海洋生物技術(shù)—海洋動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)定稿

1、海洋生物技術(shù)海洋動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)定稿一、細(xì)胞工程與細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞工程細(xì)胞工程 (cell engineering)是以細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)為是以細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)為基礎(chǔ)理論，采用原生質(zhì)體、細(xì)胞或組織培養(yǎng)等試驗(yàn)方法或技術(shù)，在基礎(chǔ)理論，采用原生質(zhì)體、細(xì)胞或組織培養(yǎng)等試驗(yàn)方法或技術(shù)，在細(xì)胞水平上研究改造生物遺傳特性，以獲得具有新的性狀的細(xì)胞系細(xì)胞水平上研究改造生物遺傳特性，以獲得具有新的性狀的細(xì)胞系或生物體以及生物的次生代謝產(chǎn)物，并發(fā)展有關(guān)理論和技術(shù)方法的或生物體以及生物的次生代謝產(chǎn)物，并發(fā)展有關(guān)理論和技術(shù)方法的學(xué)科。學(xué)科。 細(xì)胞工程的核心技術(shù)：細(xì)胞培養(yǎng)與繁殖細(xì)胞工程的核心技術(shù)：細(xì)胞培養(yǎng)與繁殖 目

2、的：獲得新性狀、新個(gè)體、新物質(zhì)目的：獲得新性狀、新個(gè)體、新物質(zhì)1 細(xì)胞工程的定義細(xì)胞工程的定義2 細(xì)胞工程的研究范疇動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)細(xì)胞融合細(xì)胞核移植染色體工程胚胎工程干細(xì)胞與組織工程轉(zhuǎn)基因生物與生物反應(yīng)器n植物植物n分化成熟的植物細(xì)胞體，仍有可能發(fā)育成完整植株。n動(dòng)物動(dòng)物n隨著分化的演進(jìn)，分化成熟細(xì)胞逐漸喪失其分化潛能,不能發(fā)育成為完整的動(dòng)物個(gè)體。n實(shí)驗(yàn)證明，囊胚階段的細(xì)胞乃至成熟的體細(xì)胞，保持著全套基因組的細(xì)胞核仍具有全能性可能發(fā)育成完整個(gè)體。n細(xì)胞質(zhì)中有著決定細(xì)胞分化全能性的物質(zhì)，稱為分化決定子。決定動(dòng)物細(xì)胞全能性的關(guān)鍵在于細(xì)胞質(zhì)。植物體細(xì)胞具有全能性動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

3、的發(fā)展或動(dòng)物胚胎或動(dòng)物胚胎分散成單個(gè)細(xì)分散成單個(gè)細(xì)胞胞一定濃度的細(xì)胞一定濃度的細(xì)胞懸浮液懸浮液原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)遺傳物質(zhì)改變遺傳物質(zhì)改變傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞株細(xì)胞株：原代細(xì)胞和原代細(xì)胞和50代前的傳代細(xì)胞叫做細(xì)胞代前的傳代細(xì)胞叫做細(xì)胞株。株。細(xì)胞系細(xì)胞系：50代后，遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，并代后，遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，并且有癌變的特點(diǎn)，無(wú)限傳下去的傳代細(xì)胞。且有癌變的特點(diǎn)，無(wú)限傳下去的傳代細(xì)胞。細(xì)胞株細(xì)胞株 細(xì)胞系細(xì)胞系 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)合成培養(yǎng)基的種類雖多，但一般都含有氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和一些其它輔助性成分。(1)氨基酸 必需氨基酸是

4、動(dòng)物細(xì)胞本身不能合成的，因此，在制備培養(yǎng)基時(shí)需加入必需氨基酸，另外還需要半胱氨酸和酪氨酸。而且由于細(xì)胞系不同，對(duì)各種氨基酸的需要也不同。有時(shí)也加入其他非必需氨基酸，氨基酸濃度常常限制可得到的最大細(xì)胞密度，其平衡可影響細(xì)胞存活的生長(zhǎng)速率。在細(xì)胞培養(yǎng)中，大多數(shù)細(xì)胞需要谷氨酰胺作為能源和碳源。(氨基酸為L(zhǎng)型)(2)維生素 Eagle基本培養(yǎng)基中只含B族維生素，其他維生素都靠從血清中取得。血清濃度降低時(shí)，對(duì)其他維生素的需求更加明顯，但也有些情況，即使血清存在，它們也必不可少。維生素限制可從細(xì)胞存活和生長(zhǎng)速率看出，而不是以最大細(xì)胞密度為指標(biāo)。(3)碳水化合物 碳水化合物是細(xì)胞生命的能量來(lái)源，有的是合成蛋

5、白質(zhì)和核酸的成分，主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸鈉等。(4)無(wú)機(jī)鹽 無(wú)機(jī)鹽是細(xì)胞的重要組成部分之一，它們積極參與細(xì)胞的代謝活動(dòng)。無(wú)機(jī)鹽中Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO42-、PO43-和HCO3-等金屬離子及酸根離子是決定培養(yǎng)基滲透壓的主要成分。對(duì)懸浮培養(yǎng)，要減少鈣，可使細(xì)胞聚集和貼壁最少，碳酸氫鈉濃度與氣相CO2濃度有關(guān)。(5)有機(jī)添加劑 復(fù)雜培養(yǎng)基都含有核苷、檸檬酸循環(huán)中間體、丙酮酸、脂類、氧化還原劑如抗壞血酸、谷胱甘肽等及其他各種化合物。同樣，當(dāng)血清量減少時(shí)，必須添加這種化合物，它們對(duì)克隆和維持這些特殊細(xì)胞有益。(6)血清 組織細(xì)胞培養(yǎng)中常用的天然培養(yǎng)基是血

6、清。這是因?yàn)檠逯泻写罅康牡鞍踪|(zhì)、核酸、激素等豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，粘附及中和某些物質(zhì)的毒性起著一定的作用。最常用的是小牛血清，胎牛血清。人血清用于一些人細(xì)胞系。大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)必須在培養(yǎng)基中添加血清，但在許多情況下，細(xì)胞可在無(wú)血清條件下維持和增殖。 目前合成培養(yǎng)基的配方都已相對(duì)固定，并形成配制好的干粉型商品。其成分趨于簡(jiǎn)單化，以能維持細(xì)胞生長(zhǎng)的最低需求，而去除了不必要的成份。同時(shí)為適應(yīng)某些特殊培養(yǎng)的需要補(bǔ)加一些新的成分，如培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞時(shí)采用DMEM培養(yǎng)基需補(bǔ)加丙酮酸鈉和2-硫基乙醇；為增加細(xì)胞轉(zhuǎn)化和DNA合成，有時(shí)補(bǔ)加植物血凝素(PHA)等。這些變化需根據(jù)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞的具體

7、要求而定。培養(yǎng)方法和環(huán)境要求培養(yǎng)方法和環(huán)境要求（一）培養(yǎng)的方法動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)有兩種類型：1.貼壁依賴性細(xì)胞，大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞，包括非淋巴組織的細(xì)胞和許多異倍體體系的細(xì)胞部屬于這一類型。這一類需采用貼壁培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)是指大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下都需要附著在帶有適量正電荷的固體或半固體的表面上才能正常生長(zhǎng)，并最終在附著表面擴(kuò)展成單層。基本操作過(guò)程是：先將采集到的活體動(dòng)物組織在無(wú)菌條件下采用物理(機(jī)械分散法)或化學(xué)(酶消化法)的方法分散成細(xì)胞懸液，經(jīng)過(guò)濾、離心、純化、漂洗后接種到加有適宜培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿(瓶、板)中，再放入二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。用此法培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)良好且易于觀察，適于

8、實(shí)驗(yàn)室研究。但貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞有接觸抑制的特性，一旦細(xì)胞形成單層，生長(zhǎng)就會(huì)受到抑制，細(xì)胞產(chǎn)量有限。如要繼續(xù)培養(yǎng)，還需將已形成單層的細(xì)胞再分散，稀釋后重新接種，然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。2.非貼壁依賴性細(xì)胞，來(lái)源于血液、淋巴組織的細(xì)胞，許多腫瘤細(xì)胞(包括雜交瘤細(xì)胞)和某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞屬于這一類型。這一類可采用類似微生物培養(yǎng)的方法進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)是指少數(shù)懸浮生長(zhǎng)型動(dòng)物細(xì)胞在離體培養(yǎng)時(shí)不需要附著物，懸浮于培養(yǎng)液中即可良好生長(zhǎng)。懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞其培養(yǎng)和傳代都十分簡(jiǎn)便。培養(yǎng)時(shí)只需將采集到的活體動(dòng)物組織經(jīng)分散、過(guò)濾、純化、漂洗后，按一定密度接種于適宜培養(yǎng)液中，置于特定的培養(yǎng)條件下即可良好生長(zhǎng)。傳代時(shí)不需要再

9、分散，只需按比例稀釋后即可繼續(xù)培養(yǎng)。此法細(xì)胞增殖快，產(chǎn)量高，培養(yǎng)過(guò)程簡(jiǎn)單，是大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的理想模式。但在動(dòng)物體中只有少數(shù)種類的細(xì)胞適于懸浮培養(yǎng)。1、分批式培養(yǎng)(Batch culture)分批式培養(yǎng)是指先將細(xì)胞和培養(yǎng)液一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，同時(shí)產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)后，終止培養(yǎng)。在細(xì)胞分批培養(yǎng)過(guò)程中，不向培養(yǎng)系統(tǒng)補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而只向培養(yǎng)基中通入氧，能夠控制的參數(shù)只有pH值、溫度和通氣量。因此細(xì)胞所處的生長(zhǎng)環(huán)境隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和產(chǎn)物、副產(chǎn)物的積累時(shí)刻都在發(fā)生變化，不能使細(xì)胞自始至終處于最優(yōu)的條件下，因而分批培養(yǎng)并不是一種理想的培養(yǎng)方式。分批培養(yǎng)過(guò)程特征如圖

10、 2、分批補(bǔ)料式培養(yǎng)(Fed-batch culture)分批補(bǔ)料式培養(yǎng)是指先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，在適宜的條件下接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，產(chǎn)物不斷形成，而在此過(guò)程中隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，不斷地向系統(tǒng)中補(bǔ)充新的營(yíng)養(yǎng)成分，使細(xì)胞進(jìn)一步生長(zhǎng)代謝，直到整個(gè)培養(yǎng)結(jié)束后取出產(chǎn)物。分批補(bǔ)料式培養(yǎng)只是向培養(yǎng)系統(tǒng)補(bǔ)加必要的營(yíng)養(yǎng)成分，以維持營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度不變。由于分批補(bǔ)料式培養(yǎng)能控制更多的環(huán)境參數(shù)，使得細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成容易維持在優(yōu)化狀態(tài)。3、半連續(xù)式培養(yǎng)(Semi-continuous culture)半連續(xù)式培養(yǎng)是在分批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，將分批培養(yǎng)的培養(yǎng)液部分取出，并重新補(bǔ)充加入等量的新鮮培

11、養(yǎng)基，從而使反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變的培養(yǎng)方式。 4、連續(xù)式培養(yǎng)(Continuous culture)連續(xù)式培養(yǎng)是指將細(xì)胞種子和培養(yǎng)液一起加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮培養(yǎng)液不斷加入反應(yīng)器內(nèi)，另一方面又將反應(yīng)液連續(xù)不斷地取出，使反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài)。與分批式培養(yǎng)不同，連續(xù)式培養(yǎng)可以保持細(xì)胞所處環(huán)境條件長(zhǎng)時(shí)間地穩(wěn)定，可以使細(xì)胞維持在優(yōu)化的狀態(tài)下，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的形成。由于連續(xù)式培養(yǎng)過(guò)程可以連續(xù)不斷地收獲產(chǎn)物，并能提高細(xì)胞密度，在生產(chǎn)上已被應(yīng)用于培養(yǎng)非貼壁依賴性細(xì)胞。 連續(xù)培養(yǎng)一般是采用灌注培養(yǎng)：灌注培養(yǎng)灌注培養(yǎng)是把細(xì)胞接種后進(jìn)行培養(yǎng)，一方面連續(xù)往反應(yīng)器中加入新鮮的培養(yǎng)基，同時(shí)

12、又連續(xù)不斷地取出等量的培養(yǎng)液，但是過(guò)程中不取出細(xì)胞，細(xì)胞仍留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種營(yíng)養(yǎng)不斷的狀態(tài)。高密度培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，必須確保補(bǔ)充給細(xì)胞足夠的營(yíng)養(yǎng)以及除去有毒的代謝物。灌注培養(yǎng)時(shí)用新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行添加，確保上述目的實(shí)現(xiàn)。通過(guò)調(diào)節(jié)添加速度，則使培養(yǎng)保持在穩(wěn)定的、代謝副產(chǎn)物低于抑制水平的狀態(tài)。采用此法，可以大大提高細(xì)胞的生長(zhǎng)密度，有助于產(chǎn)物的表達(dá)和純化。由于連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程可以連續(xù)不斷地收獲產(chǎn)物，并能提高細(xì)胞密度，因此，在生產(chǎn)中廣泛被采用。如英國(guó)Celltech公司采用灌注培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，連續(xù)不斷地生產(chǎn)單克隆抗體，獲得巨大經(jīng)濟(jì)效益。雖然灌注培養(yǎng)具有不少優(yōu)點(diǎn)，但也存在培養(yǎng)基消耗量比較大，操作過(guò)程復(fù)雜

13、，培養(yǎng)過(guò)程中，易受污染等缺點(diǎn)。（二）細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境要求細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖和代謝等生理性質(zhì)，在很大程度上受各種環(huán)境因素的影響。為了使動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)處于最佳狀態(tài)，了解環(huán)境因素對(duì)其影響無(wú)疑是很重要的。影響動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖的環(huán)境因素很多，主要有細(xì)胞生長(zhǎng)的支持物、氣體交換、培養(yǎng)溫度、pH、滲透壓及其它因素等方面。 1、支持物 體外培養(yǎng)的大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞需在人工支持物上單層生長(zhǎng)。在早期的實(shí)驗(yàn)中，用玻璃作為支持物，開始是由于它的光學(xué)特性，后來(lái)發(fā)現(xiàn)它具有合適的電荷適合于細(xì)胞貼壁和具有合適的電荷適合于細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)生長(zhǎng)。 (1) 玻璃 玻璃常用作支持物。它很便宜，容易洗滌，且不損失支持生長(zhǎng)的性質(zhì)，可方便地用于干熱或

14、濕熱滅菌，透光性好，強(qiáng)堿可使玻璃對(duì)培養(yǎng)產(chǎn)生不良影響，但用酸洗中和后即可。 (2) 塑料制品 一次性的聚苯乙烯瓶一次性的聚苯乙烯瓶是一種方便的支持物。但制成的聚苯乙烯是疏水性的，但它不適合于細(xì)胞生長(zhǎng)它不適合于細(xì)胞生長(zhǎng)，所以細(xì)胞培養(yǎng)用的塑料用品要用用射線、化學(xué)射線、化學(xué)藥品或電弧處理使之產(chǎn)生帶電荷的表面，具有可潤(rùn)濕性藥品或電弧處理使之產(chǎn)生帶電荷的表面，具有可潤(rùn)濕性。它光學(xué)性質(zhì)好，培養(yǎng)表面平。除此之外，細(xì)胞也可在聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯和其他塑料上生長(zhǎng)。 (3) 微載體 大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)最常用的支持物是微載體。其材料有聚苯乙烯、交聯(lián)葡萄糖、聚丙烯酰胺、纖維素衍生物、幾聚苯乙烯、交聯(lián)葡萄糖

15、、聚丙烯酰胺、纖維素衍生物、幾丁質(zhì)、明膠丁質(zhì)、明膠等。通常用特殊的技術(shù)制成100200m直徑的圓形顆粒，微載體的制備是一種較復(fù)雜的技術(shù)，微載體的價(jià)格一般也比較貴。但它的最大優(yōu)點(diǎn)是使貼壁細(xì)胞可以像懸浮培養(yǎng)那樣進(jìn)行。微載體表面光滑，有的還在表面深層，使表面帶有少量正電荷，適合于細(xì)胞貼附。 支持物通過(guò)各種預(yù)處理后，可改善細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)性能。用過(guò)的玻璃容器比新的更適合細(xì)胞生長(zhǎng)。這可能歸因于培養(yǎng)后的表面的蝕刻和剩余的微量物質(zhì)，培養(yǎng)瓶中細(xì)胞的生長(zhǎng)也可以改善表面以利第二次接種，這類調(diào)節(jié)因素可能是由于細(xì)胞釋放出的膠原或黏素。 2、氣體交換 (1)氧氣 氣相中的重要成分是氧氣和二氧化碳。各種培養(yǎng)對(duì)氧的要求不同

16、，大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)適合于大氣中的氧含量或更低些。據(jù)報(bào)道，對(duì)培養(yǎng)基硒含量的要求與氧濃度有關(guān)，硒有助于除去呈自由基狀態(tài)的氧。在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中，氧可能成為細(xì)胞密度的限制因素。 (2)二氧化碳 二氧化碳對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)起著相對(duì)復(fù)雜的作用，氣相中的C02濃度直接調(diào)節(jié)溶解態(tài)C02的濃度，溶解態(tài)的C02受溫度影響，C02溶于培養(yǎng)基中形成H2C03，產(chǎn)生H2C03又能再離解： 由于HCO3-與多數(shù)陽(yáng)離子的離解數(shù)很小，趨于結(jié)合態(tài)，故使培養(yǎng)基變酸。提高氣相中CO2含量的結(jié)果是降低培養(yǎng)液pH值，而它又被加入NaHC03濃度所中和： 若HCO3-濃度增加，則式(14-18)平衡向左邊移動(dòng)，直到系統(tǒng)在pH=7.4達(dá)到

17、平衡。如果換用其他物質(zhì)，如NaOH，實(shí)際效果是一樣的：2.2 魚類組織或細(xì)胞的來(lái)源魚類的很多組織和器官均可用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，但比但比較常用的是魚類的胚胎組織和幼魚的組織器官。由較常用的是魚類的胚胎組織和幼魚的組織器官。由于這些組織和器官的分化程度低，分裂潛能大于這些組織和器官的分化程度低，分裂潛能大，所以是用于魚類原代細(xì)胞培養(yǎng)的最佳材料。成魚的性腺、腎、心、鰾、脾臟、鰭條、吻端性腺、腎、心、鰾、脾臟、鰭條、吻端等也是比較常用的培養(yǎng)材料，尤其是性腺與腎臟性腺與腎臟的應(yīng)用最為廣泛。2.3 魚類細(xì)胞培養(yǎng)的方法與技術(shù) 目前較常用的原代培養(yǎng)的方法是：組織塊法、機(jī)械分散法、絡(luò)合劑分散法和酶消化法。組織塊法：當(dāng)組織量較少時(shí)可采用此法。它是將組織剪成約1mm3的小塊，按一定比例將組織塊涂布在瓶壁上(每個(gè)25ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶約涂布25塊組織塊)，經(jīng)4-5h細(xì)胞貼壁后，輕輕加入適量的培養(yǎng)基，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。機(jī)械分散法：適用于細(xì)胞間連接較松散的組織，如胚胎組織及幼魚全魚。將組織剪成約1mm3的小塊，放入底部有一銅網(wǎng)的注射器內(nèi)，用壓力將組織擠出網(wǎng)孔，最后將分散的組織吹打后加入培養(yǎng)基，分裝，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。絡(luò)合劑分散法：目前使用的絡(luò)合劑主要是EDTA(乙二胺四乙酸)，它能與細(xì)胞間的鈣離子、鎂離子結(jié)合而使細(xì)胞連接松散，經(jīng)吹打即可分散。該法目前主要用于囊胚細(xì)胞培養(yǎng)及上皮型細(xì)胞系的傳代。