第五章 沉淀分離

1、生物分離過程的一般流程生物分離過程的一般流程第五章 沉淀分離5.1 概述5.2 鹽析法5.3 有機(jī)溶劑沉淀法5.4 非離子多聚物沉淀法5.5 其他沉淀法5.1 概述 沉淀的概念沉淀的概念 沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相的過程的過程。在生物工業(yè)、有機(jī)化工工業(yè)、無機(jī)化工工業(yè)及實(shí)驗(yàn)室分析中，沉淀都是分離與純化中最常用的方法之一。 沉淀： 溶質(zhì)溶質(zhì)固相固相5.1 概述 沉淀的作用沉淀的作用有二： 一是濃縮濃縮，通過沉淀目的產(chǎn)物由液相變成固相，濃縮倍數(shù)可達(dá)幾十倍至數(shù)百倍； 二是純化純化，通過沉淀固液分相后，除去留在液相（如果目的產(chǎn)物是固相）或沉積在固相中（目的產(chǎn)物留在液

2、相）的雜質(zhì)。 沉淀法操作步驟沉淀法操作步驟 ：首先加入沉淀劑；首先加入沉淀劑；沉淀劑的陳化，促進(jìn)粒子生長；沉淀劑的陳化，促進(jìn)粒子生長；離心或過濾，收集沉淀物。離心或過濾，收集沉淀物。 加沉淀劑的方式和陳化條件對(duì)產(chǎn)物的純度、收率和沉淀物的形狀都有很大影響。5.1 概述 沉淀分離的應(yīng)用沉淀分離的應(yīng)用 沉淀分離具有成本低、收率高、濃縮倍數(shù)大和操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，因而廣泛應(yīng)用于氨基酸、酶制劑、抗菌素等生物工業(yè)中。 對(duì)于某些不需純度要求的生物產(chǎn)品（如工業(yè)用酶制劑），沉淀分離是一種常用提取方法提取方法。 但對(duì)于某些純度要求很高的生物產(chǎn)品，在沉淀分離中，濃縮作用常大于純化作用，因而沉淀分離通常作為初步分離初步分

3、離的一種方法。 5.1 概述 沉淀劑的選擇 沉淀劑的作用是降低溶質(zhì)的溶解度使之析出，除考慮沉淀效果外還需考慮下列因素：（1）沉淀劑對(duì)目的產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與活性是否有破壞作用；（2）沉淀劑是否容易除去（離子交換、蒸發(fā)、萃取等）；（3）沉淀劑是否有毒性。5.1 概述 沉淀的分類：沉淀的分類：沉淀法有許多種，根據(jù)所用沉淀劑的不同，生物工業(yè)中常用的沉淀方法有如下幾種： 鹽析法鹽析法：多用于蛋白質(zhì)和酶的分離純化。 有機(jī)溶劑法有機(jī)溶劑法：多用于生物小分子、多糖及核酸類產(chǎn)品的分離與純化，有時(shí)也用于蛋白質(zhì)和酶的沉淀。 等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法：用于氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)的沉淀，但此法單獨(dú)應(yīng)用較少，多與其它方法結(jié)合

4、使用。5.1 概述 非離子型聚合物沉淀法非離子型聚合物沉淀法：用于生物大分子，是發(fā)展很快的一種方法。 生成鹽類復(fù)合物沉淀法生成鹽類復(fù)合物沉淀法：用于多種化合物（其中主要是酸性或堿性化合物），其中小分子物質(zhì)的沉淀應(yīng)用較多。 選擇變性沉淀法選擇變性沉淀法：熱變性或酸堿變性沉淀法，常用于除去某些不耐熱及在一定pH值下易變性的雜蛋白。但應(yīng)以在實(shí)驗(yàn)條件下所分離物質(zhì)的活性不受影響為前提。5.2 鹽析法 一般說來，所有固性溶質(zhì)都可以在溶液中加所有固性溶質(zhì)都可以在溶液中加入中性鹽而沉淀析出入中性鹽而沉淀析出，這一過程稱為鹽析鹽析。鹽析法具有如下特點(diǎn)： （1 1）成本低成本低，不需要什么特別昂貴的設(shè)備； （2）

5、操作簡單、安全操作簡單、安全； （3）對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用； （4）存在產(chǎn)品與雜質(zhì)的共沉作用存在產(chǎn)品與雜質(zhì)的共沉作用，因而它只能作為初步純化初步純化。 5.2.1 基本原理基本原理 5.2.1.1鹽析原理鹽析原理 蛋白分子的表面蛋白分子的表面同時(shí)含有帶電荷的親水基團(tuán)親水基團(tuán)和不帶電荷的疏水基團(tuán)疏水基團(tuán)。 蛋白質(zhì)的溶解度差別取決于蛋白質(zhì)分子中極性基團(tuán)與非極性基團(tuán)的比例和這些基團(tuán)的排列位置。 5.2.1.1鹽析原理鹽析原理（1）水合作用水合作用： 在水溶液中，蛋白質(zhì)分子中的親水基團(tuán)吸聚著許多水分子，這種作用稱為水合作用。這些水分子在蛋白質(zhì)分子的表面形成一層水

6、化膜水化膜。 由于水膜的存在，各蛋白質(zhì)分子間彼此隔開，使蛋白質(zhì)分子在水中呈溶解狀態(tài)。 穩(wěn)定的親水溶液分子間彼此隔開形成水化膜水分子親水基團(tuán)水合作用5.2.1.1鹽析原理鹽析原理（2）鹽溶作用鹽溶作用(Salt-in)(Salt-in)： 蛋白質(zhì)在低鹽濃度下發(fā)生鹽溶蛋白質(zhì)在低鹽濃度下發(fā)生鹽溶，這是因?yàn)楫?dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入少量中性鹽時(shí)，中性鹽離子對(duì)蛋白質(zhì)分子表面親水基團(tuán)（及水活度）的影響，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子與水分子的相互作用力，從而使蛋白質(zhì)的溶解度增大。 蛋白質(zhì)溶液少量中性鹽 增加蛋白質(zhì)分子與水分子的相互作用蛋白質(zhì)溶解度5.2.1.1鹽析原理鹽析原理蛋白質(zhì)在高鹽濃度下發(fā)生鹽析，這是因?yàn)楫?dāng)中性鹽濃度增

7、加至一蛋白質(zhì)在高鹽濃度下發(fā)生鹽析，這是因?yàn)楫?dāng)中性鹽濃度增加至一定程度時(shí)，蛋白質(zhì)表面電荷被大量中和（親水基團(tuán)被大量中性鹽定程度時(shí)，蛋白質(zhì)表面電荷被大量中和（親水基團(tuán)被大量中性鹽離子所包圍），水分子離開蛋白質(zhì)的周圍，暴露出疏水區(qū)域，疏離子所包圍），水分子離開蛋白質(zhì)的周圍，暴露出疏水區(qū)域，疏水區(qū)域間的相互作用，使蛋白質(zhì)分子相互聚集而沉淀。水區(qū)域間的相互作用，使蛋白質(zhì)分子相互聚集而沉淀。 （3）鹽析作用（鹽析作用（Salting-out)Salting-out)： 加入大量中性鹽 蛋白質(zhì)溶液親水基團(tuán)被中性鹽包圍 疏水基團(tuán)的相互作用蛋白質(zhì)相互聚集（溶解度下降） 暴露疏水區(qū)域水分子離開蛋白質(zhì)lgS （溶解

8、度）I （離子強(qiáng)度） 鹽溶鹽析 圖5-1 溶液離子強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系5.2.1.2 Cohn方程式 蛋白質(zhì)鹽析時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度與鹽濃度的關(guān)系可由Cohn經(jīng)驗(yàn)公式來表示： （5-1）其中： （5-2）式中：S 蛋白質(zhì)的溶解度（g/L） I 離子強(qiáng)度 mi i離子的摩爾濃度（mol/L） Zi i離子所帶的電荷數(shù)（即離子的價(jià)數(shù)） 鹽析常數(shù)，與鹽的種類無關(guān) KS 鹽析常數(shù)，與溫度和pH無關(guān)IKSslg221iiZmI 關(guān)于關(guān)于值：值： （1）值與鹽的種類無關(guān)，值與鹽的種類無關(guān)，在式（5-1）中，令I(lǐng)=0，則： =lg S0 （5-3） S0表示在純?nèi)軇┲校碔=0）蛋白質(zhì)的溶解度，由此可見是一

9、個(gè)與鹽的種類無關(guān)的常數(shù)。值的大小主要決定于蛋白質(zhì)的性質(zhì)。 （2）值不可能直接測定值不可能直接測定 值是假定離子強(qiáng)度I=0時(shí)，用外推法求出的。事實(shí)上由于鹽溶作用的存在，I=0時(shí)的溶解度比低鹽溶液要低。 （3）值隨溫度和值隨溫度和pH而變而變 關(guān)于關(guān)于KS主要取決于蛋白質(zhì)和鹽的種類，取決于蛋白質(zhì)和鹽的種類，而與溫度和而與溫度和pH無關(guān)。無關(guān)。 （1）KS與蛋白質(zhì)種類的關(guān)系與蛋白質(zhì)種類的關(guān)系對(duì)于不同的蛋白質(zhì)，KS值的變化不是很大，大多不超過1倍。一般地：組成相同的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)，分子量越大分子量越大，KS較大較大，沉淀所需用鹽量越少用鹽量越少；蛋白質(zhì)分子不對(duì)稱分子不對(duì)稱性越大性越大，KS值較大值較大，

10、越容易沉淀越容易沉淀。如表5-2所示為采用硫酸銨鹽析時(shí)不同蛋白質(zhì)的鹽析常數(shù)。 表5-2 硫酸銨對(duì)不同蛋白質(zhì)的鹽析常數(shù) 蛋白質(zhì) 馬血紅蛋白 馬肌紅蛋白 卵青蛋白 纖維蛋白原 KS 0.71 0.94 1.22 1.46 （2）KS與鹽種類的關(guān)系與鹽種類的關(guān)系 不同種類的鹽，對(duì)KS的影響較大。KS值較大，就意味著該鹽的鹽析效果好，其中陰離子的影響較顯著陰離子的影響較顯著，而陽離子的影響是第二位的。 對(duì)于陰離子陰離子，含高價(jià)高價(jià)陰離子的鹽，效果比低價(jià)的好比低價(jià)的好。常用陰離子的鹽析效果排列如下：檸檬酸鹽檸檬酸鹽POPO4 43-3-SOSO4 42-2-CHCH3 3COOCOO- - ClCl-

11、-NONO3 3- -SCNSCN- - 對(duì)于陽離子陽離子，一般地高價(jià)高價(jià)陽離子（如Mg2+、Ca2+）不不如低價(jià)如低價(jià)陽離子，常用一價(jià)陽離子的鹽析效果排列如下： NHNH4 4+ + K K+ + NaNa+ + 而常用鹽析劑鹽析效果的排列順序?yàn)椋?NaHNaH2 2POPO4 4 (NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4NaNa2 2SOSO4 4MgSOMgSO4 4NaClNaCl表5-1 不同鹽類對(duì)碳氧血紅蛋白的KS值和值 用不同鹽類采用外推法求值時(shí)，因溫度和pH等條件不同，值會(huì)有所變動(dòng)。如表5-1所示，各種鹽類對(duì)碳氧血紅蛋白的值在3.0左右。 鹽種類 磷酸鉀 硫酸鈉 硫酸銨檸檬

12、酸鈉 硫酸鎂 3.01 2.53 3.09 2.60 3.23 KS 1.00 0.76 0.71 0.69 0.335.2.1.3 分段鹽析法分段鹽析法 （1）KS分段鹽析法分段鹽析法 改變離子強(qiáng)度改變離子強(qiáng)度 對(duì)于蛋白質(zhì)混合物，不同蛋白質(zhì)在不同離子強(qiáng)度下的不同蛋白質(zhì)在不同離子強(qiáng)度下的溶解度不同溶解度不同，發(fā)生鹽析時(shí)所需的離子強(qiáng)度也就不同。根據(jù)這一原理，采用不同離子強(qiáng)度分步鹽析的方法，即可從蛋白質(zhì)混合物中分離各種不同的組份。如： 硫酸銨飽和度硫酸銨飽和度 開始析出的蛋白質(zhì)種類開始析出的蛋白質(zhì)種類 20% 纖維蛋白原纖維蛋白原 2833% 血紅蛋白血紅蛋白 3335% 擬球蛋白擬球蛋白 50%

13、 清蛋白清蛋白 80% 肌紅蛋白肌紅蛋白 這種改變離子強(qiáng)度的分段鹽析法稱為這種改變離子強(qiáng)度的分段鹽析法稱為KS分段鹽析法分段鹽析法，常用于粗蛋白質(zhì)和酶的分段分離。204060800100總蛋白總蛋白目標(biāo)蛋白質(zhì)目標(biāo)蛋白質(zhì)最適飽和度是30%，55%5.2.1.3 分段鹽析法分段鹽析法 （2）分段鹽析法分段鹽析法改變改變pH和溫度和溫度 不同蛋白質(zhì)在不同溫度和不同蛋白質(zhì)在不同溫度和pH值下的溶解度不值下的溶解度不同同，因此在一定離子強(qiáng)度下改變混合液pH和溫度亦可實(shí)現(xiàn)分段鹽析的目的。 由于這種方法是通過改通過改值的大小值的大小來實(shí)現(xiàn)的，因而叫做做分段鹽析法分段鹽析法。此法常用于蛋白質(zhì)的進(jìn)一步純化和結(jié)晶

14、時(shí)使用。 5.2.2 影響鹽析的若干因素影響鹽析的若干因素 5.2.2.1 蛋白質(zhì)的濃度與鹽析的關(guān)系蛋白質(zhì)的濃度與鹽析的關(guān)系 從Cohn式可知，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度較低時(shí)，發(fā)生鹽析時(shí)需要較高的離子濃度。 如用硫酸銨鹽析碳氧肌紅蛋白（COMb）時(shí)： 蛋白質(zhì)起始濃度蛋白質(zhì)起始濃度 COMb開始沉淀時(shí)開始沉淀時(shí)硫酸銨的飽和度硫酸銨的飽和度90%的的COMb沉淀析沉淀析出時(shí)硫酸銨的飽和度出時(shí)硫酸銨的飽和度 30g/L 58%65% 3g/L 66%73% 由此可見，在不同濃度的蛋白質(zhì)溶液中進(jìn)行鹽析，使用硫酸銨的飽和度是不相同的。 5.2.2.1 蛋白質(zhì)的濃度與鹽析的關(guān)系蛋白質(zhì)的濃度與鹽析的關(guān)系 用于分步分離提

15、純時(shí)用于分步分離提純時(shí)，一般采用較稀的蛋白質(zhì)溶液采用較稀的蛋白質(zhì)溶液，多加一些中性鹽，使共沉作用減少至最低限度，一般一般采用的蛋白質(zhì)濃度為為2.53.0%。 不利于雜質(zhì)分離易發(fā)生雜蛋白共沉作用鹽用量利于雜質(zhì)分離雜蛋白共沉作用少鹽用量 蛋白質(zhì)起始濃度高蛋白質(zhì)起始濃度高蛋白質(zhì)起始濃度低蛋白質(zhì)起始濃度低5.2.2.2 pH對(duì)鹽析的影響對(duì)鹽析的影響 蛋白質(zhì)凈電荷越多蛋白質(zhì)凈電荷越多它的溶解度越大溶解度越大 值(lgS0)就越高越高。 改變改變?nèi)芤旱膒H即可改變蛋白質(zhì)分子所帶凈電改變蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷的數(shù)量荷的數(shù)量從而改變改變值值的大小。 當(dāng)當(dāng)pH值為值為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）時(shí)）時(shí)，蛋白質(zhì)分蛋白質(zhì)分

16、子上的凈電荷數(shù)為零子上的凈電荷數(shù)為零，溶解度最小，溶解度最小，值最低。值最低。因此在鹽析時(shí)常選擇溶液pH在該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。pH兩種蛋白質(zhì)的相對(duì)溶解兩種蛋白質(zhì)的相對(duì)溶解度會(huì)隨度會(huì)隨pHpH而變化很大；而變化很大；隨隨pH pH 變化變化（1 1）對(duì)數(shù)關(guān)系）對(duì)數(shù)關(guān)系（2 2） 等電點(diǎn)附近有極小值等電點(diǎn)附近有極小值5.2.2.2 pH對(duì)鹽析的影響對(duì)鹽析的影響（1）pH值對(duì)鹽析的影響較大： 由于=lgS0， 當(dāng)值增加值增加1 1時(shí)，溶解度（S S）就增加增加1010倍倍。 對(duì)某些蛋白質(zhì)，在一定鹽濃度下，不同的pH下的值相差達(dá)3倍以上，也即蛋白質(zhì)溶解度的變化達(dá)1000倍以上。 因此，鹽析過程中pH

17、的控制是非常嚴(yán)格的。（2）關(guān)于pI值： 在水中或稀鹽溶液中在水中或稀鹽溶液中測得的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（pIpI），與高與高鹽濃度下鹽濃度下所測的結(jié)果不一定相同。不一定相同。 因此需根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整pH值至蛋白質(zhì)溶解度最低處，才能獲得更好的效果。 5.2.2.3 溫度對(duì)鹽析的影響溫度對(duì)鹽析的影響 一般說來，溫度升高，溶質(zhì)的溶解度增大一般說來，溫度升高，溶質(zhì)的溶解度增大。（1）在低鹽溶液或純水中）在低鹽溶液或純水中，生物大分子的溶解度生物大分子的溶解度大多數(shù)在一定范圍內(nèi)隨溫度的升高而增加；隨溫度的升高而增加；（2）在高鹽溶液中）在高鹽溶液中，生物大分子的溶解度隨溫度的升高生物大分子的溶解度隨溫度

18、的升高而減少而減少，這是因?yàn)檩^高的溫度會(huì)使蛋白質(zhì)分子失水較高的溫度會(huì)使蛋白質(zhì)分子失水，因而利于沉淀。（3）盡管較高的溫度有利于鹽析沉淀，但較高溫度易使蛋白質(zhì)變性和發(fā)生共沉作用，因此蛋白質(zhì)鹽析過程通常在室溫下進(jìn)行（25左右），對(duì)某些溫度比較敏感的酶，則需要在低溫下（04）操作。 5.2.3 硫酸銨鹽析法硫酸銨鹽析法 常用鹽析劑：硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、磷酸鈉、磷酸鉀、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉和硫氰化鉀等。 硫酸銨硫酸銨：溶解度大：溶解度大，但緩沖能力弱緩沖能力弱，此外因含有NHNH4 4+ +，對(duì)蛋白質(zhì)的分析對(duì)蛋白質(zhì)的分析會(huì)帶來帶來一定影響影響。 硫酸鈉硫酸鈉：不含氮：不含氮，不影響蛋白質(zhì)的定量測

19、定；但溶解度較低溶解度較低，一般要在一般要在3030以上操作以上操作效果較好。 5.2.3 硫酸銨鹽析法硫酸銨鹽析法 表5-3 不同溫度下硫酸銨和硫酸鈉的溶解度溫度（） 0 10 20 25 30硫酸銨 (g/kg水)706.96 730.73 757.16 769.05 780.95(mol/kg水) 5.35 5.53 5.73 5.82 5.91硫酸鈉 （g/L） 13.8 18.4 24.8 28.2 32.6(mol/L)0.0970.1300.1750.1990.230硫酸銨的加入有以下幾種方法：硫酸銨的加入有以下幾種方法：1 1）加入固體鹽法）加入固體鹽法 用于要求飽和度較高而不

20、增大溶液體積的情用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應(yīng)分批加入，況；工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應(yīng)分批加入，并充分?jǐn)嚢?，使其完全溶解和防止局部濃度過高；并充分?jǐn)嚢?，使其完全溶解和防止局部濃度過高；2 2）加入飽和溶液法）加入飽和溶液法 用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況；它可防止局部過濃，但加量較多時(shí)，料液會(huì)被稀釋。的情況；它可防止局部過濃，但加量較多時(shí)，料液會(huì)被稀釋。3 3）透析平衡法）透析平衡法 先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進(jìn)行透

21、析，袋內(nèi)飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后，硫酸銨中進(jìn)行透析，袋內(nèi)飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后，目的蛋白析出。該法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析目的蛋白析出。該法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但程序煩瑣，故多用于結(jié)晶。效果好，但程序煩瑣，故多用于結(jié)晶。5.2.3.1 硫酸銨的預(yù)處理 重金屬離子的處理（醫(yī)用）：（1）重結(jié)晶；（2）H2S處理除重金屬（對(duì)巰基敏感） pH調(diào)整：（1）當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的pI5.0時(shí)，用氨水5.2.3.2 硫酸銨飽和度的調(diào)整（分段鹽析）飽和度的調(diào)整（分段鹽析）（1）加入固體鹽法：適加入固體鹽法：適合于飽和度較高的場合于飽和度較高的場合。合。 每升硫酸銨溶液從飽

22、和度S1增至S2所需加入硫酸銨的克數(shù)可用下式計(jì)算：2123 . 0100)(533SSSG（2）加入飽和溶液法：加入飽和溶液法：適合于飽和度不高的場適合于飽和度不高的場合合 。 V1升硫酸銨溶液從飽和度S1增至S2所需加入硫酸銨飽和溶液的體積為 ：1212)100()(VSSSV5.3 有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法 5.3.1 有機(jī)溶劑法沉淀原理有機(jī)溶劑法沉淀原理 一般水溶液一般水溶液加入有機(jī)溶劑加入有機(jī)溶劑水溶液的介電常數(shù)水溶液的介電常數(shù)溶質(zhì)分溶質(zhì)分子（蛋白質(zhì)）之間靜電引力子（蛋白質(zhì)）之間靜電引力溶質(zhì)的溶解度溶質(zhì)的溶解度。 對(duì)于具有表面水化層的生物大分子：生物大分子溶液生物大分子溶液有機(jī)溶劑

23、與水作用有機(jī)溶劑與水作用表面水化層被壓縮表面水化層被壓縮生生物大分子脫水物大分子脫水聚集析出。聚集析出。有機(jī)溶劑沉淀法具有如下特點(diǎn)：不同溶質(zhì)的沉淀所要求的有機(jī)溶劑濃度不同不同溶質(zhì)的沉淀所要求的有機(jī)溶劑濃度不同，這是這是有機(jī)溶劑分步沉淀的基礎(chǔ)分步沉淀的基礎(chǔ)。其分辨能力比分辨能力比鹽析法高鹽析法高。溶劑容易蒸發(fā)除去溶劑容易蒸發(fā)除去，因此適合于適合于制備食品用食品用蛋白質(zhì)。有機(jī)溶劑密度低有機(jī)溶劑密度低，與沉淀物密度差大，過濾和過濾和離心分離離心分離都較容易容易。容易使某些生物大分子變性失活容易使某些生物大分子變性失活。有機(jī)溶劑易燃易爆，操作常需在低溫下進(jìn)行操作常需在低溫下進(jìn)行。 5.3.2 有機(jī)溶劑

24、的選擇有機(jī)溶劑的選擇 選擇依據(jù)：選擇依據(jù)： 能和水混溶；能和水混溶； 用量少；用量少； 生物物質(zhì)活性的損失少；生物物質(zhì)活性的損失少； 最好無毒性。最好無毒性。 常用溶劑：常用溶劑： 糖類、氨基酸、核苷酸糖類、氨基酸、核苷酸最常用的是乙醇最常用的是乙醇 核酸核酸常用的有乙醇、異丙酮、常用的有乙醇、異丙酮、-二氧基乙醇二氧基乙醇 蛋白質(zhì)、酶蛋白質(zhì)、酶乙醇、甲醇、丙酮乙醇、甲醇、丙酮5.3.3 有機(jī)溶劑沉淀的影響因素有機(jī)溶劑沉淀的影響因素 （1）溫度溫度 活大分子生物物質(zhì)變性失有機(jī)溶劑用量溶解度采用低溫沉淀 （2）pH 接近等電點(diǎn)時(shí)等電點(diǎn)時(shí)，引起沉淀所需的有機(jī)溶劑濃度有機(jī)溶劑濃度較少較少，利于提高沉

25、淀效果沉淀效果。 選擇適宜的適宜的pHpH可提高分離的分辨能力，利于利于提高分離效果提高分離效果。 （3）樣品濃度樣品濃度 濃度高時(shí) 不利于產(chǎn)品純化共沉作用大變性可能性少溶劑用量少濃度低時(shí) 分離效果好共沉作用少活性物質(zhì)易變性失活樣品回收率低溶劑用量大（4）金屬離子的影響 某些高價(jià)陽離子某些高價(jià)陽離子的存在生物物質(zhì)的溶解度生物物質(zhì)的溶解度沉淀沉淀效果效果 如：如：ZnZn2+2+和和CaCa2+2+在一定在一定pHpH值下與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)值下與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，使溶解度大大下降。形成復(fù)合物，使溶解度大大下降。0.005M0.005M至至0.02M0.02M的的ZnZn2+2+

26、可以使原來沉淀蛋白質(zhì)的有機(jī)溶劑用量減少可以使原來沉淀蛋白質(zhì)的有機(jī)溶劑用量減少1/31/3至至1/21/2。 高價(jià)陽離子與雜蛋白和弱酸鹽形成沉淀高價(jià)陽離子與雜蛋白和弱酸鹽形成沉淀蛋白質(zhì)分離蛋白質(zhì)分離提純效果提純效果 所以使用高價(jià)陽離子時(shí)需事先除去雜蛋白及磷酸鹽等所以使用高價(jià)陽離子時(shí)需事先除去雜蛋白及磷酸鹽等雜質(zhì)，以免產(chǎn)生共沉作用。雜質(zhì)，以免產(chǎn)生共沉作用。（5）離子強(qiáng)度的影響離子強(qiáng)度的影響 中性鹽濃度較高時(shí)（0.2 mol/L以上），會(huì)增加蛋白質(zhì)或酶在有機(jī)溶劑中的溶解度，使有機(jī)溶劑的用量增大。有機(jī)溶劑的用量增大。因而鹽濃度太高時(shí)，需要采用透析等方法使鹽含需要采用透析等方法使鹽含量降低量降低。 對(duì)于

27、蛋白質(zhì)和多糖，離子強(qiáng)度為0.01-0.05 mol/L比較合適，少量鹽的存在還對(duì)蛋白質(zhì)的活性有保護(hù)作用。 5.4 非離子多聚物沉淀法 最早用于 提純免疫球蛋白5.4.1 原理 沉淀作用是多聚物與大分子發(fā)生共沉作用的結(jié)果。 與有機(jī)溶劑相似，使大分子的水化度降低，促使大分子沉淀。 多聚物與大分子之間以氫鍵相結(jié)合形成復(fù)合物。5.4.2 常用非離子多聚物 聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、壬苯乙烯化氧（NPEO）、右旋糖酐硫酸鈉等。 PEG親水性強(qiáng)、無毒、不可燃性，且對(duì)蛋白質(zhì)活性有保護(hù)作用，是應(yīng)用最廣的非離子聚合物沉淀劑。5.4.3 影響PEG沉淀法的主要因素（1）沉淀劑濃度，蛋白質(zhì)溶解度與PEG濃度之間的

28、關(guān)系類似于鹽析作用：lgS = lgS0 - KsPEG（2）離子濃度：在固定pH值下，鹽濃度越高，PEG用量越少。（3）pH：在pI時(shí)，PEG用量最小。（4）PEG分子量：在一定范圍內(nèi)，高分子量PEG沉淀的效果較好，但粘度高，操作與分離困難。4000左右最為常用。5.4.4 PEG沉淀法特點(diǎn)（1）操作條件溫和，變性失活少。（2）具有極高的沉淀效果，用量較少，PEG濃度一般為10%左右。（3）產(chǎn)物顆粒大，容易收集。5.5 其他沉淀法 等電點(diǎn)沉淀法 生成鹽類復(fù)合物沉淀法 選擇變性沉淀法5.5.1 等電點(diǎn)沉淀法 兩性物質(zhì)氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)、酶、核酸等。 等電點(diǎn)沉淀法主要是利用兩性物兩性物質(zhì)質(zhì)分子在電中性在電中性時(shí)的溶解度最低時(shí)的溶解度最低，而各種兩性物質(zhì)各種兩性物質(zhì)具有不同的等電具有不同的等電點(diǎn)點(diǎn)而進(jìn)行分離的