實驗四酸性磷酸酶Km及Vmax值測定

1、酸性磷酸酶酸性磷酸酶KmKm及及VmaxVmax值測定值測定清洗試管清洗試管2424支支 酸性磷酸酶：酸性磷酸酶： 催化磷酸單酯的水解反應(yīng)催化磷酸單酯的水解反應(yīng) 存在于人的肝臟，前列腺等處存在于人的肝臟，前列腺等處 植物中以發(fā)芽的種子中含量最為豐富。植物中以發(fā)芽的種子中含量最為豐富。 是生物體中重要的一種酶類，為某些疾病的檢測是生物體中重要的一種酶類，為某些疾病的檢測指標。指標。 一、概述一、概述 酶液酶液 磷酸苯二鈉磷酸苯二鈉 苯酚苯酚 磷酸氫二鈉磷酸氫二鈉 folin-酚測定酚的濃度酚測定酚的濃度 計算出反應(yīng)速度（用產(chǎn)物生成量計算出反應(yīng)速度（用產(chǎn)物生成量/min來表示）來表示） 根據(jù)雙倒數(shù)

2、法計算出根據(jù)雙倒數(shù)法計算出Km及及Vmax 二、實驗原理 V=VmaxSSKm+三、實驗步驟：三、實驗步驟：1 1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取2 2、制作酶反應(yīng)時間與產(chǎn)物生成量的關(guān)系曲線、制作酶反應(yīng)時間與產(chǎn)物生成量的關(guān)系曲線3 3、制作酚標準曲線、制作酚標準曲線 4 4、SS與與V V0 0關(guān)系實驗關(guān)系實驗 5 5、雙倒數(shù)作圖法計算、雙倒數(shù)作圖法計算VmaxVmax和和KmKm buffersubstrateenzymeCertain TimeblankStop the reactionColor developed 生化實驗課老師：于曉虹 實驗報告請交到講臺上來

3、酶液稀釋取上清液微升，稀釋倍，用大試管裝 科代表李博恒 1、磷酸酶原液的制備：磷酸酶原液的制備： 稱取稱取5g5g綠豆芽莖（去頭去根），加入綠豆芽莖（去頭去根），加入pH5.6pH5.6的的HACHAC緩沖液緩沖液2ml2ml研磨成漿并靜置研磨成漿并靜置3030分鐘。紗布過濾，分鐘。紗布過濾，取取1.8ml1.8ml濾液濾液, ,以以6000rpm6000rpm，離心，離心20min20min，取上清。，取上清。 上清液用上清液用pH 5.6pH 5.6的的HACHAC緩沖液稀釋緩沖液稀釋3030倍，用于實倍，用于實驗。驗。 2 2、制作酶、制作酶反應(yīng)時間反應(yīng)時間與產(chǎn)物生成量的關(guān)系曲線與產(chǎn)物生

4、成量的關(guān)系曲線 （目的：選取合適的反應(yīng)時間）（目的：選取合適的反應(yīng)時間） 加加 液液 程程 序序 表表管號管號 1 2 3 4 5 6 01 2 3 4 5 6 0磷酸苯二鈉磷酸苯二鈉 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5酶液酶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5精確反應(yīng)時間精確反應(yīng)時間 3 5 10 15 20 25 3 5 10 15 20 25 碳酸鈉溶液碳酸鈉溶液 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 酶液酶液 0.50.5FolinFo

5、lin酚溶液酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 FolinFolin酚溶液已稀釋好！酚溶液已稀釋好！注：注： 進行酶促反應(yīng)時，注意預(yù)熱，使所有的反應(yīng)在同等條件下開始進行酶促反應(yīng)時，注意預(yù)熱，使所有的反應(yīng)在同等條件下開始35保溫保溫10分鐘分鐘0123456反應(yīng)時間反應(yīng)時間03510152025吸光度吸光度結(jié)果：結(jié)果：以反應(yīng)時間為橫坐標，以反應(yīng)時間為橫坐標，A680nm為縱坐標，繪制反為縱坐標，繪制反應(yīng)進程曲線，并從該曲線上求出酸性磷酸酶反應(yīng)初應(yīng)進程曲線，并從該曲線上求出酸性磷酸酶反應(yīng)初速率的時間范圍。速率的時間范

6、圍。 3 3、制作酚標準曲線、制作酚標準曲線 （目的：可從酚標準曲線上查出（目的：可從酚標準曲線上查出A A680680nmnm所相所相當?shù)姆雍慨數(shù)姆雍? ,并計算出反應(yīng)速度（用每分鐘并計算出反應(yīng)速度（用每分鐘產(chǎn)物生成量來表示）產(chǎn)物生成量來表示）0123456780.4mM phenol standard solution00.10.20.30.40.50.60.70.8H2O10.90.80.70.60.50.40.30.21M Na2CO3222222222Folin-phenol reagent0.50.50.50.50.50.50.50.50.5加加 液液 程程 序序 表表35保溫

7、保溫10分鐘分鐘012345678酚含量酚含量/mol00.040.080.120.160.200.240.280.32吸光度吸光度結(jié)果：結(jié)果：以酚含量（以酚含量（mol）為橫坐標，）為橫坐標，A680nm為縱坐標，繪制標準曲線為縱坐標，繪制標準曲線。以以0號管作空白，在可見光分光光度計號管作空白，在可見光分光光度計680 nm波長處讀取各管的吸光度波長處讀取各管的吸光度（A680nm）。）。 4 4、SS與與V V0 0關(guān)系實驗關(guān)系實驗 實實 驗驗 加加 液液 程程 序序 表表管號管號 1 2 3 4 5 6 01 2 3 4 5 6 0磷酸苯二鈉磷酸苯二鈉 0.10 0.15 0.20 0

8、.25 0.30 0.50 0.500.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.50 0.50 醋酸緩沖液醋酸緩沖液 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 - - 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 - - 酶液酶液 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.500.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 - - 精精 確確 反反 應(yīng)應(yīng) 15 15 分分 鐘鐘 3535度度碳酸鈉溶液碳酸鈉溶液 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 FolinFolin酚溶液酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液酶液 0.50.5 3535保溫保溫1010分鐘分鐘測測680nm680nm處吸光度處吸光度 注：注： 進行酶促反應(yīng)時，注意預(yù)熱，使所有的反應(yīng)在同等條件下開始進行酶促反應(yīng)時，注意預(yù)熱，使所有的反應(yīng)在同等條件下開始 實驗中需注意事項：實驗中需注意事項： 酶反應(yīng)作用時間精確控制酶反應(yīng)作用時間精確控制 Tube number123456S (mM)0.50.7511.251.52.51/SA680phenol content（酚含量）V0 (mole phenol per min)1/ V0實