋白質(zhì)沉淀變性有關(guān)，臨床上采用口服大量新鮮牛奶、豆淀變性有關(guān)，臨床上采用口服大量新鮮牛奶、豆?jié){搶救重金屬中毒的病人，就是根據(jù)牛奶、豆?jié){漿搶救重金屬中毒的病人，就是根據(jù)牛奶、豆?jié){等蛋白質(zhì)能與重金屬鹽結(jié)成不溶沉淀物，可阻止等蛋白質(zhì)能與重金屬鹽結(jié)成不溶沉淀物，可阻止機(jī)體對重金屬鹽的吸收。然后用催吐劑將結(jié)合的機(jī)體對重金屬鹽的吸收。然后用催吐劑將結(jié)合的重金屬嘔吐出來，達(dá)

13、到搶救目的。重金屬嘔吐出來，達(dá)到搶救目的。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17243.生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分子在蛋白質(zhì)分子在PH小于其等電點(diǎn)時，帶小于其等電點(diǎn)時，帶正電，易于生物堿（苦味酸、三氯乙酸、正電，易于生物堿（苦味酸、三氯乙酸、磺基水楊酸等）結(jié)合，生成不溶性鹽，磺基水楊酸等）結(jié)合，生成不溶性鹽，引起蛋白質(zhì)變性。引起蛋白質(zhì)變性。臨床上用三氯乙酸作尿蛋白的檢測試劑。臨床上用三氯乙酸作尿蛋白的檢測試劑。 生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17254.有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法與水互溶的有機(jī)溶劑，如酒精、甲醇等與水互溶的有機(jī)溶劑，如酒精、甲醇等破壞蛋白質(zhì)水化層，使得蛋

14、白質(zhì)沉淀。破壞蛋白質(zhì)水化層，使得蛋白質(zhì)沉淀。（在等電點(diǎn)下效果更好）（在等電點(diǎn)下效果更好）但是常溫下，有機(jī)溶劑會引起蛋白質(zhì)的但是常溫下，有機(jī)溶劑會引起蛋白質(zhì)的變性，如酒精滅菌，而在低溫下蛋白質(zhì)變性，如酒精滅菌，而在低溫下蛋白質(zhì)變性減慢。因此利用有機(jī)溶劑沉淀蛋白變性減慢。因此利用有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)，為防止蛋白質(zhì)變性，可在低溫下進(jìn)質(zhì)，為防止蛋白質(zhì)變性，可在低溫下進(jìn)行，嚴(yán)格控制引起變性的各種因素。行，嚴(yán)格控制引起變性的各種因素。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17265.加熱沉淀蛋白質(zhì)加熱使蛋白質(zhì)變性沉淀蛋白質(zhì)變性和沉淀是二個不同概念蛋白質(zhì)變性不一定沉淀蛋白質(zhì)沉淀也不一定變性生工學(xué)院生命科學(xué)系2022

15、-3-1727五、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)蛋白質(zhì)分子中某些氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)和肽鍵，可發(fā)生一些顏色反應(yīng)。它們可用于某氨基酸的鑒定、蛋白質(zhì)定性試驗(yàn)和定量測定。 生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-1728五、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)就是氨基酸某些基團(tuán)蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)就是氨基酸某些基團(tuán)及肽鍵與一定試劑所產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)。及肽鍵與一定試劑所產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)。利用這些反應(yīng)，可對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量測利用這些反應(yīng)，可對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量測定。但是這些化合反應(yīng)不是蛋白質(zhì)的特定。但是這些化合反應(yīng)不是蛋白質(zhì)的特征反應(yīng)，在鑒定蛋白質(zhì)時，除利用這些征反應(yīng)，在鑒定蛋白質(zhì)時，除利用這些方法外，還必須結(jié)合蛋白質(zhì)的其它性質(zhì)方法外，還必須結(jié)合

16、蛋白質(zhì)的其它性質(zhì)考慮。考慮。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17291.雙縮脲反應(yīng) 蛋白質(zhì)與堿性蛋白質(zhì)與堿性Cu2+形成紫紅色絡(luò)合形成紫紅色絡(luò)合物反應(yīng)這是蛋白質(zhì)分子中肽鏈的反物反應(yīng)這是蛋白質(zhì)分子中肽鏈的反應(yīng)。肽鏈越多，反應(yīng)顏色越深。氨應(yīng)。肽鏈越多，反應(yīng)顏色越深。氨基酸無此反應(yīng)?？捎糜诘鞍踪|(zhì)定量、基酸無此反應(yīng)。可用于蛋白質(zhì)定量、定性，也可用于蛋白質(zhì)水解程度的定性，也可用于蛋白質(zhì)水解程度的測定測定 生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17302.福林試劑反應(yīng)（酚試劑反應(yīng)）福林試劑：磷鉬酸福林試劑：磷鉬酸- -磷鎢酸磷鎢酸在堿性條件下，蛋白質(zhì)與硫酸銅發(fā)生反應(yīng)在堿性條件下，蛋白質(zhì)與硫酸銅發(fā)生反應(yīng)蛋白質(zhì)蛋白

17、質(zhì)- -銅絡(luò)合物，將福林試劑還原，產(chǎn)銅絡(luò)合物，將福林試劑還原，產(chǎn)生磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物生磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17313.乙醛酸反應(yīng)在蛋白質(zhì)溶液中加入HCOCOOH，將濃硫酸沿管壁緩慢加入，不使相混，在液面交界處，即有紫色環(huán)形成。色氨酸的反應(yīng)（吲哚環(huán)的反應(yīng)）鑒定蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17324.茚三酮反應(yīng)在在PH5.7時，蛋白質(zhì)與茚三酮時，蛋白質(zhì)與茚三酮可產(chǎn)生顏色反應(yīng)?？捎糜诘翱僧a(chǎn)生顏色反應(yīng)?？捎糜诘鞍踪|(zhì)的定性和定量。白質(zhì)的定性和定量。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-1733六、蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì)六、蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì)抗原：指能刺激

18、機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫抗原：指能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)的抗體特異性結(jié)合應(yīng)答，并能與相應(yīng)的抗體特異性結(jié)合的物質(zhì)。的物質(zhì)。抗體：由相應(yīng)抗原刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)抗體：由相應(yīng)抗原刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)而由而由-淋巴細(xì)胞新產(chǎn)生的免疫球蛋白。淋巴細(xì)胞新產(chǎn)生的免疫球蛋白。換句話說，抗體是動物針對外來物質(zhì)換句話說，抗體是動物針對外來物質(zhì)的出現(xiàn)而合成的一種蛋白質(zhì)。的出現(xiàn)而合成的一種蛋白質(zhì)。免疫反應(yīng)：指抗原與抗體所引起的反應(yīng)。免疫反應(yīng)：指抗原與抗體所引起的反應(yīng)。過敏反應(yīng)：免疫反應(yīng)拌有組織損傷或生過敏反應(yīng)：免疫反應(yīng)拌有組織損傷或生理功能紊亂。理功能紊亂。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-1734第五節(jié)蛋白質(zhì)

19、的提取、分離和純化的基本原理蛋白質(zhì)的分離純化是研究其結(jié)構(gòu)與功蛋白質(zhì)的分離純化是研究其結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)。在生物制藥工業(yè)中，蛋能的基礎(chǔ)。在生物制藥工業(yè)中，蛋白質(zhì)、酶、多肽類激素等藥物生產(chǎn)白質(zhì)、酶、多肽類激素等藥物生產(chǎn)制備都涉及到蛋白質(zhì)分離純化的問制備都涉及到蛋白質(zhì)分離純化的問題。蛋白質(zhì)分離純化的工藝過程，題。蛋白質(zhì)分離純化的工藝過程，既要考慮盡可能的除去雜蛋白，又既要考慮盡可能的除去雜蛋白，又要保持目的蛋白的產(chǎn)量，也就是要要保持目的蛋白的產(chǎn)量，也就是要提高回收率提高回收率。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-1735一、提取1.選材：新鮮、富含目的蛋白且來源方便 2.組織細(xì)胞的粉碎：胞內(nèi)及膜中蛋白 1

20、）物理法：如超聲、勻漿、加砂研磨、高壓擠壓等 2）化學(xué)法：如EDTA、SDS等 3）酶法：如自溶法、外加酶法（纖維素酶、果膠酶、溶菌酶等） 3.提?。哼m當(dāng)溶媒、適當(dāng)條件、適當(dāng)提取時間和次數(shù)、溶菌酶處理（分解肽聚糖）或用表面活性、溶菌酶處理（分解肽聚糖）或用表面活性劑處理。劑處理。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-1736二、分離純化 從組織細(xì)胞中提取的蛋白質(zhì)溶液，含有許多不同分子量的蛋白質(zhì)，要獲取目的蛋白，須進(jìn)一步分離純化，將目的蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)分開。分離原理及原則：利用欲分離蛋白質(zhì)的溶解度、分子大小、電荷、吸附性質(zhì)、對配體分子的特殊的親和力。從混雜蛋白質(zhì)中分離出一個特殊蛋白質(zhì)。生工學(xué)院生命科

21、學(xué)系2022-3-1737基本步驟選材組織細(xì)胞破碎：機(jī)械法、物理法、化學(xué)法、酶法。提?。哼x用適當(dāng)?shù)娜軇┓蛛x純化：根據(jù)等分離蛋白質(zhì)的特異理化性質(zhì)設(shè)計分離純化方法。結(jié)晶：結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度的純化。鑒定、分析：純度、含量、相對分子質(zhì)量等。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-1738（一）根據(jù)溶解度不同的分離方法 利用各種蛋白質(zhì)的溶解度差異進(jìn)行分利用各種蛋白質(zhì)的溶解度差異進(jìn)行分離。影響蛋白質(zhì)溶解度的因素有離。影響蛋白質(zhì)溶解度的因素有PH值、離子強(qiáng)度、溶液的介電常數(shù)等，值、離子強(qiáng)度、溶液的介電常數(shù)等，各種蛋白質(zhì)的溶解度取決于它們的分各種蛋白質(zhì)的溶解度取決于它們的分子結(jié)構(gòu)，如：氨基酸組成、極性和非子

22、結(jié)構(gòu)，如：氨基酸組成、極性和非極性基團(tuán)的多少等。極性基團(tuán)的多少等。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17391.等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)在PI使溶解度最小，使溶解度最小，此方法常與其它分離方法配合使此方法常與其它分離方法配合使用。用。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17402.鹽析沉淀不同蛋白質(zhì)可通過加入不同飽和度的不同蛋白質(zhì)可通過加入不同飽和度的中式鹽分別沉淀出來（即分級沉中式鹽分別沉淀出來（即分級沉淀）。淀）。常用飽和硫酸銨來沉淀蛋白質(zhì)。此法常用飽和硫酸銨來沉淀蛋白質(zhì)。此法可用于工業(yè)大規(guī)模分離。可用于工業(yè)大規(guī)模分離。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17413.低溫有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑沉淀利用有機(jī)

23、溶劑能降低在利用有機(jī)溶劑能降低在Pro水中的溶水中的溶解度，使蛋白質(zhì)沉淀。解度，使蛋白質(zhì)沉淀。常用的有機(jī)溶劑有乙醇、甲醇、丙酮常用的有機(jī)溶劑有乙醇、甲醇、丙酮等。在低溫下操作，有機(jī)溶劑一般等。在低溫下操作，有機(jī)溶劑一般需預(yù)冷（需預(yù)冷（-40），緩慢加入。），緩慢加入。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-1742溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響：在一溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響：在一定范圍內(nèi)，定范圍內(nèi)，040之間，大部分球之間，大部分球狀蛋白質(zhì)隨溫度升高而溶解度增大狀蛋白質(zhì)隨溫度升高而溶解度增大（血紅蛋白除外，（血紅蛋白除外，025隨隨溫度隨隨溫度升高而溶解度降低）；在升高而溶解度降低）；在4050以上，大部分

24、蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，開始以上，大部分蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，開始變性。所以大多數(shù)蛋白質(zhì)的分離在變性。所以大多數(shù)蛋白質(zhì)的分離在低溫下操作。低溫下操作。 生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-1743（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的分離方法1.透析:是將待提純的是將待提純的Pro溶液在裝在半透溶液在裝在半透膜的透析袋里，放入膜的透析袋里，放入 蒸餾水中進(jìn)行的，蒸餾水中進(jìn)行的，透析液可以進(jìn)行更換，直至透析袋內(nèi)無透析液可以進(jìn)行更換，直至透析袋內(nèi)無機(jī)小分子物質(zhì)降到最低點(diǎn)為止。機(jī)小分子物質(zhì)降到最低點(diǎn)為止。超濾:是利用壓力或離心力，強(qiáng)行使水和是利用壓力或離心力，強(qiáng)行使水和其他小分子物質(zhì)通過半透膜。而蛋白質(zhì)其他小分子物質(zhì)通過半透膜。

25、而蛋白質(zhì)截留在膜上。市場上有各種規(guī)格的半透截留在膜上。市場上有各種規(guī)格的半透膜出售，可根據(jù)目的蛋白的分子量選擇膜出售，可根據(jù)目的蛋白的分子量選擇不同孔徑的膜。不同孔徑的膜。 生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17442.分子篩層析（凝膠過濾、排阻層析）又稱又稱凝膠過濾、分子排阻層析，它是根據(jù)分、分子排阻層析，它是根據(jù)分子量大小分離混合物最有效的方法之一。子量大小分離混合物最有效的方法之一。 凝膠過濾所用的介質(zhì)是凝膠珠，內(nèi)部是多孔凝膠過濾所用的介質(zhì)是凝膠珠，內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠的膠聯(lián)度或孔度（網(wǎng)孔大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠的膠聯(lián)度或孔度（網(wǎng)孔大?。Q定凝膠的分級范圍，即能被該凝膠分?。Q定凝膠的分級

26、范圍，即能被該凝膠分離開來的離開來的Pro混合物的分子量范圍。混合物的分子量范圍。 生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17453.密度梯度離心每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時，即停止不前，在離心管中被分離成各自獨(dú)立的區(qū)帶。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度等。密度梯度在管內(nèi)分布是管底的密度大，向上逐漸減少，待分離混合物平鋪在梯度的頂端，離心采用水平轉(zhuǎn)頭高速進(jìn)行。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-1746（三）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性的分離方法在一定在一定PH下，不同蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)量和性下，不同蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)量和性質(zhì)不同。質(zhì)不同。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17471.電泳在

27、外電場作用下，帶電顆粒向與其電性在外電場作用下，帶電顆粒向與其電性相反的電極移動。帶電顆粒在電場中的相反的電極移動。帶電顆粒在電場中的泳動速度取決于它所帶的凈電荷量以及泳動速度取決于它所帶的凈電荷量以及顆粒的大小和形狀。顆粒的大小和形狀。常用電泳的方法有：常用電泳的方法有：1）醋酸纖維薄膜電泳：）醋酸纖維薄膜電泳：2）聚丙烯酰胺）聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳3）等電點(diǎn)聚焦電泳：、）等電點(diǎn)聚焦電泳：、4）免疫電泳：、）免疫電泳：、生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-17482.離子交換層析指一個溶液中的某一種離子與另一種具有相同指一個溶液中的某一種離子與另一種具有相同電荷的離子相互調(diào)換位置，即溶液中的離子電荷的離子相互調(diào)換位置，即溶液中的離子跑到固體上，把固體上的離子替換下來。這跑到固體上，把固體上的離子替換下來。這里的溶液稱流動相，固體稱固定相。里的溶液稱流動相，固體稱固定相。在離子交換層析中，蛋白質(zhì)對離子交換在離子交換層析中，蛋白質(zhì)對離子交換劑的結(jié)合力取決于彼此間相反電荷的靜劑的結(jié)合力取決于彼此間相反電荷的靜電吸引，電吸引，常用交換劑：離子交換纖維素、離子交常用交換劑：離子交換纖維素、離子交換凝膠和離子交換樹脂。換凝膠和離子交換樹脂。生工學(xué)院生命科學(xué)系2022-3-1749（四）根據(jù)配體特異性的分離方法利用蛋白質(zhì)等高分子化合物能和某些相利用蛋白質(zhì)等高分子化合物能和某些相