任務五測定食品中的蛋白質(zhì)及氨基酸

1、食品分析與檢驗技術(shù)1任務五測定食品中的蛋白質(zhì)及氨基酸 李京東 余奇飛 劉麗紅食品分析與檢驗技術(shù)2v技能目標1會測定食品中粗蛋白含量。2會測定食品中氨基酸總量。3會測定食品中不同氨基酸含量。v知識目標1明確常見的食品蛋白質(zhì)含量，以及測定原理。2明確食品氨基酸總量的含量，以及測定原理。食品分析與檢驗技術(shù)3項目一：測定食品中蛋白質(zhì)v一、案例v二、選用的國家標準GB 5009.5-2010食品中蛋白質(zhì)的測定凱氏定氮法。食品分析與檢驗技術(shù)4v三、測定方法1樣品消化v 準確稱取固體樣品0.22g ,半固體樣品25g，液體樣品1025g，使試樣中含氮3040mg （精確至0.001g），小心移入干燥潔凈的1

2、00mL或500mL凱氏燒瓶中，然后依次加硫酸銅0.2g、硫酸鉀6g、濃硫酸20mL、玻璃珠數(shù)粒，輕輕搖勻后，安裝消化裝置。v將凱氏燒瓶45斜放在電爐上，于瓶口放一漏斗，緩慢加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫停止后，加大火力，保持液面微沸至溶液呈藍綠色透明時，繼續(xù)加熱0.51h，取下凱氏燒瓶冷卻后，緩慢加入20mL水，冷卻至室溫。食品分析與檢驗技術(shù)5v2蒸餾、吸收（1）常量蒸餾：裝好蒸餾裝置。接收瓶內(nèi)加入10mL 4%硼酸溶液及45滴甲基紅-溴甲酚綠混合指示液，置于蒸餾裝置的冷凝管下口，并使冷凝管下口浸入硼酸溶液中。放松夾子，沿漏斗向凱氏燒瓶中緩慢加入7080mL40%氫氧化鈉溶液，搖動凱氏瓶，至瓶

3、內(nèi)溶液變?yōu)樯钏{色，或產(chǎn)生黑色沉淀，再從漏斗加入100mL蒸餾水，夾緊夾子。加熱蒸餾，蒸餾30min(始終保持液面沸騰)，至氨全部蒸出(約250mL蒸餾液)。降低接收瓶的位置，使冷凝管口離開液面，繼續(xù)蒸餾13min，用表面皿接幾滴溜出液，以奈氏試劑檢查，如無紅棕色生成，表示蒸餾完畢。停止加熱，用少量水沖洗冷凝管管口，洗液并入接收瓶內(nèi)，取下接收瓶，用0.1000mol/L的鹽酸標準溶液滴定至終點；同時做空白實驗，記錄空白滴定消耗鹽酸標準溶液體積。食品分析與檢驗技術(shù)6食品分析與檢驗技術(shù)7v（2）微量蒸餾：安裝好定氮蒸餾裝置。在水蒸氣發(fā)生瓶中裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，保持水呈

4、酸性（淡紅色），加熱煮沸，將樣品消化液轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中并定容、搖勻。接收瓶內(nèi)加入10mL 4%硼酸溶液和1滴混合指示劑，置于蒸餾裝置的冷凝管下口，浸入硼酸溶液中，取210mL稀釋樣液，移入反應室，并用少量蒸餾水沖洗，塞緊玻璃塞，然后向反應室加入10mL400g/L氫氧化鈉溶液，立即塞緊玻璃塞，加水密封。蒸餾至硼酸吸收液中指示劑變?yōu)榫G色開始計時，繼續(xù)蒸餾10min后，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min，沖洗冷凝管管口。取下接收瓶，用0.1000mol/L的鹽酸標準溶液滴定至終點，同時做空白實驗，記錄空白滴定消耗鹽酸標準溶液體積。食品分析與檢驗技術(shù)8食品分析與檢驗技術(shù)9v3結(jié)果計算常量蒸餾

5、按下式計算: 微量蒸餾按下式計算：v式中vX食品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)，%；vV滴定試樣時消耗鹽酸標準滴定溶液的體積，mL；vV0空白試驗時消耗鹽酸標準滴定溶液的體積，mL；vc鹽酸標準滴定溶液的濃度；v0.014氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol；vm試樣的質(zhì)量，g；vF氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。100014. 0)(0FmVVX%100014. 0)(0FmcVVX10010010014. 0)(0FmVVX食品分析與檢驗技術(shù)10v4試劑硫酸銅CuSO45H2O、硫酸鉀、硫酸(密度為1.8149g/L)、40g/L硼酸溶液、400g/L氫氧化鈉、0.1000mol/L鹽酸標準溶液、混合指示劑v混合指示劑：

6、1g/L甲基紅乙醇溶液與1g/L亞甲基藍乙醇溶液，用時按2:1的比例混合；或者1g/L甲基紅乙醇溶液與1g/L溴甲酚綠乙醇溶液，用時按1:5的比例混合。v5實驗儀器凱氏燒瓶（100mL或500mL）、可調(diào)式電爐、定氮蒸餾裝置。食品分析與檢驗技術(shù)11v四、相關(guān)知識（一）食品中蛋白質(zhì)含量測定凱氏定氮法原理v 將被檢樣品加入濃硫酸，以硫酸銅、硫酸鉀為催化劑共同加熱消化，食品中蛋白質(zhì)分解為氨，并與硫酸結(jié)合成硫酸銨，通過堿化蒸餾，使氨分離出來，用硼酸吸收形成硼酸氨后，再用鹽酸標準溶液滴定，根據(jù)消耗的標準鹽酸的體積，通過換算系數(shù)，可測定食品中蛋白質(zhì)含量。v 本法摘自GB 5009.5-2010，適用于所有

7、動、植物食品的蛋白質(zhì)含量測定。食品分析與檢驗技術(shù)12v（二）樣品消化反應過程1樣品消化、蒸餾、滴定反應過程消化反應方程式：v 2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2Ov 2H2SO4+CCO2+SO2+H2Ov H2SO4+2NH3(NH4)2SO4蒸餾反應方程式：v(NH4)2SO4+2NaOH2NH3+Na2SO4+2H2O吸收與滴定：v2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2Ov(NH4)2B4O7+5H2O+2HCl2NH4Cl+4H3BO3食品分析與檢驗技術(shù)13v2加快食品消化反應（1）硫酸鉀：硫酸鉀可以提高溶液的沸點

8、而加快有機物分解，它與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高反應溫度，反應方程式為：vK2SO4+H2SO42KHSO4v2KHSO4K2SO4十SO2十H2O（2）硫酸銅：起催化劑作用，使用時常加入少量過氧化氫、次氯酸鉀等作為氧化劑以加速有機物氧化，硫酸銅的作用機理如下所示：v2CuSO4Cu2SO4+SO2+O2vC+CuSO4 Cu2SO4+SO2+CO2v Cu2SO4+2H2SO42CuSO4+H2O+SO2 此反應不斷進行，待有機物全部被消化完后，不再有硫酸亞銅 (褐色)生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍綠色，故硫酸銅除起催化劑的作用外，還可指示消化終點的到達。 食品分析與檢驗技術(shù)14v（三）不同食品的蛋

9、白質(zhì)換算系數(shù)v食品種類 F食品種類 Fv小麥 5.83小麥粉及其制品 5.7v大麥、燕麥、黑麥 5.83米 5.95v花生 5.46大豆及其制品 5.71v畜禽肉及其制品 6.25乳及乳制品 6.38v芝麻、向日葵 5.4南瓜子 5.4v栗子、胡桃 5.3其他食品 6.25食品分析與檢驗技術(shù)15v（四）注意事項1蛋白質(zhì)含量測定，因樣品中常含有核酸、生物堿、含氮類脂以及含氮色素等非蛋白質(zhì)的含氮化合物，故結(jié)果稱為粗蛋白質(zhì)含量。2為減少實驗誤差，所有試劑溶液應用無氨蒸餾水配制。3消化過程要不斷轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，以利于附著在瓶壁上的固體殘渣洗下，促進其消化；同時為防止造成氮損失，不要用強火，應保持緩和沸騰

10、。4樣品中含脂肪或糖較多，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫外溢，在消化開始時用小火加熱，并時時搖動，也可以加入少量辛醇、液體石蠟或硅油消泡劑，并控制熱源強度。食品分析與檢驗技術(shù)165一般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30min即可,有機物如分解完全，消化液呈藍色或淺綠色，但含鐵量多時，呈較深綠色。6當樣品消化液不易澄清透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30%過氧化氫23mL后繼續(xù)加熱消化。7蒸餾裝置應該密封，防止漏氣，蒸餾過程中不得停火斷氣，防止發(fā)生倒吸；v消化液呈藍色不生成氫氧化銅沉淀，說明蒸餾前加堿量不足，要再增加氫氧化鈉用量；蒸餾完畢后，應先將冷凝管下端提高液面清洗管口，再蒸餾1min而后關(guān)掉

11、熱源，否則可能造成吸收液倒吸。9硼酸吸收液的溫度不應超過40，否則對氨的吸收作用減弱而造成損失，此時可置于冷水浴中。10混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。食品分析與檢驗技術(shù)17v五、測定食品中蛋白質(zhì)的方法（一）食品中蛋白質(zhì)的意義v測定食品蛋白質(zhì)的含量有利于評價食品的營養(yǎng)價值，合理開發(fā)利用食品資源，同時對于提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方具有重要意義 食品分析與檢驗技術(shù)18v食品蛋白質(zhì)測定方法測定方法v利用蛋白質(zhì)的共性，即含氮量、肽鍵和折射率等測定蛋白質(zhì)含量；v利用蛋白質(zhì)中特定的氨基酸殘基、酸性和堿性基團以及芳香基團等測定蛋白質(zhì)含量。凱氏定氮法作為國家標準檢測蛋白質(zhì)

12、的方法，是目前最常用的方法，是測定總有機氮最準確和操作簡便的方法之一.雙縮脲法，染料結(jié)合法，紫外線吸收法，酚試劑法等采用紅外檢測儀對蛋白質(zhì)進行快速定量分析。食品分析與檢驗技術(shù)19v(二)雙縮脲法 當脲被小心加熱至150160時，兩分子間脫去一個氨分子形成雙縮脲，雙縮脲在堿性條件下，能與硫酸銅生成紫紅色配合物，稱為雙縮脲反應，由于蛋白質(zhì)分子中有肽鍵(CONH)，與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，故也能呈現(xiàn)此反應而生成紫紅色配合物，在一定條件下其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，據(jù)此可用吸收光度法來測定蛋白質(zhì)含量，該配合物的最大吸收波長為560nm。食品分析與檢驗技術(shù)20v1標準曲線的繪制以采用凱氏定氮法測出蛋白質(zhì)含量

13、的樣品作為標準蛋白質(zhì)樣品。按蛋白質(zhì)含量40、50、60、70、80、90、100、110mg分別稱取混合均勻的標準蛋白質(zhì)樣于8支50mL納氏比色管中，然后各加入1mL四氯化碳，再用堿性硫酸銅溶液 (或)準確稀釋至50mL，振搖10min，靜置1h，取上層清液離心5min(2000r/min)。取離心分離后的透明液于比色皿中，在560nm波長下以蒸餾水作參比液，調(diào)節(jié)儀器零點并測定各溶液的吸光度值以蛋白質(zhì)的含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。食品分析與檢驗技術(shù)21v2樣品的測定準確稱取樣品適量 (即使得蛋白質(zhì)含量在40110mg)于50mL納氏比色管中，加1mL四氯化碳，按上述步驟顯色后，

14、在相同條件下測其吸光度值。用測得的吸光度值在標準曲線上可查得蛋白質(zhì)毫克數(shù)，由此求得蛋白質(zhì)含量。食品分析與檢驗技術(shù)22v3結(jié)果計算v式中vX樣品蛋白質(zhì)含量，mg/100g。vm由標準曲線上查得的蛋白質(zhì)含量，mg；vm1樣品質(zhì)量，g。v4試劑 堿性硫酸銅溶液、氯化碳。v5儀器分光光度計、離心機。1100mmX食品分析與檢驗技術(shù)23v6注意事項（1）蛋白質(zhì)的種類不同，對發(fā)色程度的影響不大。（2）標準曲線做完整之后，無需每次再做標準曲線。（3）含脂肪高的樣品應預先用醚脫脂。（4）樣品中有不溶性成分存在時，會給比色測定帶來困難，此時可預先將蛋白質(zhì)抽出后再進行測定。（5）當肽鏈中含有脯氨酸時，若有多量糖類

15、共存，顯色不好，測定值偏低。（6）本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學領(lǐng)域中測定蛋白質(zhì)含量時常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種籽及肉類等樣品測定食品分析與檢驗技術(shù)24項目二：測定食品中氨基酸態(tài)氮v一、案例v二、選用國家標準GB/T5009.39-2003醬油衛(wèi)生標準的分析方法甲醛值法。食品分析與檢驗技術(shù)25v三、測定方法1分析步驟v（1）吸取醬油5.0mL于100mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋在至刻度，吸取混勻液20.0mL于200mL燒杯中，加水60mL，開動磁力攪拌器，用0.050mol/L氫氧化鈉滴定至酸度計指示pH為8.2，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液體積。v（2）將燒杯中

16、繼續(xù)加入10.0mL36%甲醛，混勻后用氫氧化鈉標準溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液體積。v（3）做空白實驗，取實驗用水80mL，其余步驟同上，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液體積。 食品分析與檢驗技術(shù)26v4結(jié)果計算v式中vX食品中氨基酸態(tài)氮的含量，g/100mL；vV1測定用試樣稀釋液加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL；vV2試液空白試驗加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL；vV3試樣稀釋液取用量，mL；vc氫氧化鈉標準滴定溶液的濃度，mol/L；v0.014氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol。v5試劑36甲醛溶液（不含聚合物）、0.050mol/L氫氧化鈉標準滴

17、定溶液。v6實驗儀器酸度計、磁力攪拌器、10mL微量滴定管。100100/5014. 0)(321VcVVX食品分析與檢驗技術(shù)27v四、相關(guān)知識（一）食品中氨基酸態(tài)氮含量測定甲醛值法原理（電位滴定法）v利用氨基酸含有-COOH顯示酸性，又含有-NH2顯示堿性的兩性性質(zhì)，當加入甲醛溶液時，-NH2與甲醛結(jié)合，固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，就可用氫氧化鈉標準溶液滴定-COOH，以間接方法測定氨基酸的量。 v本法摘自GB/T T5009.39-2003醬油衛(wèi)生標準的分析方法,適用于食品中游離氨基酸含量的測定，是國家用于糧食和其副產(chǎn)品豆餅、麩皮等為原料釀造或配制醬油中氨基酸態(tài)氮分析方法。（二）注意

18、事項v1氨基酸態(tài)氮是指以氨基酸形式存在的氮元素的含量。對于醬油來說該指標越高，說明醬油中的氨基酸含量越高，鮮味越好。v2固體樣品要先進行粉碎，準確稱樣后用水萃取，然后測定萃取液，萃取在50 水浴中進行；液體樣品可以直接測定。食品分析與檢驗技術(shù)28v五、測定食品中氨基酸態(tài)氮方法（一）食品中氨基酸態(tài)氮的意義v氨基酸態(tài)氮是食品檢測一項重要指標，可以作為食品分級的依據(jù)，如醬油的等級。v食品中氨基酸態(tài)氮測定的方法包括甲醛值法，比色法。甲醛值法除用電位滴定法進行操作外，還可以用指示劑法進行測定，用指示劑作為反應終點。食品分析與檢驗技術(shù)29v（二）雙指示劑甲醛法v指示劑分為單指示劑甲醛滴定法和雙指示劑甲醛滴

19、定法，前者分析結(jié)果稍為偏低，后者更為準確，二者實驗原理同電位滴定法。v1移取含氨基酸約為2030mg的樣品2份，分別置于250mL錐形瓶中，各加50mL蒸餾水，其中1份加入數(shù)滴1g/L中性紅乙醇指示劑，用0.1mol/LNaOH標準溶液滴定至琥珀色為終點；另1份加入數(shù)滴1g/L百里酚酞乙醇指示劑及中性甲醛20mL，搖勻，靜置1min，用0.1mol/LNaOH標準溶液滴定至淡藍色為終點。分別紀錄2次所消耗的NaOH標準溶液體積（mL）。食品分析與檢驗技術(shù)30v2結(jié)果計算v式中vX氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量分數(shù)，%；vc 氫氧化鈉標準溶液的濃度，mol/L；vV1用中性紅作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液

20、的體積，mL；vV2用百里酚酞作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；vm測定用樣品溶液相當于樣品的質(zhì)量，g；v0.014氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol。v3注意事項（1）此法中樣品顏色較深時，可加適量活性炭脫色后再測定。（2）單指示劑甲醛滴定法，只用百里酚酞指示劑。 %100014. 0)(12mcVVX食品分析與檢驗技術(shù)31v（三）比色法簡介 在pH4.8的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中，氨基酸態(tài)氮與乙酰丙酮和甲醛反應生成黃色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4二氫化吡啶氨基衍生物，在波長400nm處測定吸光度，與標準系列比較定量。食品分析與檢驗技術(shù)32項目三：測定食品中氨基酸v一、案例

21、v二、選用的國家標準GB/T5009.124-2003食品中氨基酸的測定自動分析儀測定法。 食品分析與檢驗技術(shù)33v三、測定方法1試樣處理v試樣用勻漿機勻漿后在低溫冰箱中冷凍保存，需要時解凍使用。2稱樣v準確稱取勻漿好的試樣，試樣蛋白質(zhì)含量在1020mg范圍。3水解v在水解管中加入6mol/L鹽酸1020mL，含水量高的試樣可加入等體積的濃鹽酸，加入新蒸餾的苯酚34滴，再將水解管放入冷凍劑中冷凍35min，然后連接真空泵，抽真空后充入高純氮氣，反復三次擰緊螺絲蓋將充滿氮氣封口的水解管放在110士1恒溫干燥箱內(nèi)，水解22h后，取出冷卻。過濾水解液，多次沖洗水解管，將水解液移入50mL容量瓶中定容，吸取1mL濾液于5mL容量瓶中，用真空干燥器在4050干燥，殘留物用12mL水溶解，再干燥，反復兩次，最后蒸干，用1mL pH2.2緩沖溶液溶解，待測。食品分析與檢驗技術(shù)34v4測定 準確吸取0.200mL混合氨基酸標準溶液，用pH2.2的緩沖溶液稀釋到5mL，此標準溶液稀釋濃度為5.00nmol/