奈瑟菌的分離和鑒定

1、奈瑟菌的分離和鑒定奈瑟菌的分離和鑒定衛(wèi)生部北京醫(yī)院衛(wèi)生部北京醫(yī)院陳東科陳東科、腦膜炎奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌 腦膜炎奈瑟菌(Neisseria.meningitidis)簡稱腦膜炎球菌，是引起流行性腦脊髓炎（簡稱“流腦”）的病原菌。多發(fā)年齡在529歲。對本菌的鑒定是確定診斷的重要依據(jù)，同時給臨床治療提供參考價值。 人類是腦膜炎球菌的唯一宿主。流行性腦脊髓炎病人和帶菌者是本病的傳染源。本病經(jīng)飛沫傳染，潛伏期14d。細(xì)菌首先侵害鼻咽腔，引起上呼吸道感染或局部炎癥。當(dāng)少量細(xì)菌侵入血流時，可引起菌血癥突發(fā)惡寒、發(fā)熱、惡心、嘔吐等，并有出血或紅斑性皮疹及脾腫大。當(dāng)大量細(xì)菌侵入血流時，由血液或淋巴到達(dá)腦脊髓膜

2、則發(fā)生腦脊髓炎的癥狀和體癥。在我國以A群流行為主。 1. 生物學(xué)性狀生物學(xué)性狀 （1）形態(tài)與染色）形態(tài)與染色 腦膜炎球菌為革蘭陰性雙球菌，菌體呈腎形或豆形，成雙排列凹面（短軸）相對。由病人體內(nèi)新分離的菌株有多糖莢膜。 （2）培養(yǎng)特點(diǎn)）培養(yǎng)特點(diǎn) 本菌為專性需氧菌，營養(yǎng)要求高，58%CO2可促進(jìn)生長，其最適生長溫度為3637，最適pH值為7.47.6。在巧克力平板上經(jīng)1824h培養(yǎng)，形成圓形、光滑、透明、濕潤、邊緣整齊菌落。直徑23mm，在血平板上不溶血。培養(yǎng)時間延長，由于細(xì)菌自溶酶的作用，菌落可變成酪樣或膠樣。 （3）生化反應(yīng)特點(diǎn)）生化反應(yīng)特點(diǎn) 腦膜炎球菌可分解葡萄糖、麥芽糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。不分解

3、蛋白質(zhì)，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，不產(chǎn)生硫化氫，不分解尿素，硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性，氧化酶試驗(yàn)陽性。2. 標(biāo)本采集：標(biāo)本采集： 根據(jù)病期不同，采集的標(biāo)本也有所不同。菌血癥期病人可采取血液；出現(xiàn)出血點(diǎn)或瘀斑者，可挑取瘀斑滲出液；如出現(xiàn)腦脊髓膜刺激癥狀者，必要時可抽取腦脊液；上呼吸道感染期的疑似病人和帶菌者，可取鼻咽腔分泌物進(jìn)行檢查。因該菌易自溶，故應(yīng)立即送檢，最好在床邊接種。 3. 檢驗(yàn)方法：檢驗(yàn)方法： （1）直接檢查法：）直接檢查法： 1）腦脊液）腦脊液 以無菌方法獲得腦脊液標(biāo)本后，經(jīng)3000r/min離心30min，取沉淀物，首先接種培養(yǎng)，然后再涂片染色檢查。通常制兩張涂片，一張作革蘭染色，一張作美藍(lán)染色進(jìn)

4、行鏡檢。若腦脊液較清應(yīng)先增菌，即在腦脊液中加入少量葡萄糖肉湯培養(yǎng)液，經(jīng)3746h增菌培養(yǎng)后，再行涂片染色鏡檢，可提高陽性檢出率。一般情況下，患病早期的腦脊液中腦膜炎球菌數(shù)量較少，且大多數(shù)在細(xì)胞外；在疾病后期菌量增大，大多數(shù)在細(xì)胞內(nèi)。 2）瘀斑（出血點(diǎn)）瘀斑（出血點(diǎn)） 選擇細(xì)小的色澤鮮紅，境界明顯的瘀點(diǎn)，或無瘀點(diǎn)時用充血皮膚，經(jīng)消毒干燥后刺入0.5cm，用清潔玻片采血三滴，涂成血膜片，自然干燥。用美藍(lán)或革蘭染色鏡檢。第一滴血含菌量比第二、三滴血高數(shù)倍，故不能按常規(guī)采血棄去第一、二滴血。（2）培養(yǎng)檢查法）培養(yǎng)檢查法1）腦脊液）腦脊液 取腦脊液離心沉淀物，立刻接種巧克力平板，37，58%CO2環(huán)境培

5、養(yǎng)1824h。如腦脊液混濁可直接種入培養(yǎng)基。2）瘀斑滲出物）瘀斑滲出物 滲出物直接涂于巧克力平板上，37，58%CO2環(huán)境培養(yǎng)1824h。3）鼻咽腔分泌物）鼻咽腔分泌物 將綿拭標(biāo)本立即涂于，P.V(Polymyxin B.Vancomycin)卵黃瓊脂或P.V巧克力平板一端，再用接種環(huán)劃線分離，進(jìn)行培養(yǎng)觀察。 4）血液）血液 抽取靜脈血58ml，立刻接種注入血培養(yǎng)瓶，按血液細(xì)菌培養(yǎng)常規(guī)操作。（3）生化反應(yīng)）生化反應(yīng) 取純培養(yǎng)物，如其形態(tài)、菌落特征典型，氧化酶陽性，可按表1進(jìn)行鑒定。（4）凝集試驗(yàn)）凝集試驗(yàn) 包括血清凝集試驗(yàn)、SPA協(xié)同凝集試驗(yàn)、反向乳膠凝集試驗(yàn)等方法。（5）莢膜腫脹試驗(yàn)）莢膜腫

6、脹試驗(yàn) 取一接種環(huán)菌掖或腦脊液，于玻片上，再加一環(huán)抗血清及二環(huán)呂氏美藍(lán)液混合，加上蓋玻片，20min，用油鏡觀察莢膜是否腫脹，同時用鹽水作對照。此試驗(yàn)僅適用于A群和C群菌株。二、淋病奈瑟菌二、淋病奈瑟菌 淋病奈瑟菌（N.gonorrhoeae）簡稱淋球菌，它是淋病的病原菌。主要通過不潔性交引起泌尿生殖系統(tǒng)化膿性炎癥，也可通過污染器械、帶菌衣物、用具發(fā)生間接污染。也有肛門及咽部的淋球菌感染病例。新生兒經(jīng)過產(chǎn)道時，可被感染而患淋病性眼結(jié)膜炎。 1. 生物學(xué)性狀：生物學(xué)性狀： （1）形態(tài)與染色）形態(tài)與染色 淋球菌的形態(tài)與腦膜炎球菌很相似，菌體呈球形、腎形或豆形，成對排列，兩球菌接觸面平坦，形似一對黃

7、豆。革蘭染色陰性，無芽孢、無鞭毛、有莢膜。在急性淋病患者尿道膿汁標(biāo)本中可見細(xì)菌被吞噬于中性粒細(xì)胞內(nèi)；慢性淋病時多在細(xì)胞外。 （2）培養(yǎng)特點(diǎn)）培養(yǎng)特點(diǎn) 本菌對營養(yǎng)要求高，需用巧克力平板，或含萬古霉素、多粘菌素及制霉菌素的Thayer-Martin培養(yǎng)基（GC瓊脂加生長添加劑）才能生長。初次分離需供給58%CO2，最適生長溫度為3637，最適pH值為7.5。經(jīng)48h培養(yǎng)，形成圓形、不透明、灰白色凸起，細(xì)小顆粒狀菌落。直徑0.61.0mm，進(jìn)一步培養(yǎng)，菌落可呈粘液樣。（3）生化反應(yīng)特點(diǎn)）生化反應(yīng)特點(diǎn) 淋球菌只分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，不產(chǎn)生硫化氫，硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性，氧化酶及觸酶試驗(yàn)均陽

8、性。 2. 標(biāo)本采集：標(biāo)本采集： （1）男性）男性 尿道炎患者，先以無菌生理鹽水清洗尿道口，采集尿道膿性分泌物；前列腺炎患者則從直腸側(cè)對前列腺進(jìn)行按摩，待分泌物排出后采集。 （2）女性）女性 尿道炎患者，先以無菌生理鹽水清洗尿道口，從陰道后壁由后向前壓迫尿道，使分泌物排出，然后用無菌拭子或接種環(huán)采集；對于宮頸炎患者，先無菌生理鹽水清洗宮頸口和陰道壁，再用陰道窺鏡壓迫子宮陰道部，使分泌物排出，然后用無菌拭子或接種環(huán)采集標(biāo)本；合并腸炎的患者，可在直腸鏡下，用無菌綿拭子采集直腸窩粘膜的粘液進(jìn)行送檢。 （3）眼分泌物、血液、關(guān)節(jié)液等）眼分泌物、血液、關(guān)節(jié)液等 以無菌操作方式采集。 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：

9、 最好在治療前采集樣品；取材前不論有無癥狀一律禁用消毒藥；對女性患者取材時不要碰陰道粘膜，以防污染正常菌群；由于本菌抵抗力甚弱，標(biāo)本采集要迅速并立即送檢，最好床邊接種，立即培養(yǎng)。 3. 檢驗(yàn)方法：檢驗(yàn)方法： （1）直接檢查法）直接檢查法 取標(biāo)本直接涂片進(jìn)行革蘭染色，急性期在膿細(xì)胞內(nèi)可找到許多革蘭陰性雙球菌，有診斷意義。本法最適用于泌尿生殖道標(biāo)本，男性與培養(yǎng)結(jié)果符合率達(dá)到98%，一般可不作培養(yǎng)；女性與培養(yǎng)結(jié)果符合率僅達(dá)50%左右，需進(jìn)行培養(yǎng)鑒定。 （2）培養(yǎng)檢查法）培養(yǎng)檢查法 采取膿汁或粘液標(biāo)本后，應(yīng)立即接種于預(yù)溫的巧克力平板上進(jìn)行分離培養(yǎng)。（3）生化反應(yīng)）生化反應(yīng) 取純培養(yǎng)物，如其形態(tài)、菌落特

10、征典型，氧化酶陽性，可按表1進(jìn)行鑒定。表表1 G-球菌的鑒別特征球菌的鑒別特征菌 名 巧克力瓊脂 營養(yǎng)瓊脂 葡萄糖 麥芽糖 還 原 還 原 DNA酶 乙酰脂酶 （22） （35） NO3 NO2 腦膜炎奈瑟菌 + 淋病奈瑟菌 + + V 卡他莫拉菌 V + + + + +其他奈瑟菌 V + * V *粘膜奈瑟菌陽性。V:不定。三、其他奈瑟菌三、其他奈瑟菌其他奈瑟菌大多寄居在人的上呼吸道中，很少有致病性。菌落較干燥，有咬瓊脂的現(xiàn)象，大多呈黃色。也有少數(shù)菌落呈光滑型，且無色素，易于腦膜炎奈瑟菌及嗜血桿菌菌落相混淆，應(yīng)注意鑒別，奈瑟菌落一般較粘，用接種環(huán)不易刮取。淋病奈瑟菌是否需要進(jìn)行淋病奈瑟菌是否需要進(jìn)行-內(nèi)酰胺酶的檢測？內(nèi)酰胺酶的檢測？ 一般來說，不需要對淋病奈瑟菌中的-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行檢測。 當(dāng)前經(jīng)驗(yàn)治療淋病的藥物為頭孢曲松、頭孢克肟或喹諾酮類抗菌藥物，而這些藥物的抗菌活性均不受-內(nèi)酰胺酶的影響。由于多年前就已經(jīng)不提倡用青霉素進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)治療，因此，不必要對淋病奈瑟菌進(jìn)行-內(nèi)酰胺酶的測試。除非在有些國家，