膜片鉗技術(shù)及其應(yīng)用實(shí)例

1、膜片鉗技術(shù)及其應(yīng)用實(shí)例膜片鉗技術(shù)及其應(yīng)用實(shí)例王王 強(qiáng)強(qiáng)1南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院神經(jīng)毒理實(shí)驗(yàn)室南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院神經(jīng)毒理實(shí)驗(yàn)室內(nèi)容提要內(nèi)容提要l 離子通道離子通道l 膜片鉗技術(shù)膜片鉗技術(shù)（Patch Clamp Technique）l 應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例2被引用次數(shù)被引用次數(shù)13325一、離子通道一、離子通道 細(xì)胞是動物和人體的基本組成單元，細(xì)胞與細(xì)胞細(xì)胞是動物和人體的基本組成單元，細(xì)胞與細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)的通信通信是依靠其膜上的離子通道進(jìn)行的，是依靠其膜上的離子通道進(jìn)行的，離子離子和離子通道是細(xì)胞興奮的基礎(chǔ)和離子通道是細(xì)胞興奮的基礎(chǔ)，亦即產(chǎn)生生物電，亦即產(chǎn)生生物電信號的基礎(chǔ)，生物電信號通常用電學(xué)

2、或電子學(xué)方信號的基礎(chǔ)，生物電信號通常用電學(xué)或電子學(xué)方法進(jìn)行測量。由此形成了一門細(xì)胞學(xué)科法進(jìn)行測量。由此形成了一門細(xì)胞學(xué)科電生理電生理學(xué)（學(xué)（electrophysiologyelectrophysiology）。 膜片鉗技術(shù)已成為膜片鉗技術(shù)已成為研究離子通道的研究離子通道的“金標(biāo)準(zhǔn)金標(biāo)準(zhǔn)”。 4 電壓門控性離子通道電壓門控性離子通道：膜上通道蛋白的帶點(diǎn)集：膜上通道蛋白的帶點(diǎn)集團(tuán)在膜電位改變時，在電場的作用下，重新分團(tuán)在膜電位改變時，在電場的作用下，重新分布導(dǎo)致通道的關(guān)閉，同時有電荷移動，稱為門布導(dǎo)致通道的關(guān)閉，同時有電荷移動，稱為門控電流?？仉娏?。 配體門控離子通道配體門控離子通道：神經(jīng)遞質(zhì)（

3、如乙酰膽堿）、：神經(jīng)遞質(zhì)（如乙酰膽堿）、激素等與通道蛋白上的特定位點(diǎn)結(jié)合，引起蛋激素等與通道蛋白上的特定位點(diǎn)結(jié)合，引起蛋白構(gòu)象的改變，導(dǎo)致通道的打開。白構(gòu)象的改變，導(dǎo)致通道的打開。 機(jī)械門控離子通道機(jī)械門控離子通道：機(jī)械牽拉：機(jī)械牽拉 其他其他5二、膜片鉗技術(shù)二、膜片鉗技術(shù)l19761976年年 德國馬普生物物理化學(xué)研究所德國馬普生物物理化學(xué)研究所NeherNeher和和SakmannSakmann在在青蛙肌細(xì)胞上記錄青蛙肌細(xì)胞上記錄記錄記錄到到AChACh激活的激活的單通道離子電流單通道離子電流l19801980年年 SigworthSigworth等用負(fù)壓吸引，得到等用負(fù)壓吸引，得到10-

4、100G10-100G的的高高阻封接（阻封接（Giga-sealGiga-seal），），大大降低了記錄時的噪聲大大降低了記錄時的噪聲l19811981年年 HamillHamill和和NeherNeher等引進(jìn)了等引進(jìn)了膜片游離技術(shù)和全細(xì)膜片游離技術(shù)和全細(xì)胞記錄技術(shù)胞記錄技術(shù)l19831983年年1010月，月，Single-Channel RecordingSingle-Channel Recording一書問一書問世，奠定了膜片鉗技術(shù)的里程碑世，奠定了膜片鉗技術(shù)的里程碑。6Neher(1944-)Sakmann(1942-)共獲共獲19911991年諾貝爾獎年諾貝爾獎8膜片鉗技術(shù)原理膜片

5、鉗技術(shù)原理 膜片鉗技術(shù)是用玻璃微膜片鉗技術(shù)是用玻璃微電極接觸細(xì)胞，形成吉?dú)W電極接觸細(xì)胞，形成吉?dú)W姆姆(G(G) )阻抗，使得與電極阻抗，使得與電極尖端開口處相接的細(xì)胞膜尖端開口處相接的細(xì)胞膜的膜片與周圍在電學(xué)上絕的膜片與周圍在電學(xué)上絕緣，在此基礎(chǔ)上固定電位，緣，在此基礎(chǔ)上固定電位，對此膜片上的離子通道的對此膜片上的離子通道的離子電流離子電流(pA(pA級級) )進(jìn)行監(jiān)測進(jìn)行監(jiān)測記錄的方法。記錄的方法。膜膜片片鉗鉗技技術(shù)術(shù)的的記記錄錄模模式式9全細(xì)胞膜片鉗等效電流圖全細(xì)胞膜片鉗等效電流圖1011膜片鉗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)組成膜片鉗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)組成放大器放大器轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換器刺激器刺激器防震臺防震臺顯微鏡顯微鏡微操縱

6、器微操縱器探頭探頭屏蔽網(wǎng)屏蔽網(wǎng)監(jiān)視器監(jiān)視器 EPC 10 Plus膜片鉗放大器膜片鉗放大器武漢華中科大儀博武漢華中科大儀博 PC2CPC2C三、應(yīng)用實(shí)例三、應(yīng)用實(shí)例l 生精細(xì)胞生精細(xì)胞l 背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元l 皮層神經(jīng)元皮層神經(jīng)元13 神經(jīng)毒理研究室是現(xiàn)代毒理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和江蘇省應(yīng)神經(jīng)毒理研究室是現(xiàn)代毒理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和江蘇省應(yīng)用毒理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的組成部分，在上世紀(jì)八九十年代就開始組建用毒理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的組成部分，在上世紀(jì)八九十年代就開始組建膜片鉗實(shí)驗(yàn)室，屬國內(nèi)較早一批開展此工作的課題組，二十年來，膜片鉗實(shí)驗(yàn)室，屬國內(nèi)較早一批開展此工作的課題組，二十年來，在導(dǎo)師肖杭教授領(lǐng)導(dǎo)

7、、全體研究生的共同努力下，現(xiàn)在這門技術(shù)在導(dǎo)師肖杭教授領(lǐng)導(dǎo)、全體研究生的共同努力下，現(xiàn)在這門技術(shù)已經(jīng)成熟穩(wěn)定，并得到國際國內(nèi)同行的認(rèn)可。已經(jīng)成熟穩(wěn)定，并得到國際國內(nèi)同行的認(rèn)可。 14精子獲能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模式圖精子獲能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模式圖應(yīng)用實(shí)例一：應(yīng)用實(shí)例一：生精細(xì)胞離子通道學(xué)研究生精細(xì)胞離子通道學(xué)研究小鼠生精細(xì)胞電壓依賴性小鼠生精細(xì)胞電壓依賴性T型型Ca2+電流電流1、急性分離生精細(xì)胞、急性分離生精細(xì)胞機(jī)械分離法分離小鼠睪丸組織得到的細(xì)胞機(jī)械分離法分離小鼠睪丸組織得到的細(xì)胞單酶消化法分離小鼠睪丸組織得到的細(xì)胞單酶消化法分離小鼠睪丸組織得到的細(xì)胞 2、電極內(nèi)液：、電極內(nèi)液： CsMeSO3，CsF ，EG

8、TA ，Mg2ATP ，Phosphocreatine ，HEPES，調(diào)，調(diào)pH值至值至7.4 ， 電極外液：電極外液： NaCl , KCl, MgCl2, NaHCO3 , NaH2PO4 , D-glucose , HEPES , CaCl2 ，用，用NaOH調(diào)調(diào)pH至至7.4 3、全細(xì)胞膜片鉗、全細(xì)胞膜片鉗小鼠生精細(xì)胞電壓依賴性小鼠生精細(xì)胞電壓依賴性T型型Ca2+電流電流Current densityPotential (mV)-80-60-40-2002040ICa density (pA/pF)-8-6-4-20小鼠生精細(xì)胞小鼠生精細(xì)胞T型型Ca2+電流密度曲線圖電流密度曲線圖 C

9、aCa2+2+通道在通道在-60mV-60mV時激活，電流在時激活，電流在-30mV-30mV時時達(dá)到最大值，翻轉(zhuǎn)電位約為達(dá)到最大值，翻轉(zhuǎn)電位約為48mV48mV，峰電流，峰電流密度密度6.566.561.08pApF-11.08pApF-1。(n=11)(n=11)電壓門控性鈣離子通道的動力學(xué)研究 激活（激活（Activation）：用激活曲線反映通道開啟）：用激活曲線反映通道開啟的速度和難易程度的速度和難易程度Boltzmann方程擬和：gCa/ gCa max=1+exp-(Vm-V1/2)/ K-1（gCa max 峰電導(dǎo)的最大值，V1/2半數(shù)激活電壓，K激活斜率因子） 穩(wěn)態(tài)失活（穩(wěn)態(tài)

10、失活（Steady-state Inactivation）反映通道）反映通道失活數(shù)目的電壓依賴性，用失活曲線表示失活數(shù)目的電壓依賴性，用失活曲線表示ICa/ICa max=1+exp(V-Vi1/2)/ Ki-1（ICa max 峰鈣電流的最大值，V預(yù)刺激電壓，Vi1/2半數(shù)失活電壓，Ki失活斜率因子） 復(fù)活（復(fù)活（Recovery）用復(fù)活時間常數(shù)曲線表示）用復(fù)活時間常數(shù)曲線表示單冪指數(shù)方程擬和 ICa=Aexp(-t/r)+C（A起始時間，t為時間，r為復(fù)活時間常數(shù)，C常數(shù)） Holding potential-120-100-80-60-40-200Normalized current a

11、mplitude/conductance 0.0.2.4.6.81.0 分析細(xì)胞膜電位的變分析細(xì)胞膜電位的變化引起失活離子通道化引起失活離子通道數(shù)的變化。半數(shù)失活數(shù)的變化。半數(shù)失活電電(-60.79 0.24)mV，斜率因子斜率因子(4.71 0.22)mV，在，在-90mV到到-40mV通道通道失活。失活。T型型Ca2+通道激活和失活曲線圖通道激活和失活曲線圖分析細(xì)胞膜電位的分析細(xì)胞膜電位的變化引起激活離子變化引起激活離子通道數(shù)的變化。半通道數(shù)的變化。半數(shù)激活電壓數(shù)激活電壓(-49.43 0.62)mV，斜率因子斜率因子(6.05 0.55)mV，在在-65mV到到-10mV通道開放。通道開

12、放。 膜電位在膜電位在-90mV，施加一組，施加一組-80 +70mV，以，以10mV遞增的、波寬為遞增的、波寬為200ms的指令電壓方的指令電壓方波，以波，以gCa與與gCa max的比值對的比值對Vm作圖，數(shù)據(jù)作圖，數(shù)據(jù)經(jīng)經(jīng)Boltzman方程擬和所得為方程擬和所得為；以以 ICa與與ICa max 的比值對的比值對V 作圖，數(shù)據(jù)經(jīng)作圖，數(shù)據(jù)經(jīng)Boltzman方程擬和即為方程擬和即為 。小鼠生精細(xì)胞T型Ca2+通道復(fù)活特征 鉗制電位為-90 mV，給予50 ms，-20 mV的去極化刺激，間隔50 ms超極化至-110 mV，隨后再給予-20 mV的去極化刺激引出T型Ca2+通道的復(fù)活電流

13、經(jīng)單指數(shù)方程擬合的復(fù)活曲線，r為144.93 ms 1 1、Bay K8644Bay K8644對生精細(xì)胞鈣電流的作用 小鼠生精細(xì)胞小鼠生精細(xì)胞T型鈣離子通道的藥理學(xué)特性型鈣離子通道的藥理學(xué)特性 Bay K8644Bay K8644為特異的為特異的L L型型CaCa2+2+通道激動劑，通道激動劑，低濃度低濃度即可增大即可增大L L型型CaCa2+2+通道電流，通道電流，但對但對T T型型CaCa2+2+電流無影響。電流無影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入5 5M Bay M Bay K8644K8644，小鼠粗線期精母細(xì)，小鼠粗線期精母細(xì)胞胞CaCa2+2+電流無任何變化，電流無任何變化，提示記錄

14、的提示記錄的CaCa2+2+電流非電流非L L型型CaCa2+2+通道開放產(chǎn)生，也不通道開放產(chǎn)生，也不含有含有L L型型CaCa2+2+電流成分電流成分。2、CdCl2和和NiCl2對小鼠生精細(xì)胞對小鼠生精細(xì)胞Ca2+電流的作用比較電流的作用比較 Agent /molL-1 n ICa/pApF-1Inhibition 加藥前 加藥后CdCl2 30 35.620.194.480.10204 10046.910.595.090.752613 30066.771.042.160.83688NiCl2 50310.500.838.200.97223 10048.510.663.691.025710

15、* x s. PCd2+NiCl2和和CdCl2是作用范圍較廣的是作用范圍較廣的Ca2+通通道阻斷劑，比較道阻斷劑，比較Ni2+和和Cd2+對對Ca2+電流抑電流抑制作用的大小，可以區(qū)分制作用的大小，可以區(qū)分Ca2+通道的亞通道的亞型。型。 56.9425.86020406080100Inhibition(%) CdCd2+ 2+ NiNi2+2+* *P0.05P0.05二價金屬陽離子Cd2+、Ni2+可阻斷電壓依賴性Ca2+通道，但二者對L型和T型Ca2+通道的作用不同。Ni2+在低濃度時主要阻斷T型Ca2+通道而對L型Ca2+通道無效。相反Cd2+對L型Ca2+通道更有效。本實(shí)驗(yàn)觀察了相

16、同濃度（100M）的Cd2+（n=4） 、Ni2+（n=4）對生精細(xì)胞Ca2+通道電流的作用，得到Ni2+的抑制作用大于的抑制作用大于Cd2+，而Cd2+在較高濃度（0.5mM）才與100M Ni2+作用相近。由由此我們確定在小鼠生精細(xì)胞記此我們確定在小鼠生精細(xì)胞記錄的鈣電流是由錄的鈣電流是由T型型Ca2+通道通道介導(dǎo)產(chǎn)生。介導(dǎo)產(chǎn)生。T型Ca2+通道有個重要特征，。實(shí)驗(yàn)中加入與細(xì)胞外液Ca2+濃度相同的Ba2+，記錄的Ca2+電流和Ba2+電流，在不同去極化電壓下，Ca2+電流和Ba2+電流均無明顯差異，表明我們記錄的小鼠生表明我們記錄的小鼠生精細(xì)胞精細(xì)胞Ca2+通道對通道對Ca2+和和Ba2

17、+的通透性相同，符合的通透性相同，符合T型的特征。型的特征。 3、BaCl2對生精細(xì)胞對生精細(xì)胞Ca2+電流的影響電流的影響V (mV)-100-80-60-40-2002040I (pA)-350-300-250-200-150-100-50010mMCa2+10mMBa2+4 4、硝苯地平、硝苯地平(nifedepine)對小鼠生精細(xì)胞T型鈣電流的作用不同濃度硝苯地平對小鼠粗線期精母細(xì)胞T型Ca2+電流的作用 在本試驗(yàn)條件下，我們記錄到的小鼠生精細(xì)胞內(nèi)向電流經(jīng)過通道電生理學(xué)特性和藥理學(xué)特性兩個角度鑒定，證實(shí)記錄到的為證實(shí)記錄到的為T T型型CaCa2+2+電流電流，無L型Ca2+通道電流成

18、分。并結(jié)合精子發(fā)生特點(diǎn)，提示精子頂體反精子頂體反應(yīng)時應(yīng)時CaCa2+2+的內(nèi)流主要由胞膜的內(nèi)流主要由胞膜T T型型CaCa2+2+通道完成通道完成。27 加入加入1 1 molLmolL-1-1氰戊菊酯后，氰戊菊酯后，CaCa2+2+通道的激活電壓向超極通道的激活電壓向超極化方向移動，提示化方向移動，提示CaCa2+2+通道的激活閾值降低，在通道的激活閾值降低，在-70-70-50mV -50mV CaCa2+2+電流比加藥前增大，在電流比加藥前增大，在-40-40+20mV Ca+20mV Ca2+2+電流被抑制，但翻電流被抑制，但翻轉(zhuǎn)電位沒有明顯變化。轉(zhuǎn)電位沒有明顯變化。氰戊菊酯氰戊菊酯( (Fen)Fen)加入前后加入前后CaCa2+2+通道電流電壓關(guān)系圖通道電流電壓關(guān)系圖(I-V (I-V 曲線曲線) ) 28應(yīng)用實(shí)例二：應(yīng)用實(shí)例二：神經(jīng)細(xì)胞離子通道學(xué)研究神經(jīng)細(xì)胞離子通道學(xué)研