醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室評審員持續(xù)培訓(xùn)評審組長同級轉(zhuǎn)換培訓(xùn)班上海

1、醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室評審員持續(xù)培訓(xùn)/評審組長同級轉(zhuǎn)換培訓(xùn)班上海2009-4-2526現(xiàn)場評審的基本思路 基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室均經(jīng)過衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心的技術(shù)驗(yàn)收，驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)又基本參照了ISO15189認(rèn)可準(zhǔn)則的要求，所以，在評審準(zhǔn)備要實(shí)驗(yàn)室提供驗(yàn)收合格證書 日程安排上不能因通過了技術(shù)驗(yàn)收而忽視了PCR實(shí)驗(yàn)室的認(rèn)可 重點(diǎn)關(guān)注申請的項(xiàng)目是否都有批文、各項(xiàng)記錄是否完善等內(nèi)容常見不符合項(xiàng)舉例及分析 HBV-DNA可報告范圍為103108，HCV-RNA可報告范圍為103107，標(biāo)準(zhǔn)曲線和室內(nèi)質(zhì)控的濃度設(shè)定都在104以上，建議觀察103低濃度值。 有一位從事臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)工作人員未獲得培訓(xùn)合格證書分區(qū)現(xiàn)場評審的重要環(huán)

2、節(jié) 檢驗(yàn)前程序（PCR技術(shù)驗(yàn)收表6標(biāo)本管理） 驗(yàn)收表比較簡單，應(yīng)注意RNA、分泌物等標(biāo)本的采集、運(yùn)輸和保存 檢驗(yàn)程序（見后） 檢驗(yàn)后程序（注意TAT是否滿足質(zhì)量目標(biāo)的要求；報告單所必須包含的內(nèi)容） 座談會（要了解臨床對定量HBV-DNA；性病檢測）DNA、RNA的保存 DNA標(biāo)本無菌條件2-8保存不超過3天，超過3天- 20 。標(biāo)本長期保存應(yīng)在-70。避免多次反復(fù)凍融。DNA在TE緩沖液中（10mmol/L Tris-Hcl，1mmol/L EDTA，PH 8.0），4儲存6個月以上，其中EDTA還可抑制微生物生長。 RNA容易降解，操作和儲存中要防止RNA酶的污染。所用器皿高壓滅菌后用，重蒸

3、水配制或用焦碳酸二乙酯（DEPC）處理過的蒸餾水溶解RNA，RNA溶液中加入RNA酶抑制劑（RNasin）， 終濃度為2U/10l，置-20保存?zhèn)溆?。冰塊上操作為宜。其他標(biāo)本 棉拭子 生理鹽水充分振蕩洗滌、靜置510min、取上清、離心、沉淀物提DNA。如不立即提取，存70 膿液 沉淀標(biāo)本的保存同樣為70 體液 沉淀標(biāo)本的保存同上檢測系統(tǒng) 校準(zhǔn)（加樣器、溫濕度計、擴(kuò)增儀） 查看文件與實(shí)際校準(zhǔn)的情況 頻度：首次（新安裝）； 后續(xù)（主要部件維修，強(qiáng)制周期如 每年，不定期） PCR儀：溫度準(zhǔn)確度及升降速率；熒光本底；激發(fā)及吸收波長的準(zhǔn)確度、雜閃光、重復(fù)性、線性檢測系統(tǒng) 比對沒有開展室間質(zhì)評的項(xiàng)目；比

4、對的結(jié)果 性能驗(yàn)證新啟用的設(shè)備 維護(hù)保養(yǎng)保養(yǎng)程序、操作手冊 嚴(yán)格按照儀器使用手冊編寫， 包括日、周、月、季、半年、年標(biāo)識（時間、名稱）記錄現(xiàn)場評審的關(guān)注點(diǎn) 檢測系統(tǒng) 室內(nèi)質(zhì)控 室間質(zhì)評 溯源及測量不確定度 現(xiàn)場試驗(yàn) 人員能力 檢驗(yàn)前程序觀察 檢驗(yàn)報告 生物安全 座談會室內(nèi)質(zhì)控 采用一系列統(tǒng)計學(xué)的方法連續(xù)地評價檢測工作的可靠程度，判斷檢驗(yàn)報告是否可以發(fā)出的過程 目的是控制本實(shí)驗(yàn)室測定工作的精密度，監(jiān)測其準(zhǔn)確度的改變，提高常規(guī)檢驗(yàn)工作的批間、批內(nèi)標(biāo)本檢測結(jié)果的一致性 室內(nèi)質(zhì)控規(guī)則的制定是否合理（質(zhì)控圖、質(zhì)控水平、質(zhì)控頻率） 每次現(xiàn)場驗(yàn)收問題最多的地方室內(nèi)質(zhì)控 質(zhì)控目的：假陰性、假陽性，準(zhǔn)確性、精密

5、度 質(zhì)控點(diǎn)：樣本質(zhì)量、模板提取、擴(kuò)增效率 質(zhì)控物安排：空白、陰對、弱陽對、標(biāo)準(zhǔn)品 控制范圍：空白、陰對-陰性 弱陽對-陽性（上下一次方） 標(biāo)準(zhǔn)品-r值（ - 0.998） 斜率（-3.1- -3.5） 截距（40左右；達(dá)安 30） 點(diǎn)間CT值 （3.3左右）如何確定閾值 基線的作用（Baseline cycles ） 消除檢測中背景熒光信號的影響，確定閾值 基線的范圍：儀器一般默認(rèn)的范圍（應(yīng)根據(jù)試劑合要求） PE-5700 、PE-7000 3-15 iCycle 2-10 LightCycle 3-12 基線需根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整：延長基線以包括最高濃度樣本擴(kuò)增曲線起跳前盡可能多的循環(huán)，

6、可以使擴(kuò)增曲線更平滑、數(shù)據(jù)也得到一定改善。 閾值線 熒光閾值線的調(diào)整 需根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整 1、落在陰性對照線最高點(diǎn)上方 2、外標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線的均一位置（點(diǎn)間CT3.3左右）3、盡量接近擴(kuò)增曲線剛真正進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期的位置（避免弱陽性漏檢以及一些擴(kuò)增反應(yīng)影響因素在指數(shù)期的放大）Threshold Cycle Calculation: Baseline cycles ThroughThreshold Position21420.8標(biāo)準(zhǔn)曲線 通過基線和熒光域值線的調(diào)整應(yīng)達(dá)到： 相關(guān)系數(shù)（ r值） 0.998 斜率 -3.0 -3.5 截距 -404 （這些參數(shù)根據(jù)儀器和試劑有所不同）室間質(zhì)評 參

7、加衛(wèi)生部及省內(nèi)質(zhì)評計劃 原始記錄及結(jié)果報告 室間質(zhì)評結(jié)果分析報告（如果沒有分析報告，應(yīng)該開觀察項(xiàng)還是不符合項(xiàng)？開在哪一條？） 不符合項(xiàng)（原因分析及整改措施有效性）溯源及測量不確定度 檢測系統(tǒng)配置的基本情況 溯源性確認(rèn)的基本原則 不能溯源時，結(jié)果可靠性的確認(rèn)原則 測量不確定度（評審把握的尺度、具體舉例）現(xiàn)場試驗(yàn) 現(xiàn)場試驗(yàn)選擇的原則 現(xiàn)場試驗(yàn)的方式（人員比對） 現(xiàn)場試驗(yàn)結(jié)果分析和判定 盲樣試驗(yàn)的基本要求人員能力 評審方式（查看技術(shù)人員檔案、提問、現(xiàn)場試驗(yàn)、現(xiàn)場操作） 理論知識（防污染知識、生物安全知識） 技術(shù)能力 問題處理（發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題的能力）座談會 座談的原則與技巧（了解、關(guān)注臨

8、床新技術(shù)新進(jìn)展） 關(guān)注的關(guān)鍵問題（明確幾個必問的與專業(yè)相關(guān)的問題） 100,00010,000-99,999HBV DNAHBV DNA與肝細(xì)胞癌和肝硬化發(fā)生危險升高相關(guān)與肝細(xì)胞癌和肝硬化發(fā)生危險升高相關(guān) REVEAL: 長期隨訪臺灣未治療的HBsAg陽性個體基線基線HBV DNA (拷貝拷貝/mL)患者患者(%)隨訪隨訪13年年累積肝細(xì)胞癌的發(fā)生率累積肝細(xì)胞癌的發(fā)生率1 (N = 3653)504030201001.31.43.612.214.9隨訪隨訪13年年累積肝硬化發(fā)生率累積肝硬化發(fā)生率2 (N = 3582)4.55.99.823.536.2 300300-9991000-9999

9、300300-999910,000-99,999100,000-999,999 1 million1. Chen CJ, et al. JAMA. 2006;295:65-73. 2. Iloeje UH, et al. Gastroenterology. 2006;130:678-686.1.000.960.920.880.840.800123456789101112Survival distribution functionSurvival time (years)HBV DNA High (+)RR=9.9 (3.231.0)HBV DNA Low (+)RR=1.8 (0.55.8)HBV DNA (-)Chen G et al. 55th AASLD Boston, Nov 2004; Poster 1362HCC HCC 病死率與基線病死率與基線HBVHBV病毒載量的關(guān)系病毒載量的關(guān)系HBV DNA Low (+)RR=1.5 (0.211.8)HBV DNA (-)HBV DNA High (+)RR=13.4 (1.997.1)Chen G et al. 55th AASLD Boston, Nov 2004; Poster