Westernblot實(shí)驗(yàn)步驟

1、Western blot（免疫印跡）（免疫印跡）Western blotWestern blot是是2020世紀(jì)世紀(jì)7070年代末和年代末和8080年代初，年代初，在蛋白質(zhì)凝膠在蛋白質(zhì)凝膠電泳和固相免疫測定的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種廣泛應(yīng)用于電泳和固相免疫測定的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)檢測的分子生物學(xué)技術(shù)。它是將蛋白質(zhì)凝膠電泳、蛋白質(zhì)檢測的分子生物學(xué)技術(shù)。它是將蛋白質(zhì)凝膠電泳、印跡、免疫測定融為一體的特異性蛋白質(zhì)檢測技術(shù)印跡、免疫測定融為一體的特異性蛋白質(zhì)檢測技術(shù)。與。與SouthernSouthern、NorthernNorthern雜交方法類似，但雜交方法類似，但Western B

2、lotWestern Blot被檢被檢測物是蛋白質(zhì)，測物是蛋白質(zhì)，“探針探針”是抗體，它具有直觀、特異、靈是抗體，它具有直觀、特異、靈敏（敏（pg)pg)的優(yōu)點(diǎn)，且可進(jìn)行蛋白質(zhì)的定性及半定量分析。的優(yōu)點(diǎn)，且可進(jìn)行蛋白質(zhì)的定性及半定量分析。 Western blotWestern blot實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理： 蛋白質(zhì)混合樣品經(jīng)蛋白質(zhì)混合樣品經(jīng)SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)電泳使蛋白質(zhì)按分子大小分離，將分離的各蛋白質(zhì)條電泳使蛋白質(zhì)按分子大小分離，將分離的各蛋白質(zhì)條帶（帶（其中含有能與特異性抗體相應(yīng)的待檢測的蛋白即其中含有能與特異性抗體相應(yīng)的待檢

3、測的蛋白即抗原蛋白抗原蛋白）原位轉(zhuǎn)移到固相載體膜上（蛋白條帶轉(zhuǎn)移）原位轉(zhuǎn)移到固相載體膜上（蛋白條帶轉(zhuǎn)移到到NCNC、PVDFPVDF膜上此過程稱為膜上此過程稱為blotting blotting ），用無關(guān)蛋），用無關(guān)蛋白質(zhì)封閉液（如白質(zhì)封閉液（如BSABSA）封閉膜的非特異性位點(diǎn)（）封閉膜的非特異性位點(diǎn)（膜上膜上沒有蛋白轉(zhuǎn)移上去的位點(diǎn)沒有蛋白轉(zhuǎn)移上去的位點(diǎn)），加入特異性抗體（即一），加入特異性抗體（即一抗，是抗目的蛋白的抗體）后印跡上的目的蛋白（抗抗，是抗目的蛋白的抗體）后印跡上的目的蛋白（抗原）與一抗發(fā)生特異性的免疫結(jié)合反應(yīng)，洗滌后再加原）與一抗發(fā)生特異性的免疫結(jié)合反應(yīng)，洗滌后再加入能與一

4、抗發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)的酶標(biāo)記二抗入能與一抗發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)的酶標(biāo)記二抗( (二抗即二抗即抗抗體，是以一抗為抗原免疫動物產(chǎn)生的抗體抗抗體，是以一抗為抗原免疫動物產(chǎn)生的抗體) )，最，最后通過二抗上標(biāo)記酶的性質(zhì)進(jìn)行檢測，即根據(jù)底物顯后通過二抗上標(biāo)記酶的性質(zhì)進(jìn)行檢測，即根據(jù)底物顯色的顏色有無及深淺（或發(fā)光有無及發(fā)光強(qiáng)弱）來探色的顏色有無及深淺（或發(fā)光有無及發(fā)光強(qiáng)弱）來探測膜上印跡蛋白抗原的存在與否及含量多少。測膜上印跡蛋白抗原的存在與否及含量多少。Western blot 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 1.1.蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備 2. SDS-PAGE 2. SDS-PAGE 蛋白電泳蛋白電泳 3. 3

5、. 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 4. 4. 封閉封閉 5. 5. 一抗反應(yīng)一抗反應(yīng) 6. 6. 洗膜洗膜 7. 7. 二抗反應(yīng)二抗反應(yīng) 8. 8. 洗膜洗膜 9. 9. 底物顯色或發(fā)光底物顯色或發(fā)光 10. 10. 終止反應(yīng)終止反應(yīng), ,并照片記錄結(jié)果并照片記錄結(jié)果標(biāo)記二抗的酶標(biāo)記二抗的酶1.辣根過氧化合酶（辣根過氧化合酶（HRPHRP），），來源于來源于植物植物，用于用于動物性樣品動物性樣品的檢測（目的是消除的檢測（目的是消除樣樣品中內(nèi)源性酶的干擾品中內(nèi)源性酶的干擾，降低背景）。，降低背景）。2.2.堿性磷酸酶堿性磷酸酶，來源于，來源于動物牛小腸（目前動物牛小腸（目前也有細(xì)菌表達(dá)的產(chǎn)物），也有細(xì)菌表達(dá)的產(chǎn)物）

6、，用于用于植物性樣植物性樣品品的檢測，（目的是消除樣品中內(nèi)源性的檢測，（目的是消除樣品中內(nèi)源性酶的干擾，降低背景）。酶的干擾，降低背景）。 試驗(yàn)材料介紹：試驗(yàn)材料介紹：酶酶底物底物生成的顏色生成的顏色靈敏度靈敏度生色生色辣根過氧化合酶辣根過氧化合酶（HRPHRP）4-4-氯氯-1-1-萘酚萘酚/H2O2/H2O2不溶性紫色不溶性紫色1ng1ng二氨基聯(lián)苯胺二氨基聯(lián)苯胺(DAB)/H2O2(DAB)/H2O2不溶性棕褐色不溶性棕褐色250pg250pg3,35,5-3,35,5-四甲基聯(lián)苯四甲基聯(lián)苯胺胺(TMB)(TMB)不溶性青藍(lán)色不溶性青藍(lán)色100 pg100 pg堿性磷酸酯酶（堿性磷酸酯酶

7、（APAP）氮藍(lán)四唑氮藍(lán)四唑/5-/5-溴溴-4-4-氯吲哚氯吲哚磷酸磷酸(NBT/BCIP)(NBT/BCIP)不溶性黑紫色不溶性黑紫色沉淀沉淀 100 pg100 pg化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光辣根過氧化合酶辣根過氧化合酶ECLECL（過氧化物（過氧化物+ +魯米諾）魯米諾） 發(fā)藍(lán)色光發(fā)藍(lán)色光10 pg10 pg堿性磷酸酶堿性磷酸酶AMPPDAMPPD發(fā)光發(fā)光1 pg1 pgWestern blot 的酶及其底物的酶及其底物用于免疫印跡的膜及其預(yù)處理用于免疫印跡的膜及其預(yù)處理 硝酸纖維素膜（硝酸纖維素膜（NC NC 膜）的預(yù)處理：膜）的預(yù)處理：轉(zhuǎn)移緩沖液轉(zhuǎn)移緩沖液濕潤膜；濕潤膜；硝酸纖維素膜硝酸纖維

8、素膜：硝酸纖維素膜是蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的：硝酸纖維素膜是蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物。在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)固相支持物。在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，下，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會與硝酸纖維素膜發(fā)生帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會與硝酸纖維素膜發(fā)生疏水作用而高親和力地結(jié)合在一起疏水作用而高親和力地結(jié)合在一起。從膜的質(zhì)地上來看，從膜的質(zhì)地上來看，最重要的指標(biāo)就是單位面積最重要的指標(biāo)就是單位面積上能夠結(jié)合的蛋白的量上能夠結(jié)合的蛋白的量。硝酸纖維素膜的結(jié)合。硝酸纖維素膜的結(jié)合能力主要與膜的硝酸纖維素的純度有關(guān)，最大能力主要與膜的硝酸纖維素的純度有關(guān)，最大的蛋白結(jié)合量可達(dá)的蛋白結(jié)合量可達(dá)80-150g/cm80-150g/c

9、m2 2。硝酸纖維素膜很脆，易破。硝酸纖維素膜很脆，易破。 根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，要選擇不同孔根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，要選擇不同孔徑的硝酸纖維素膜徑的硝酸纖維素膜。因?yàn)殡S著膜孔徑的不斷減因?yàn)殡S著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固小，膜對低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。但是。但是膜孔徑如果小于膜孔徑如果小于0.1m0.1m，蛋白的轉(zhuǎn)移就很難進(jìn)，蛋白的轉(zhuǎn)移就很難進(jìn)行了。因此，通常用行了。因此，通常用0.45m0.45m和和0.2m0.2m兩種規(guī)兩種規(guī)格的硝酸纖維素膜。大于格的硝酸纖維素膜。大于20kD20kD的蛋白就可以用的蛋白就可以用0.45m0.45m的膜，小于的膜，小于2

10、0kD20kD的蛋白就要用的蛋白就要用0.2m0.2m的膜了，如果用的膜了，如果用0.45m0.45m的膜就會發(fā)生轉(zhuǎn)移到的膜就會發(fā)生轉(zhuǎn)移到膜反面或穿過膜的現(xiàn)象膜反面或穿過膜的現(xiàn)象。 PVDFPVDF膜（膜（ 聚偏二氟乙烯，聚偏二氟乙烯，polyvinylidene polyvinylidene fluoride)fluoride)的預(yù)處理的預(yù)處理 ： 在甲醇浸泡在甲醇浸泡1010秒濕潤膜，轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡秒濕潤膜，轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡10101515分鐘，除去甲醇。分鐘，除去甲醇。PVDFPVDF是是疏水性的，在轉(zhuǎn)膜緩沖疏水性的，在轉(zhuǎn)膜緩沖液里很難浸透，甲醇處理后使更容易浸潤，且甲液里很難浸透，甲醇處

11、理后使更容易浸潤，且甲醇處理活化醇處理活化PVDFPVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合； PVDFPVDF膜是一種高強(qiáng)度、耐腐蝕的物質(zhì)，膜是一種高強(qiáng)度、耐腐蝕的物質(zhì)，PVDFPVDF膜膜可以結(jié)合蛋白質(zhì)，而且可以可以結(jié)合蛋白質(zhì)，而且可以結(jié)合小片段的蛋白質(zhì)結(jié)合小片段的蛋白質(zhì)，最初是將它用于最初是將它用于蛋白質(zhì)的序列測定蛋白質(zhì)的序列測定，雖然，雖然PDVFPDVF膜膜結(jié)合蛋白的效率沒有硝酸纖維素膜高，但由于它結(jié)合蛋白的效率沒有硝酸纖維素膜高，但由于它的穩(wěn)定、耐腐蝕使它成為蛋白測序理想的用品；的穩(wěn)定、耐腐蝕使它成為蛋白測序理想的用品；

12、 帶正電的尼龍膜帶正電的尼龍膜( (目前已不用目前已不用) )； 蛋白結(jié)合于膜的作用力為非共價(jià)鍵的蛋白結(jié)合于膜的作用力為非共價(jià)鍵的疏水力、疏水力、靜電力靜電力 硝酸纖維素膜是通過疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合，硝酸纖維素膜是通過疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合，而而PVDFPVDF膜主要通過它膜上的正電荷和負(fù)電荷的膜主要通過它膜上的正電荷和負(fù)電荷的蛋白結(jié)合，同時(shí)也有疏水作用，因而，蛋白結(jié)合，同時(shí)也有疏水作用，因而，PVDFPVDF膜膜和蛋白接合較牢，不易脫落。和蛋白接合較牢，不易脫落。 SDS-PAGE中中SDS（十二烷基硫酸鈉）的作用（十二烷基硫酸鈉）的作用 強(qiáng)陰離子去污劑使蛋白質(zhì)強(qiáng)陰離子去污劑使蛋白質(zhì)變性、亞基

13、解離變性、亞基解離：SDSSDS打打開蛋白質(zhì)中半胱氨酸殘基之間的開蛋白質(zhì)中半胱氨酸殘基之間的二硫鍵二硫鍵, , 破壞蛋白破壞蛋白質(zhì)的質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu), , 它可以斷開它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵分子內(nèi)和分子間的氫鍵, ,破壞蛋白質(zhì)分子的破壞蛋白質(zhì)分子的二級及三級結(jié)構(gòu)二級及三級結(jié)構(gòu)； 帶帶負(fù)電荷的負(fù)電荷的SDSSDS覆蓋于蛋白質(zhì)表面，把蛋白質(zhì)本身覆蓋于蛋白質(zhì)表面，把蛋白質(zhì)本身的電荷封閉，并使蛋白質(zhì)表面帶負(fù)電荷，從而使蛋的電荷封閉，并使蛋白質(zhì)表面帶負(fù)電荷，從而使蛋白質(zhì)在電泳時(shí)向白質(zhì)在電泳時(shí)向正極移動正極移動； SDSSDS與多肽結(jié)合的量與多肽的分子量成正比而與其與多肽結(jié)合的量與多肽的分子量成

14、正比而與其序列無關(guān)序列無關(guān)（平均每兩個(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)（平均每兩個(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)SDSSDS分分子），因此子），因此SDS-SDS-多肽復(fù)合物在聚丙烯酰胺凝膠電泳多肽復(fù)合物在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽中的遷移率只與多肽分子量分子量大小相關(guān)。大小相關(guān)。聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGESDS-PAGE）原理）原理 蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳（蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGESDS-PAGE）是蛋白質(zhì)）是蛋白質(zhì)分析過程中最常用的技術(shù)。分析過程中最常用的技術(shù)。 蛋白質(zhì)在電泳分離時(shí)，其蛋白質(zhì)在電泳分離時(shí)，其遷移率遷移率主要取決于主要取決于蛋白質(zhì)本蛋白質(zhì)

15、本身所帶的電荷多少、分子量大小和形態(tài)身所帶的電荷多少、分子量大小和形態(tài)。但如在。但如在PAGEPAGE中加入陰離子去污劑中加入陰離子去污劑SDS, SDSSDS, SDS將蛋白質(zhì)的二硫鍵、氫將蛋白質(zhì)的二硫鍵、氫鍵及疏水鍵打開，使蛋白質(zhì)變性，鍵及疏水鍵打開，使蛋白質(zhì)變性， SDSSDS將包裹在變性將包裹在變性蛋白表面，使蛋白質(zhì)成為剛性分子，同時(shí)，由于蛋白表面，使蛋白質(zhì)成為剛性分子，同時(shí)，由于SDSSDS帶帶有大量負(fù)電荷，使蛋白質(zhì)本身帶有的電荷可忽略。這有大量負(fù)電荷，使蛋白質(zhì)本身帶有的電荷可忽略。這樣，不同蛋白質(zhì)分子的遷移率主要決定于蛋白帶有的樣，不同蛋白質(zhì)分子的遷移率主要決定于蛋白帶有的SDSS

16、DS量，而量，而SDSSDS與蛋白結(jié)合的量與蛋白的分子量成正比與蛋白結(jié)合的量與蛋白的分子量成正比，即遷移率決定于蛋白質(zhì)分子量大小。因此利用即遷移率決定于蛋白質(zhì)分子量大小。因此利用SDS-SDS-PAGEPAGE可測定蛋白質(zhì)的分子量?？蓽y定蛋白質(zhì)的分子量。SDS-PAGE 蛋白電泳試劑蛋白電泳試劑1 1. . 丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺單體溶液（丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺單體溶液（AcrAcr和和Bis)Bis)：丙烯酰胺丙烯酰胺30g 30g ，甲叉雙丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺0.8g0.8g，加水，加水100ml 100ml ，濾，濾紙過濾后儲存于棕色瓶中，紙過濾后儲存于棕色瓶中，44避光保存，避

17、光保存，pHpH不得超過不得超過7.07.0。（。（光催化或堿催化其發(fā)生脫氨基反應(yīng)光催化或堿催化其發(fā)生脫氨基反應(yīng)） 2. 2. 4x4x分離膠緩沖液分離膠緩沖液 ：Tris 18.17g, 10% SDS 4ml, Tris 18.17g, 10% SDS 4ml, HClHCl調(diào)調(diào)pHpH至至8.8, 8.8, 定容到定容到100ml100ml。 3. 3. 4 4濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液：稱趣：稱趣Tris 6.06gTris 6.06g，加入，加入1010SDS SDS 4ml4ml，用，用12mol/l HCL12mol/l HCL調(diào)至調(diào)至pHpH至至6.86.8，定容至，定容至100

18、ml100ml。 4. 4. 10%10%過硫酸胺過硫酸胺： 稱取過硫酸胺稱取過硫酸胺0.5g, 0.5g, 加水至加水至5ml5ml。提供兩種丙稀酰胺聚合所必。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。本存儲液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。須的自由基。本存儲液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。 TEMED TEMED （N N，N N，NNNN四甲基乙二胺）四甲基乙二胺）原溶液，原溶液， TEMEDTEMED催化過硫酸銨形成自由催化過硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合?；铀賰煞N丙稀酰胺的聚合。 5. 5. 1010電極緩沖液電極緩沖液：稱?。悍Q取Tris 30gTris 30g、甘、甘氨酸氨酸144g144g，加入，加入101

19、0SDS 100mlSDS 100ml，定容至，定容至1000ml, pH8.81000ml, pH8.8 6. 6. 2X2X樣品緩沖液樣品緩沖液: :甘油甘油2ml2ml（或稱取蔗糖（或稱取蔗糖2g 2g ），加），加入入1010SDS 2mlSDS 2ml，溴酚藍(lán)，溴酚藍(lán)0.25mg0.25mg，濃縮膠緩沖液，濃縮膠緩沖液2.5ml2.5ml、 巰基乙醇巰基乙醇0.5ml0.5ml，加水定容至，加水定容至10ml10ml。 （加入溴酚藍(lán)染料加入溴酚藍(lán)染料, , 溴酚藍(lán)指示劑是一個(gè)較小的分子溴酚藍(lán)指示劑是一個(gè)較小的分子, ,可以自由通過凝膠孔徑可以自由通過凝膠孔徑, , 所以它顯示著電泳的

20、前沿位所以它顯示著電泳的前沿位置置, ,當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí)當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí), , 即可停止電泳即可停止電泳） 5X5X樣品緩沖液樣品緩沖液：0.312mol/L Tris-HCl, pH6.8 , 0.312mol/L Tris-HCl, pH6.8 , 10%SDS, 25% 10%SDS, 25% 巰基乙醇巰基乙醇,0.05%,0.05%溴酚藍(lán)。溴酚藍(lán)。 加入樣品加入樣品后再添加后再添加1010甘油甘油 5X5X樣品緩沖液樣品緩沖液： 0.225mol/L Tris-HCl, pH6.8 0.225mol/L Tris-HCl, pH6.8 ；50%50%甘油；甘油；5 5 SD

21、S SDS ；0.050.05溴酚藍(lán)；溴酚藍(lán)；0.25M DTT0.25M DTT 7.7.染色液：染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)稱取考馬斯亮藍(lán)R-250 2.5gR-250 2.5g，加入，加入甲醇甲醇450ml450ml，冰乙酸，冰乙酸100ml100ml、水、水650ml650ml。 8.8.脫色液脫色液 ：甲醇：甲醇100ml100ml，冰乙酸，冰乙酸700ml700ml，加水，加水830ml830ml。 9.9.十二烷基硫酸鈉（十二烷基硫酸鈉（SDSSDS）溶液）溶液:10%(w/v) 1g :10%(w/v) 1g SDSSDS，10ml10ml去離子水配制，室溫保存。去離子水配制，室溫保

22、存。 SDS-PAGESDS-PAGE電泳采用電泳采用Tris-Tris-甘氨酸系統(tǒng)甘氨酸系統(tǒng)，即按分子克隆，即按分子克隆中中SambrookSambrook等的方法（等的方法（Sambrook, 1989Sambrook, 1989）進(jìn)行）進(jìn)行成份成份 凝膠濃度凝膠濃度 8.51012.51517.5H2O（mL）3.25/5.253.1/4.652.5/3.751.8/2.71.2/1.830Acr: Bis（mL）2.0/3.02.4/3.63.0/4.53.7/5.554.3/6.454 分 離 膠 緩 沖 液分 離 膠 緩 沖 液（mL）1.9/3.611.9/3.611.9/3.6

23、11.9/3.611.9/3.6110% 過硫酸氨（過硫酸氨（ L）112/168112/168112/168112/168112/168TEMED（ L）5.0/7.55.0/7.55.0/7.55.0/7.55.0/7.5分離范圍（分離范圍（kDa） 36-150 20-120 15-100 12-50 10-40制膠制膠表表1 不同濃度變性聚丙烯酰氨凝膠（分離膠）的配方不同濃度變性聚丙烯酰氨凝膠（分離膠）的配方 濃縮膠制備的方法濃縮膠制備的方法：將丙烯酰胺和甲：將丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺單體儲備液叉雙丙烯酰胺單體儲備液0.6ml0.6ml，濃，濃縮膠緩沖液縮膠緩沖液888888 m m、

24、水、水2ml2ml、1010過過硫酸胺硫酸胺 5656l l、TEMED 10TEMED 10l l混合均勻混合均勻后，立即灌膠。后，立即灌膠。 SDS-PAGE 步驟步驟 1. 1. 制膠制膠：根據(jù)所需要分離的蛋白質(zhì)分子量選擇分離：根據(jù)所需要分離的蛋白質(zhì)分子量選擇分離膠的濃度，制備不同濃度的凝膠所需要的儲備液可參考膠的濃度，制備不同濃度的凝膠所需要的儲備液可參考上表上表. .按比例按比例配制分離膠配制分離膠，輕緩地?fù)u動溶液，輕緩地?fù)u動溶液, ,使混合均勻，將使混合均勻，將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中，再在液面上小心注凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中，再在液面上小心注入一層水，以阻止氧氣進(jìn)入凝

25、膠溶液中入一層水，以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液中( (因液體中含有因液體中含有分子氧可抑制凝膠的聚合，故用時(shí)可在真空中抽氣以排分子氧可抑制凝膠的聚合，故用時(shí)可在真空中抽氣以排除液體中的分子氧，灌完分離膠后加水以封閉分離膠與除液體中的分子氧，灌完分離膠后加水以封閉分離膠與外界氧氣的結(jié)合外界氧氣的結(jié)合) ) ，然后靜置，然后靜置40-60min40-60min同前按比例同前按比例配制濃縮膠配制濃縮膠，但搖動溶液時(shí)不要過于劇烈以，但搖動溶液時(shí)不要過于劇烈以免引入過多地氧氣。吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的免引入過多地氧氣。吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的水分，以連續(xù)平穩(wěn)的液流注入凝膠溶液，然后小心插入水分，以

26、連續(xù)平穩(wěn)的液流注入凝膠溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡，靜止梳子并注意不得在齒尖留有氣泡，靜止20min20min以上以保以上以保證完全聚合。證完全聚合。 預(yù)電泳預(yù)電泳: :將聚合好的凝膠安置于電泳將聚合好的凝膠安置于電泳槽中，小心拔去梳子，加入上下槽槽中，小心拔去梳子，加入上下槽電泳緩沖液后低電壓短時(shí)間的預(yù)電電泳緩沖液后低電壓短時(shí)間的預(yù)電泳，清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì)，疏通凝膠泳，清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì)，疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通?？讖揭员ＷC電泳過程中電泳的暢通。現(xiàn)在一般不進(jìn)行預(yù)電泳現(xiàn)在一般不進(jìn)行預(yù)電泳) ) 2.2. 樣品制備樣品制備 蛋白質(zhì)的樣品制備是蛋白質(zhì)的樣品制備是West

27、ern BlotWestern Blot的關(guān)鍵步驟，的關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，防止蛋白質(zhì)降要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，防止蛋白質(zhì)降解，樣品處理過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，并在提取解，樣品處理過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，并在提取緩沖液中加入合適的蛋白酶抑制劑（蛋白酶抑緩沖液中加入合適的蛋白酶抑制劑（蛋白酶抑制劑制劑cocktailcocktail、 PMSFPMSF），以避免細(xì)胞破碎釋，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的降解作用。放出的各種酶類的降解作用。 苯甲基黃酰氟苯甲基黃酰氟 （PMSFPMSF）蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑：在溶在溶液中不穩(wěn)定，應(yīng)在臨用前從儲存液中現(xiàn)加于裂液中不穩(wěn)定，應(yīng)在臨用前從

28、儲存液中現(xiàn)加于裂解液中。一旦眼睛或皮膚接觸了解液中。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSFPMSF，應(yīng)立即，應(yīng)立即用大量的水沖洗。用大量的水沖洗。PMSFPMSF通常配成通常配成10mmol/L10mmol/L濃度濃度儲液，保存于儲液，保存于-20-20度度 蛋白質(zhì)樣品在上樣電泳前均需變性。蛋白質(zhì)樣品在上樣電泳前均需變性。 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)markermarker在上樣電泳前不用變性。在上樣電泳前不用變性。 通常是將樣品蛋白質(zhì)溶液與等體積的通常是將樣品蛋白質(zhì)溶液與等體積的2x2x上樣緩沖液混合上樣緩沖液混合后置于后置于eppendorfeppendorf管中，將混合物置于管中，將混合物置

29、于100 100 加熱加熱3-103-10分鐘，立即置于冰上，但分鐘，立即置于冰上，但有些樣品如植物、細(xì)菌有些樣品如植物、細(xì)菌需要離需要離心處理后取上清電泳。蛋白質(zhì)樣品應(yīng)溶于低離子強(qiáng)度的心處理后取上清電泳。蛋白質(zhì)樣品應(yīng)溶于低離子強(qiáng)度的緩沖液中。蛋白質(zhì)的終濃度最好為緩沖液中。蛋白質(zhì)的終濃度最好為1mg/ml1mg/ml，每個(gè)泳道的，每個(gè)泳道的上樣量取決于所使用染色方法的靈敏程度?？捡R斯亮藍(lán)上樣量取決于所使用染色方法的靈敏程度?？捡R斯亮藍(lán)染色一般有染色一般有10102020g g樣品也已經(jīng)足夠了樣品也已經(jīng)足夠了 考馬斯亮藍(lán)染色的靈敏度為考馬斯亮藍(lán)染色的靈敏度為0.30.31ug1ug，但銀染更靈敏

30、，但銀染更靈敏 蛋白樣品的提取方法：蛋白樣品的提取方法：100100毫克的組織（動植物、毫克的組織（動植物、細(xì)菌等微生物）液氮磨碎，加細(xì)菌等微生物）液氮磨碎，加100100微升的微升的2X2X蛋蛋白質(zhì)上樣緩沖液混勻，白質(zhì)上樣緩沖液混勻，100100煮沸煮沸1010分鐘，分鐘，5000rpm5000rpm離心離心5 5分鐘，取上清進(jìn)行蛋白電泳分鐘，取上清進(jìn)行蛋白電泳。 當(dāng)提取的樣品中蛋白的含量太低時(shí)，可加當(dāng)提取的樣品中蛋白的含量太低時(shí)，可加2-32-3倍倍體積的丙酮沉淀，體積的丙酮沉淀，10000rpm10000rpm離心，去上清，沉離心，去上清，沉淀加淀加2X2X蛋白質(zhì)上樣緩沖液，蛋白質(zhì)上樣緩

31、沖液， 100100煮沸煮沸5 5分鐘分鐘后進(jìn)行蛋白電泳。后進(jìn)行蛋白電泳。3.3.上樣及電泳上樣及電泳 樣品制備好以后，即可上樣電泳。先將樣品梳子移去，樣品制備好以后，即可上樣電泳。先將樣品梳子移去，用雙蒸水淋洗每個(gè)樣品孔，然后在樣品孔中加滿電泳用雙蒸水淋洗每個(gè)樣品孔，然后在樣品孔中加滿電泳緩沖液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加樣（緩沖液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加樣（注意加樣時(shí)間要盡量短，注意加樣時(shí)間要盡量短，以免樣品擴(kuò)散，為避免邊際效應(yīng)，可在未加樣的孔中以免樣品擴(kuò)散，為避免邊際效應(yīng)，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液加入等量的樣品緩沖液）。加樣完畢后馬上蓋好電泳）。加樣完畢后馬上蓋好電泳槽的蓋子并選擇適當(dāng)?shù)碾妷哼M(jìn)行

32、電泳，通常在不連續(xù)槽的蓋子并選擇適當(dāng)?shù)碾妷哼M(jìn)行電泳，通常在不連續(xù)系統(tǒng)中，系統(tǒng)中，上層濃縮膠的電泳電壓要低于分離膠的電泳上層濃縮膠的電泳電壓要低于分離膠的電泳電壓，使樣品更好的進(jìn)入凝膠電壓，使樣品更好的進(jìn)入凝膠，電泳時(shí)，一般采用恒電泳時(shí)，一般采用恒壓的方式壓的方式，這樣蛋白質(zhì)才可以保證恒定的電泳遷移率。，這樣蛋白質(zhì)才可以保證恒定的電泳遷移率。一般采用恒壓濃縮膠一般采用恒壓濃縮膠70-80V70-80V，分離膠分離膠90-100V90-100V，電泳，電泳直至溴酚染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳。電直至溴酚染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳。電泳時(shí)間需泳時(shí)間需2-32-3小時(shí)。小時(shí)。 4. 4.

33、 凝膠的染色和脫色凝膠的染色和脫色 電泳完畢后，倒去電泳緩沖液，取出夾心槽。電泳完畢后，倒去電泳緩沖液，取出夾心槽。小心的取出凝膠，置于小心的取出凝膠，置于考馬斯亮藍(lán)染色液考馬斯亮藍(lán)染色液中中, ,以浸沒凝膠為宜以浸沒凝膠為宜, ,在水平搖床上搖動在水平搖床上搖動, ,直到凝膠直到凝膠上上出現(xiàn)明顯的條帶出現(xiàn)明顯的條帶為止為止, ,一般需一般需3-63-6小時(shí)或者小時(shí)或者44過夜過夜; ;然后傾去染色液，用脫色液搖動脫色然后傾去染色液，用脫色液搖動脫色, ,其間要不斷更換脫色液其間要不斷更換脫色液, ,脫色至脫色至藍(lán)色背景消失藍(lán)色背景消失為止為止。此凝膠即可用于分析。在。此凝膠即可用于分析。在W

34、estern blotWestern blot時(shí)電泳完畢后不染色直接進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜。時(shí)電泳完畢后不染色直接進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜。 SDS-PAGE注意事項(xiàng)及常遇到的問題注意事項(xiàng)及常遇到的問題1.1.分離膠不要倒得太滿，需要有一定的濃縮膠空間分離膠不要倒得太滿，需要有一定的濃縮膠空間（1.5cm1.5cm高），否則起不到濃縮效果。高），否則起不到濃縮效果。2.2.混合速度太快產(chǎn)生氣泡影響聚合，導(dǎo)致電泳帶畸形。混合速度太快產(chǎn)生氣泡影響聚合，導(dǎo)致電泳帶畸形。3.3.凝膠總是凝膠總是“縮縮”是膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時(shí)拿是膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時(shí)拿保鮮膜包起來，在里面加點(diǎn)水保持濕度；也可能母保鮮膜包起來，在里

35、面加點(diǎn)水保持濕度；也可能母液（液（30%30%聚丙烯酰胺）有問題，重新配制。聚丙烯酰胺）有問題，重新配制。 4.4.電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象：電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象： 條帶呈笑臉狀條帶呈笑臉狀，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好，可降低電壓。卻不好，可降低電壓。 條帶呈皺眉狀條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。完全。拖尾拖尾：樣品溶解性不好。：樣品溶解性不好。紋理紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。

36、條帶偏斜條帶偏斜：電極不平衡。：電極不平衡。條帶兩邊擴(kuò)散條帶兩邊擴(kuò)散：加樣量過多或鹽離子濃度過高。：加樣量過多或鹽離子濃度過高。 5. .未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性, , 操作時(shí)應(yīng)戴手套操作時(shí)應(yīng)戴手套6.6.梳子插入濃縮膠時(shí)梳子插入濃縮膠時(shí), , 應(yīng)確保沒有氣泡應(yīng)確保沒有氣泡, , 梳子拔出來時(shí)梳子拔出來時(shí)應(yīng)該小心應(yīng)該小心, ,不要破壞加樣孔不要破壞加樣孔, ,如有加樣孔上的凝膠歪斜如有加樣孔上的凝膠歪斜可用針頭插入加樣孔中糾正，但要避免針頭刺入膠內(nèi)可用針頭插入加樣孔中糾正，但要避免針頭刺入膠內(nèi) 7.7.上樣品緩沖液中煮沸的樣品可在上樣品緩沖液中煮沸的樣品可在-2

37、0-20存放存放 8.8.為減少蛋白質(zhì)條帶的擴(kuò)散為減少蛋白質(zhì)條帶的擴(kuò)散, ,上樣后應(yīng)盡快電泳上樣后應(yīng)盡快電泳, ,電泳結(jié)電泳結(jié)束后也應(yīng)直接染色或者轉(zhuǎn)印束后也應(yīng)直接染色或者轉(zhuǎn)印 9.9.上樣時(shí)上樣時(shí), ,小心不要使樣品溢出而污染相鄰加樣孔小心不要使樣品溢出而污染相鄰加樣孔 10.10.取出凝膠后應(yīng)注意分清加樣順序取出凝膠后應(yīng)注意分清加樣順序, ,可用刀片切去凝膠可用刀片切去凝膠的一角作為標(biāo)記的一角作為標(biāo)記( (如左上角如左上角) )，轉(zhuǎn)膜時(shí)也應(yīng)用同樣的方，轉(zhuǎn)膜時(shí)也應(yīng)用同樣的方法對法對NCNC膜做上標(biāo)記膜做上標(biāo)記( (如左上角如左上角) )以分清正反面和上下關(guān)以分清正反面和上下關(guān)系系非變性非變性聚

38、丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 分連續(xù)和非連續(xù)的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，分連續(xù)和非連續(xù)的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，非連續(xù)的僅多一層濃縮膠，其他兩者相同。非連續(xù)的僅多一層濃縮膠，其他兩者相同。 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳所用的儀器、試劑非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳所用的儀器、試劑和程序與和程序與SDS-PAGESDS-PAGE系統(tǒng)幾乎相同，只是電極緩系統(tǒng)幾乎相同，只是電極緩沖液中除去沖液中除去SDSSDS, ,上樣緩沖液中除去上樣緩沖液中除去SDSSDS及及巰巰基乙醇、基乙醇、DTTDTT非變性凝膠電泳與變性凝膠電泳最大的區(qū)別就在于蛋白在電泳過非變性凝膠電泳與變性凝膠電泳最大的區(qū)別就在于蛋白在電

39、泳過程中和電泳后都不會變性。程中和電泳后都不會變性。最主要不同：最主要不同：凝膠的配置中非變性凝膠不能加入凝膠的配置中非變性凝膠不能加入SDSSDS；非變性凝膠電泳上樣緩沖液中沒有非變性凝膠電泳上樣緩沖液中沒有SDSSDS和巰基乙醇和巰基乙醇在非變性凝膠中蛋白質(zhì)的分離取決于它所帶的電荷在非變性凝膠中蛋白質(zhì)的分離取決于它所帶的電荷以及分子大小，不像以及分子大小，不像SDS-PAGESDS-PAGE電泳中蛋白質(zhì)分離只電泳中蛋白質(zhì)分離只與其分子量有關(guān)；與其分子量有關(guān)；非變性凝膠電泳中，酸性蛋白和堿性蛋白的分離是非變性凝膠電泳中，酸性蛋白和堿性蛋白的分離是完全不同的，不像完全不同的，不像SDS-PAG

40、ESDS-PAGE中所有蛋白都朝正極泳中所有蛋白都朝正極泳動。非變性凝膠電泳中堿性蛋白通常是在微酸性環(huán)動。非變性凝膠電泳中堿性蛋白通常是在微酸性環(huán)境下進(jìn)行，蛋白帶正電荷，需要將陰極和陽極倒置境下進(jìn)行，蛋白帶正電荷，需要將陰極和陽極倒置才可以電泳；才可以電泳；1.1. 因?yàn)槭欠亲冃阅z電泳，所用的電流不能太大，以因?yàn)槭欠亲冃阅z電泳，所用的電流不能太大，以免電泳時(shí)產(chǎn)生的熱量太多導(dǎo)致蛋白變性，而且電泳免電泳時(shí)產(chǎn)生的熱量太多導(dǎo)致蛋白變性，而且電泳都要在都要在0-40-4的條件下進(jìn)行，這樣才可以保持蛋白質(zhì)的條件下進(jìn)行，這樣才可以保持蛋白質(zhì)的活性，也可以降低蛋白質(zhì)的降解。的活性，也可以降低蛋白質(zhì)的降解。

41、Western blotWestern blot實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 試劑及材料試劑及材料（1 1）硝酸纖維素膜或）硝酸纖維素膜或PVDFPVDF膜。膜。（2 2）APAP酶的底物：酶的底物：NBTNBT和和BCIPBCIP（氮藍(lán)四唑（氮藍(lán)四唑/5-/5-溴溴- -4-4-氯吲哚磷酸）儲備液（濃度均為氯吲哚磷酸）儲備液（濃度均為50mg/ml50mg/ml），），將將NBTNBT溶于溶于7070二甲基甲酰胺中，二甲基甲酰胺中，BCIPBCIP溶于溶于100100二甲基甲酰胺中，已商品化。二甲基甲酰胺中，已商品化。（3 3）第一抗體（簡稱一抗）即針對目標(biāo)蛋白抗原第一抗體（簡稱一抗）即針對目標(biāo)蛋白抗原的抗體的

42、抗體，可根據(jù)研究的目標(biāo)自制，應(yīng)預(yù)先測定其，可根據(jù)研究的目標(biāo)自制，應(yīng)預(yù)先測定其效價(jià)。常用的為效價(jià)。常用的為兔抗體或鼠、兔單抗兔抗體或鼠、兔單抗。（4 4）堿性磷酸酶（或辣根過氧化合酶）標(biāo)記的堿性磷酸酶（或辣根過氧化合酶）標(biāo)記的第二抗體第二抗體（簡稱二抗，即針對一抗的抗體，（簡稱二抗，即針對一抗的抗體，工作濃度工作濃度1 1：50005000），），根據(jù)使用的第一抗體選根據(jù)使用的第一抗體選擇，如第一抗體為兔抗體，則可使用羊抗兔擇，如第一抗體為兔抗體，則可使用羊抗兔IgGIgG抗體，若為鼠源抗體，則可使用羊抗鼠抗體，若為鼠源抗體，則可使用羊抗鼠IgGIgG抗體或兔抗鼠抗體或兔抗鼠IgGIgG抗體。抗

43、體。也可選用其他動也可選用其他動物如驢抗兔或抗鼠物如驢抗兔或抗鼠IgGIgG的抗體。的抗體。（5 5）western blotwestern blot轉(zhuǎn)移緩沖液：轉(zhuǎn)移緩沖液：TrisCl TrisCl 48mmol/l,48mmol/l,甲醇甲醇2020，甘氨酸，甘氨酸 39mmol/l,SDS 39mmol/l,SDS 0.037%,pH8.30.037%,pH8.3。（6 6）TBSTBS緩沖液緩沖液：TrisCl 20mmol/l,NaCl 150mmol/lTrisCl 20mmol/l,NaCl 150mmol/l，pH7.5pH7.5。 (7)(7)TBSTTBST緩沖液緩沖液：T

44、BSTBS緩沖液加緩沖液加0.05% 0.05% 吐溫吐溫-20-20（v/vv/v）。）。（8 8）封閉緩沖液封閉緩沖液：TBSTBS緩沖液加緩沖液加1 1BSABSA?；??；?5 5 脫脂脫脂奶粉奶粉 (9)(9) NBT NBT和和BCIPBCIP底物顯色緩沖液底物顯色緩沖液：TrisCl TrisCl 100mmol/l,NaCl 100mmol/l100mmol/l,NaCl 100mmol/l，MgClMgCl2 2 5mmol/l5mmol/l，pH9.5pH9.5。（1010）麗春紅染液儲存液麗春紅染液儲存液：麗春紅：麗春紅S 2g ,S 2g ,三氯乙酸三氯乙酸30g ,30

45、g ,磺基水楊酸磺基水楊酸 30g 30g 加水至加水至100ml 100ml ，用時(shí)上述儲存液稀，用時(shí)上述儲存液稀釋釋1010倍即成麗春紅倍即成麗春紅S S使用液，脫色液用使用液，脫色液用TBSTBS或或PBSPBS （1111）HRPHRP酶的酶的底物顯色液底物顯色液：- -氯氯-1-1-萘酚溶萘酚溶液液：1ml 4 -1ml 4 -氯氯-1-1-萘酚溶液（溶于甲醇，濃度萘酚溶液（溶于甲醇，濃度30mg/ml30mg/ml）, , 加加10ml 10ml 甲醇，加甲醇，加TBS TBS 至至50ml;50ml;加加30l H30l H2 2O O（臨用前配制）；（臨用前配制）； 3,3-3

46、,3-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽（二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽（DABDAB）溶液溶液:DAB 20mg,TBS 2.5ml, H2O 50ml, 3% H:DAB 20mg,TBS 2.5ml, H2O 50ml, 3% H2 2O O 18l 18l 混合而成（混合而成（臨用前現(xiàn)配臨用前現(xiàn)配) ) TBSTBS緩沖液可用緩沖液可用PBSPBS緩沖液替代緩沖液替代Western blot實(shí)驗(yàn)步驟1.SDS-PAGE電泳2.電轉(zhuǎn)移 蛋白質(zhì)從凝膠原位轉(zhuǎn)印至膜有兩種方法：蛋白質(zhì)從凝膠原位轉(zhuǎn)印至膜有兩種方法： 半干法和濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移是兩種不同的轉(zhuǎn)移裝置下半干法和濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移是兩種不同的轉(zhuǎn)移裝置下的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，將膜、膠、濾紙整

47、個(gè)組合完全浸的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，將膜、膠、濾紙整個(gè)組合完全浸入有鉑絲電極的轉(zhuǎn)移緩沖液中的蛋白原位電轉(zhuǎn)入有鉑絲電極的轉(zhuǎn)移緩沖液中的蛋白原位電轉(zhuǎn)移體系，叫移體系，叫濕轉(zhuǎn)法，也叫濕轉(zhuǎn)法，也叫濕轉(zhuǎn)印法、槽式轉(zhuǎn)移濕轉(zhuǎn)印法、槽式轉(zhuǎn)移印跡法印跡法； 將因吸收轉(zhuǎn)移將因吸收轉(zhuǎn)移bufferbuffer而濕潤的凝膠而濕潤的凝膠- -膜放在吸膜放在吸有轉(zhuǎn)移有轉(zhuǎn)移bufferbuffer的吸水濾紙之間，即濾紙的吸水濾紙之間，即濾紙- -凝膠凝膠- -膜膜- -濾紙夾層組合置于濾紙夾層組合置于2 2個(gè)平板電極之間，進(jìn)行個(gè)平板電極之間，進(jìn)行蛋白原位電轉(zhuǎn)移的體系叫蛋白原位電轉(zhuǎn)移的體系叫半干轉(zhuǎn)印法半干轉(zhuǎn)印法。這兩種轉(zhuǎn)印的裝置均有商品

48、化，效果均很這兩種轉(zhuǎn)印的裝置均有商品化，效果均很好，但不同的實(shí)驗(yàn)室偏愛其中一種。好，但不同的實(shí)驗(yàn)室偏愛其中一種。法半干式轉(zhuǎn)移系統(tǒng)由于兩個(gè)電極之間的距法半干式轉(zhuǎn)移系統(tǒng)由于兩個(gè)電極之間的距離十分靠近，所形成的高電場，加快了離十分靠近，所形成的高電場，加快了轉(zhuǎn)移的速度，對緩沖液的需要量少，缺轉(zhuǎn)移的速度，對緩沖液的需要量少，缺點(diǎn)是難以冷卻點(diǎn)是難以冷卻。槽式轉(zhuǎn)移印跡系統(tǒng)比較適用于槽式轉(zhuǎn)移印跡系統(tǒng)比較適用于100kD100kD的大的大蛋白或疏水蛋白等的較長時(shí)間的轉(zhuǎn)移，蛋白或疏水蛋白等的較長時(shí)間的轉(zhuǎn)移，缺點(diǎn)是緩沖液用量大，轉(zhuǎn)印時(shí)間長。缺點(diǎn)是緩沖液用量大，轉(zhuǎn)印時(shí)間長。 濕轉(zhuǎn)法：濕轉(zhuǎn)法：1.1.電泳結(jié)束后，取下

49、凝膠，切除濃縮膠，用蒸餾水稍作電泳結(jié)束后，取下凝膠，切除濃縮膠，用蒸餾水稍作淋洗凝膠后置于轉(zhuǎn)移緩沖液中泡淋洗凝膠后置于轉(zhuǎn)移緩沖液中泡1010分鐘。分鐘。2.2.取與凝膠相同大小的取與凝膠相同大小的NCNC膜或膜或PVDFPVDF膜和膜和2 2張張WhatmanWhatman濾紙，濾紙，置于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸濕置于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸濕5 5分鐘；分鐘；3.3.打開電轉(zhuǎn)印夾，每側(cè)墊上一塊專用的用轉(zhuǎn)印液浸泡透打開電轉(zhuǎn)印夾，每側(cè)墊上一塊專用的用轉(zhuǎn)印液浸泡透的海面墊，再各放一塊轉(zhuǎn)印液浸透的濾紙，將凝膠平的海面墊，再各放一塊轉(zhuǎn)印液浸透的濾紙，將凝膠平放在陰極側(cè)濾紙上，最后將放在陰極側(cè)濾紙上，最后將NCNC膜平放在

50、凝膠上，用玻膜平放在凝膠上，用玻棒滾動除去氣泡，再依次放一轉(zhuǎn)印液浸透的濾紙、海棒滾動除去氣泡，再依次放一轉(zhuǎn)印液浸透的濾紙、海面墊，夾好電轉(zhuǎn)印夾。面墊，夾好電轉(zhuǎn)印夾。 4. 4. 電泳槽加滿電轉(zhuǎn)印液，插入電轉(zhuǎn)印夾，將電泳槽放電泳槽加滿電轉(zhuǎn)印液，插入電轉(zhuǎn)印夾，將電泳槽放入冰中（電轉(zhuǎn)印液之前要放入冰箱內(nèi)預(yù)冷），連接好入冰中（電轉(zhuǎn)印液之前要放入冰箱內(nèi)預(yù)冷），連接好電極，接通電流，轉(zhuǎn)印夾的電極，接通電流，轉(zhuǎn)印夾的NCNC膜應(yīng)對電泳槽的正極，膜應(yīng)對電泳槽的正極，凝膠接負(fù)極，電流強(qiáng)度為凝膠接負(fù)極，電流強(qiáng)度為0.65 mA/cm0.65 mA/cm2 2 濾膜，電泳濾膜，電泳45min-1.5 h45min-

51、1.5 h。濕轉(zhuǎn)移示意圖濕轉(zhuǎn)移示意圖 凝膠硝酸纖維膜濾紙海綿(+)(-) 半干式電轉(zhuǎn)移半干式電轉(zhuǎn)移1.1.電泳后取出凝膠，取凝膠方法：用刀片將兩玻璃板分電泳后取出凝膠，取凝膠方法：用刀片將兩玻璃板分開，將多余的凝膠劃去，上部以濃縮膠為準(zhǔn)全部割棄，開，將多余的凝膠劃去，上部以濃縮膠為準(zhǔn)全部割棄，取一取一10ml10ml注射器吸滿轉(zhuǎn)印緩沖液，插入玻璃板與凝膠注射器吸滿轉(zhuǎn)印緩沖液，插入玻璃板與凝膠之間注水，使水的壓力將兩者自然分開之間注水，使水的壓力將兩者自然分開, ,邊推邊進(jìn)邊推邊進(jìn), ,反反復(fù)多次注水復(fù)多次注水, ,直至凝膠從玻璃板上滑落下來直至凝膠從玻璃板上滑落下來, ,放入轉(zhuǎn)移放入轉(zhuǎn)移緩沖液

52、中濕潤緩沖液中濕潤10-20min 10-20min 。 2. 2. 將將NCNC膜和濾紙切出與凝膠一樣大小，置轉(zhuǎn)移緩沖液膜和濾紙切出與凝膠一樣大小，置轉(zhuǎn)移緩沖液中濕潤中濕潤5-10min.5-10min. 3. 3. 按照下圖順序放置濾紙，凝膠和按照下圖順序放置濾紙，凝膠和NCNC膜放置到半干盒膜放置到半干盒中。中。 4. 4. 每層之間的氣泡要全部去除。可以用玻璃棒輕輕在每層之間的氣泡要全部去除。可以用玻璃棒輕輕在上面滾動去除氣泡，膠四周平板電極上的緩沖液轉(zhuǎn)印上面滾動去除氣泡，膠四周平板電極上的緩沖液轉(zhuǎn)印擦干，防止電流直接從沒有凝膠處通過造成短路，蓋擦干，防止電流直接從沒有凝膠處通過造成短

53、路，蓋好，通電流，小膠一般好，通電流，小膠一般10V,30min10V,30min或或15V,15min;15V,15min;大膠大膠25V,30min25V,30min或或15V,60min15V,60min。 半干轉(zhuǎn)移儀半干轉(zhuǎn)移儀 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：1 1）濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙）濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙= =膜膜= =膠。膠。2 2）濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會造成）濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會造成短路。短路。3 3）因?yàn)椋┮驗(yàn)镻FDVPFDV膜的疏水性，膜必須首先在甲醇中完全膜的疏水性，膜必須首先在甲醇中完全浸濕。膜必須隨時(shí)保持濕潤。浸濕。膜

54、必須隨時(shí)保持濕潤。4 4）轉(zhuǎn)移時(shí)間可根據(jù)分子量大小調(diào)整轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流）轉(zhuǎn)移時(shí)間可根據(jù)分子量大小調(diào)整轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流大小。小分子的蛋白易轉(zhuǎn)印，故在轉(zhuǎn)移過程中會轉(zhuǎn)印大小。小分子的蛋白易轉(zhuǎn)印，故在轉(zhuǎn)移過程中會轉(zhuǎn)印到膜的反面去。所以大分子的轉(zhuǎn)上去以后，有一部分到膜的反面去。所以大分子的轉(zhuǎn)上去以后，有一部分小分子的就透過到膜的反面，小分子蛋白可使用小孔小分子的就透過到膜的反面，小分子蛋白可使用小孔徑的徑的NCNC膜（膜（0.20.2微米）；微米）； 5 5）重復(fù)使用了轉(zhuǎn)移緩沖液，隨著離子的逐漸減少，）重復(fù)使用了轉(zhuǎn)移緩沖液，隨著離子的逐漸減少，電阻越來越大，當(dāng)然恒壓時(shí)電流越來越小了。建議更電阻越來越大，當(dāng)然

55、恒壓時(shí)電流越來越小了。建議更換轉(zhuǎn)移緩沖液。反復(fù)使用不要超過三次。換轉(zhuǎn)移緩沖液。反復(fù)使用不要超過三次。 6 6）大分子的蛋白轉(zhuǎn)移較慢，）大分子的蛋白轉(zhuǎn)移較慢， 可延長轉(zhuǎn)移時(shí)間可延長轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流，大分子一端就會好得多，但是小分子和電流，大分子一端就會好得多，但是小分子的就有可能會變淡。的就有可能會變淡。 7 7）膠四周平板電極上的緩沖液轉(zhuǎn)印擦干，防）膠四周平板電極上的緩沖液轉(zhuǎn)印擦干，防止電流短路，此時(shí)電流很大。止電流短路，此時(shí)電流很大。 8 8）電壓一定時(shí)而電流過大，可能是轉(zhuǎn)移緩沖）電壓一定時(shí)而電流過大，可能是轉(zhuǎn)移緩沖液不對，如液不對，如10X10X的轉(zhuǎn)移緩沖液未稀釋，也可能的轉(zhuǎn)移緩沖液未稀釋，

56、也可能是上述是上述7 7的原因。的原因。 印跡膜上總蛋白的染色印跡膜上總蛋白的染色 通過對硝酸纖維素膜染色可以了解轉(zhuǎn)印至膜上的總蛋通過對硝酸纖維素膜染色可以了解轉(zhuǎn)印至膜上的總蛋白質(zhì)的組成情況白質(zhì)的組成情況, ,并可確定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)記物的并可確定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)記物的位置和確定轉(zhuǎn)印成功；麗春紅位置和確定轉(zhuǎn)印成功；麗春紅S S帶負(fù)電荷帶負(fù)電荷, , 可以與帶可以與帶正電荷的氨基酸殘基結(jié)合正電荷的氨基酸殘基結(jié)合, , 同時(shí)麗春紅也可以與蛋白同時(shí)麗春紅也可以與蛋白的非極性區(qū)相結(jié)合的非極性區(qū)相結(jié)合, , 從而形成紅色條帶，從而形成紅色條帶， 麗春紅麗春紅S S與與蛋白質(zhì)的結(jié)合是可逆的蛋白質(zhì)的結(jié)合是可

57、逆的, , 紅色染料易被洗脫。紅色染料易被洗脫。 麗春紅麗春紅S S印跡膜染色法：印跡膜染色法： 轉(zhuǎn)印結(jié)束后取出印跡膜至于麗春紅轉(zhuǎn)印結(jié)束后取出印跡膜至于麗春紅S S應(yīng)應(yīng)用液中用液中, , 并在室溫下?lián)u動并在室溫下?lián)u動5-105-10分鐘分鐘 將膜放入將膜放入PBSPBS洗數(shù)次洗數(shù)次, , 每次每次1-21-2分鐘分鐘, , 更換更換PBSPBS 根據(jù)需要將轉(zhuǎn)印部位和分子量標(biāo)準(zhǔn)位根據(jù)需要將轉(zhuǎn)印部位和分子量標(biāo)準(zhǔn)位置進(jìn)行標(biāo)記置進(jìn)行標(biāo)記 至此膜可以用于封閉和加入抗體至此膜可以用于封閉和加入抗體 3 3）電轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜漂于）電轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜漂于TBSTTBST緩沖液，緩沖液，直至完全濕潤、

58、浸泡，稍作淋洗直至完全濕潤、浸泡，稍作淋洗; ;4 4）將膜浸于封閉液，）將膜浸于封閉液，44過夜，以封閉非特異過夜，以封閉非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)性蛋白結(jié)合位點(diǎn); ; 或室溫緩慢搖動或室溫緩慢搖動2-32-3小時(shí)；小時(shí)；膜的封閉在進(jìn)行抗體雜交之前，需要先對轉(zhuǎn)印膜進(jìn)行膜的封閉在進(jìn)行抗體雜交之前，需要先對轉(zhuǎn)印膜進(jìn)行封閉，以防止免疫試劑的非特異性吸附。封閉一般封閉，以防止免疫試劑的非特異性吸附。封閉一般采用異源性蛋白質(zhì)，常用的有采用異源性蛋白質(zhì)，常用的有1-3%BSA1-3%BSA，10%10%馬血清馬血清以及以及3-10% 3-10% 脫脂奶粉等，至于選擇哪一類封閉液，脫脂奶粉等，至于選擇哪一類封閉

59、液，首先應(yīng)考慮與檢測試劑相適應(yīng)，如采用葡萄球蛋白首先應(yīng)考慮與檢測試劑相適應(yīng)，如采用葡萄球蛋白A A（SPASPA）作用檢測試劑，就不能用全血清封閉，其）作用檢測試劑，就不能用全血清封閉，其次是盡可能使非特異著色背景淺，封閉液以次是盡可能使非特異著色背景淺，封閉液以5% 5% 脫脫脂奶粉效果較好，其次是脂奶粉效果較好，其次是3% BSA3% BSA。5 5）將膜浸入多克隆抗體或單克隆抗體）將膜浸入多克隆抗體或單克隆抗體( (即一抗即一抗) )的稀釋液中（用封閉液適當(dāng)倍數(shù)稀釋），室溫的稀釋液中（用封閉液適當(dāng)倍數(shù)稀釋），室溫下在水平搖床上緩慢水平搖動反應(yīng)下在水平搖床上緩慢水平搖動反應(yīng)1-2h;1-2

60、h;6 6） 用用TBSTTBST洗滌洗滌3-53-5次，每次約次，每次約3-5min3-5min；7 7）將膜轉(zhuǎn)移至于）將膜轉(zhuǎn)移至于1:100001:10000倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記抗兔或鼠記抗兔或鼠IgG(IgG(即酶標(biāo)二抗即酶標(biāo)二抗) )中，室溫下輕輕中，室溫下輕輕搖動反應(yīng)搖動反應(yīng)1-2hr1-2hr；8 8）洗膜：）洗膜：TBST TBST 洗膜洗膜 4-54-5次，次， 每次每次3-53-5分鐘，洗分鐘，洗滌是為了洗去二抗的非特異性結(jié)合，洗滌的效滌是為了洗去二抗的非特異性結(jié)合，洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深淺，所以洗滌一定要果直接影響結(jié)果背景的深淺，所以洗滌一定要