細(xì)胞培養(yǎng)概述—左琳

1、細(xì)胞培養(yǎng)概述主講人：左琳細(xì)胞培養(yǎng)的條件細(xì)胞的傳代培養(yǎng)細(xì)胞的凍存細(xì)胞的復(fù)蘇細(xì)胞的計(jì)數(shù)MTT法細(xì)胞培養(yǎng)的條件細(xì)胞培養(yǎng)的條件培養(yǎng)用具的處理培養(yǎng)條件環(huán)境條件環(huán)境條件1、進(jìn)入培養(yǎng)室前要至少打開紫外燈照射30min2、細(xì)胞室每周隔兩三天打掃衛(wèi)生，用0.2的新潔而滅拖洗地面并擦拭實(shí)驗(yàn)室內(nèi)各儀器表面。門把手等常易潛藏細(xì)菌的地方用75酒精噴灑抑菌。3、恒溫水浴振蕩器內(nèi)的水每隔大約一周（水不澄清）更換一次，加兩支硫酸慶大霉素。4、培養(yǎng)箱托盤內(nèi)的水定期更換，保證無菌。超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)1、使用前以70 % ethanol 擦拭無菌操作臺(tái)面并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。2、每次操作只處理一株

2、細(xì)胞，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。3、實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70%ethanol 擦拭無菌操作抬面。4、工作臺(tái)面上用品不要過多或重疊放置，否則會(huì)遮擋射線，降低消毒效果。培養(yǎng)條件 氣體環(huán)境：氣體環(huán)境：9595空氣加空氣加5 5COCO2 2混和氣體混和氣體環(huán)境中。環(huán)境中。 PHPH值：值：7.27.27.47.4 溫度：溫度：37培養(yǎng)用具的處理1.1.清洗和浸泡清洗和浸泡: :(1)玻璃器皿:新的玻璃器皿在生產(chǎn)過程中常使玻璃表面呈堿性，并帶有一些如鉛和砷等對(duì)細(xì)胞有毒的物質(zhì)，使用前必須徹底清洗。首先用自來水初步刷洗，在5稀鹽酸溶液中浸泡過夜。然后用流水徹底沖洗3-5遍，單蒸餾水漂洗3

3、遍，三（雙）蒸水漂洗2遍，烘干備用。（2 2）塑料器皿）塑料器皿: :塑料器皿經(jīng)沖凈后，晾干，用2NaOH浸泡過夜，自來水沖洗干凈，流水徹底沖洗3-5遍，單蒸餾水漂洗3遍，三（雙）蒸水漂洗2遍，烘干備用。 注意：離心管等滅菌后在超凈臺(tái)內(nèi)取出使用時(shí)應(yīng)該立即將螺旋旋緊；EP管等可至于鋁制飯盒內(nèi)，表面以多層紗布覆蓋，亦不可開口暴露在外，以減少污染的機(jī)會(huì)。2.包裝： 在消毒前必須進(jìn)行嚴(yán)格包裝，以便消毒及儲(chǔ)存，防止落入灰塵及消毒后再次被污染。包裝紙（盒）表面用油性記號(hào)筆標(biāo)明物品名稱、消毒日期等。 3.滅菌： 高壓蒸汽滅菌鍋滅菌三十分鐘，取出烘干。細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 1.小心傾出舊培養(yǎng)液，用23mlPBS清洗

4、兩遍，加入適量消化液（胰蛋白酶液）。注意：消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最見效溫度為37。 2.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，若細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。 3.傾去消化液，加入一定量的培養(yǎng)液，用刻度吸管將已經(jīng)消化的細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。 4.將細(xì)胞懸液吸出分裝至若干個(gè)培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)液，旋緊瓶蓋，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 1.適度消化：消化不好細(xì)胞不能吹打下來形成懸液，消化太過細(xì)胞會(huì)脫落損失，若過多脫落則需離心，對(duì)細(xì)胞的傷害比較大。 2.吹打時(shí)要注意刻度吸管不要?jiǎng)潅?xì)胞，吹打動(dòng)作要輕，避免產(chǎn)生過多的氣泡。 3.處理細(xì)胞比較多時(shí)，要保持頭腦清晰，把PBS、培養(yǎng)

5、液、吹打用的刻度吸管區(qū)分開，避免交叉污染。 4.傳代前后注意用顯微鏡觀察細(xì)胞的狀態(tài)和數(shù)量，做好記錄。細(xì)胞的凍存1.按常規(guī)方法消化處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞培養(yǎng)物，制備單細(xì)胞懸液，并計(jì)算細(xì)胞總數(shù)；2.將細(xì)胞懸液以8001000r/min離心5min，去上清液；3.向細(xì)胞沉淀物中加入冷凍保護(hù)液，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞密度達(dá)1106 1107個(gè)/ml4.按每管11.5ml的量分裝于凍存管內(nèi)，擰緊管蓋；5.在凍存管上做好標(biāo)記，包括細(xì)胞代號(hào)及凍存日期。 1.先將凍存管放入普通冰箱冷藏室（48），約40min； 2.接著將凍存管置于普通冰箱凍存室（-10-20），約 3060min； 3.將凍存管轉(zhuǎn)入低溫冰箱（-

6、30），放置30min左右； 4.然后將凍存管轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱（ -70-80 ），過夜； 5.最后將凍存管投入液氮保存 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 1.冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長情 形。 2.配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為5-10，混合均勻，置于室溫下待用。（原液血清 DMSO=6 3 1配完后過0.22m微孔濾膜） 3.溫度逐漸降低，不可快速過渡細(xì)胞的復(fù)蘇 1.自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時(shí)蓋子易松掉。 2. 將新鮮培養(yǎng)基置于37 C 水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無菌操作臺(tái)

7、內(nèi)。 3. 取出冷凍管，立即放入37 C 水槽中快速解凍，輕搖凍存管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，以75% 酒精擦拭凍存管外部，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。 4. 取出細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例1:101:15)，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑(DMSO):依細(xì)胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10 ml 培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，1000 r/min離心5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基

8、。 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)： 1. 冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié) 晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 2. 取出凍存管時(shí)要先檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時(shí)蓋子易松掉。 細(xì)胞計(jì)數(shù)操作步驟操作步驟 1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用軟紗布擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。 2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。 3、靜置3分鐘。 4、計(jì)數(shù) 鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml（ 四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4)稀釋倍數(shù)104 /ml 細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn) 1.要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個(gè)/m

9、l，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中； 2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性； 3.取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；4.4.操作時(shí)，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。 5 5. .數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左線，不計(jì)右線。 MTT法 MTT的全稱為3-（4,5）-雙甲基-2-噻唑-（2,5）-2苯基溴化四氮唑藍(lán)，其分子中的四氮唑環(huán)在活細(xì)胞線粒體酶的作用下，被還原為不溶性的紫蘭色結(jié)晶甲瓚化合物，

10、甲瓚數(shù)量同活細(xì)胞數(shù)成正比。再經(jīng)適當(dāng)溶解后，可通過酶標(biāo)儀測OD值，計(jì)算抑制率。 抑制率=（1-加藥組OD值/對(duì)照組OD值）100步驟 1.取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，胰蛋白 酶消化后，用培養(yǎng)液制成單 細(xì)胞懸液。 2.調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)1104/ml ，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200ul，于37、5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 3.約24h后細(xì)胞貼壁良好，吸棄培養(yǎng)液，加入各濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)。 4.48h后，各孔加入20ulMTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄培養(yǎng)上清，每孔加入DMSO150ul待結(jié)晶溶解后酶標(biāo)儀上檢測490nm波長下的吸光度(OD)值。注意事項(xiàng) 實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、空白組和藥物處理組，均可設(shè)置多個(gè)重復(fù)孔，增加準(zhǔn)確性。 頭腦清晰，精力集中，不可用混槍頭。 吸取上清動(dòng)作要輕，可將96孔板輕輕地傾斜30左右，用移液管緊貼小孔較低的內(nèi)壁緩緩下滑，同時(shí)緩緩將上清液吸出，避免細(xì)胞和結(jié)晶物的損失 。 貼壁細(xì)胞一般在試驗(yàn)前1-2日接入孔板 太晚，細(xì)胞在傳代后有一個(gè)小時(shí)左右的停滯期，此時(shí)代謝變慢，增殖緩慢，及對(duì)數(shù)曲線的