聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及其在分子診斷中的應(yīng)用

1、.薂薆罿聿蒈薆肁芅莄薅螁肈芀薄袃芃蕿薃羅肆蒅螞肇節(jié)莁蟻螇肄芇蟻衿芀芃蝕肂膃薁蠆螁莈蕆蚈襖膁莃蚇羆莆艿蚆肈腿薈螅螈羂蒄螅袀膈莀螄肅羀莆螃螂芆節(jié)螂裊聿薀螁羇芄蒆螀聿肇莂蝿蝿節(jié)羋衿袁肅薇袈羃芁蒃袇膆肅葿袆裊荿蒞蒂羈膂芁蒂肀莇薀蒁螀膀蒆蒀袂莆莂蕿羄膈羋薈肇羈薆薇螆膇薂薆罿聿蒈薆肁芅莄薅螁肈芀薄袃芃蕿薃羅肆蒅螞肇節(jié)莁蟻螇肄芇蟻衿芀芃蝕肂膃薁蠆螁莈蕆蚈襖膁莃蚇羆莆艿蚆肈腿薈螅螈羂蒄螅袀膈莀螄肅羀莆螃螂芆節(jié)螂裊聿薀螁羇芄蒆螀聿肇莂蝿蝿節(jié)羋衿袁肅薇袈羃芁蒃袇膆肅葿袆裊荿蒞蒂羈膂芁蒂肀莇薀蒁螀膀蒆蒀袂莆莂蕿羄膈羋薈肇羈薆薇螆膇薂薆罿聿蒈薆肁芅莄薅螁肈芀薄袃芃蕿薃羅肆蒅螞肇節(jié)莁蟻螇肄芇蟻衿芀芃蝕肂膃薁蠆螁莈蕆蚈襖

2、膁莃蚇羆莆艿蚆肈腿薈螅螈羂蒄螅袀膈莀螄肅羀莆螃螂芆節(jié)螂裊聿薀螁羇芄蒆螀聿肇莂蝿蝿節(jié)羋衿袁肅薇袈羃芁蒃袇膆肅葿袆裊荿蒞蒂羈膂芁蒂肀莇薀蒁螀膀蒆蒀袂莆莂蕿羄膈羋薈肇羈薆薇螆膇薂薆罿聿蒈薆肁芅莄薅螁肈芀薄袃芃蕿薃羅肆蒅螞肇節(jié)莁蟻螇肄芇蟻衿芀芃蝕肂膃薁蠆螁莈蕆蚈襖膁莃蚇羆莆艿蚆肈腿薈螅螈羂蒄螅袀膈莀螄肅羀莆 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及其在分子診斷中的應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)于1983年由美國(guó)Cetus公司  的K.Mullis建立，并和定點(diǎn)突變的發(fā)明者    M.Smith一起榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，  為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究開創(chuàng)了嶄

3、新時(shí)代。一、PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過程DNA的體外復(fù)制包括3個(gè)步驟： ¡ C°C 95 °      變性（denaturation）:94 C°C  70 °        退火（annealing）:40 ¡ C°        延伸（extension）:72 ¡       3個(gè)步驟作為PCR的一個(gè)循環(huán)，每當(dāng)完成一個(gè)循環(huán)，一個(gè)分子的

4、模板被復(fù)制為二個(gè)，產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長(zhǎng)。二、PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件（一）PCR反應(yīng)體系參與PCR反應(yīng)的主要成份:模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和緩沖液等。1、 模板           包括基因組DNA、RNA、質(zhì)粒DNA、線粒體DNA等¡   ¡        模板DNA需較高的濃度           RNA作為模板時(shí)，須先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以¡  

5、;      cDNA作為擴(kuò)增的模板¼           模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng¡2、引  物（Primers)   引物決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度，是化學(xué)合成的寡核苷酸片段。        化學(xué)合成的寡核苷酸¡       ¡ 能與模板特異地結(jié)合        引物決

6、定產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度¡        引物設(shè)計(jì)時(shí)必須遵循一些原則 ¡  設(shè)計(jì)引物的原則：        二條引物分別位于被擴(kuò)增片段的兩端，與模板正負(fù)鏈序列互補(bǔ)¡        長(zhǎng)度為18 ¡ 25個(gè)核苷酸        二條引物之間避免形成引物二聚體¡        引物的堿基組成應(yīng)平衡¡    &

7、#160;  ¡ 引物退火溫度計(jì)算：Tm=2（A+T）+（C+G）        引物的5端可被修飾（引入酶切位點(diǎn)、引入突變位點(diǎn)、生物素等標(biāo)記）¡What parameters affect the Tm?(Tm is defined as the temp at which half the molecules are single-stranded)3、脫氧核苷三磷酸（dNTP）        ¡ 是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4種脫氧核苷三磷酸的混合物反應(yīng)體系

8、中各種核苷酸的濃度必須一致濃度過高雖能加快反應(yīng)速度，但非特異性擴(kuò)增也隨之增加dNTP濃度：20 mol/L,濃度升高增加非特異性擴(kuò)增m 2004、DNA聚合酶        從一種生活在熱泉（8090）中的水棲噬熱菌Thermus¡ aquaticus, Taq）中提取，有很高的耐熱穩(wěn)定性Taq 酶的作用:   模板指導(dǎo)下，以dNTP為原料，在引物3-OH末端加上脫氧單核苷酸，形成3, 5 -磷酸二酯鍵，使DNA鏈沿53方向延伸，催化DNA合成。   最適酶量：1-2.5U （酶量過多，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增）

9、        Taq DNA聚合酶復(fù)制的保真性：¡        Taq¡ DNA聚合酶無3 5外切酶活性，因而無校正功能，在復(fù)制新鏈的過程中會(huì)發(fā)生堿基錯(cuò)配。        Taq¡ DNA聚合酶在每次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為1/30000，堿基替換率為1/8000，故擴(kuò)增的片段越長(zhǎng)，錯(cuò)配的機(jī)率越高。        耐熱的¡ DNA多聚酶：       

10、Pwo DNA polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA¡ polymerase具有較高的熱穩(wěn)定性，較高的保真性，降低堿基錯(cuò)配率2 10倍。5、鎂離子濃度       ¡ 鎂離子濃度是一個(gè)至為關(guān)鍵的因素，對(duì)于反應(yīng)    系統(tǒng)本身、穩(wěn)定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影響   雖然Taq 酶的活性只與游離的Mg2+濃度有關(guān)，    但PCR反應(yīng)體系中dNTP、引物、模板DNA及    鰲合劑的存在均可與Mg2+結(jié)合而降低游

11、離    Mg2+的濃度從而影響酶的活性。   當(dāng)dNTP濃度為200 mol/L時(shí)，MgCl2的濃度為1.5mmol/L較宜。m6、其它反應(yīng)因素         pH：調(diào)節(jié)至酶反應(yīng)所需的最適pH（¡ pH =7.2左右）        鹽：合適的鹽濃度有利于穩(wěn)定雜交體，有利于引物與模板雜交基質(zhì)：BSA、gelatin¡ 、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明膠等基質(zhì)可以保護(hù)Taq 酶的活性）（二）PCR的反應(yīng)條件    

12、60;  ¡ 反應(yīng)溫度（變性、退火、延伸）        反應(yīng)時(shí)間（變性、退火、延伸）¡        循環(huán)次數(shù)（PCR效率及產(chǎn)物量）¡1、溫度      變性溫度：94 97      退火溫度：低于引物Tm 5 左右               溫度過高：降低擴(kuò)增效率   &

13、#160;           溫度過低：增加非特異性擴(kuò)增     延伸溫度：72 ，此時(shí)Taq酶具有較高的                酶促活性2、時(shí)間 第一次變性應(yīng)給予足夠時(shí)間（5 7分鐘）  每一個(gè)步驟所需時(shí)間取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，一般為30秒 1分鐘，時(shí)間過長(zhǎng)易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增3、循環(huán)次數(shù)        ¡

14、重復(fù)次數(shù)一般設(shè)為2535個(gè)循環(huán)        擴(kuò)增反應(yīng)的平臺(tái)效應(yīng)：¡    理論上，PCR反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)性增長(zhǎng)，但這種增長(zhǎng)形式在擴(kuò)增25-25個(gè)循環(huán)以后便放慢直至停止，達(dá)到反應(yīng)平臺(tái)，此時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長(zhǎng) ¡       平臺(tái)出現(xiàn)得遲早與模板的初始量有關(guān)，模板初始量越多，平臺(tái)出現(xiàn)得越早。        平臺(tái)效應(yīng)產(chǎn)生的因素：¡   引物二聚體的產(chǎn)生、反應(yīng)產(chǎn)物、各組分的消耗和變性、引物和

15、已擴(kuò)增的DNA片段間的競(jìng)爭(zhēng)等三、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制（一）實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置：       試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)         標(biāo)本制備區(qū)         擴(kuò)增反應(yīng)區(qū)         產(chǎn)物分析區(qū) PCR技術(shù)的質(zhì)量保證：       基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的全過程的質(zhì)量保證       室內(nèi)質(zhì)量

16、控制和室間質(zhì)量評(píng)價(jià) PCR實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的污染源及防污染措施         防污染體系：¡       ¡ 正確設(shè)置實(shí)驗(yàn)室、嚴(yán)格規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作、完整有效的去污染措施、人員培訓(xùn)、試劑質(zhì)量反應(yīng)體系中以dUTP取代dTTP，再加入尿嘧啶糖苷酶（UNG）即可破壞以往的擴(kuò)增產(chǎn)物（二）PCR技術(shù)的質(zhì)量保證   分析前因素：標(biāo)本采集、運(yùn)送、穩(wěn)定化處理、貯存   分析中因素：核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增反應(yīng)、設(shè)置   對(duì)照系統(tǒng)（包括陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、內(nèi)對(duì)照等）

17、   分析后因素：報(bào)告形式、反饋的信息等第二節(jié) 以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)        逆轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription PCR,¡ RT-PCR)        定量PCR (quantitative PCR )¡        多重PCR (multiplex PCR)¡         免疫PCR¡   

18、;     差異顯示PCR (differential display PCR, DD-PCR)¡ ¡       PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變        原位PCR (in situ PCR)¡ 一、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）       ¡ 以細(xì)胞內(nèi)總RNA或mRNA為材料進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)。        主要用于克隆¡ cDNA、合成cDNA探針，檢測(cè)RNA病毒、

19、分析基因表達(dá)等逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA方式：       ¡ 以隨機(jī)進(jìn)行的PCR擴(kuò)增所需的下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物以oligo(dT)作為引物， mRNA3末端polyA尾與之互補(bǔ)以人工合成的隨機(jī)序列六核苷酸混合物作為引物，進(jìn)行擴(kuò)增二、定量PCR       ¡ 對(duì)DNA或RNA樣本的靶序列進(jìn)行定量分析。       ¡        主要用于基因表達(dá)的分析、病原體核酸的檢測(cè)等¡ 在定量PCR反應(yīng)體

20、系中，除了常規(guī)PCR反應(yīng)所需的材料和試劑外，還必須引入內(nèi)參照系統(tǒng)。       ¡ -肌球蛋白基因b內(nèi)參照系統(tǒng)一般選用與待測(cè)序列結(jié)構(gòu)無關(guān)的基因常用的內(nèi)參照基因是（PCR的參照系統(tǒng)）  相對(duì)定量PCR設(shè)計(jì)相對(duì)定量PCR實(shí)驗(yàn)方案時(shí)須注意： ¡       預(yù)先確定最佳模板量和PCR循環(huán)數(shù)，使所       采用的各反應(yīng)參數(shù)在擴(kuò)增指數(shù)范圍內(nèi)，避       免平臺(tái)效應(yīng)。   

21、1;     “管家基因”與靶基因同管擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物       的長(zhǎng)度應(yīng)有所不同，以保證電泳能將兩者       分離開。        熒光定量PCR（fluorescence quantitative¡ PCR,FQ-PCR），又稱實(shí)時(shí)PCR，是目前較精確的進(jìn)行定量檢測(cè)PCR的方法       ¡ FQ-PCR通過熒光信號(hào)對(duì)PCR過程中產(chǎn)物量進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，精確計(jì)算出PCR的初始模板量Reve

22、rse transcription followed by Polymerase Chain Reaction        Considered to be the most sensitive method¡ for the detection and quantification of gene expression levels.        Used¡ as a follow-up when a particular gene is suggested in micro-array

23、studies. ¡       Potential problems with sensitivity, specificity and reproducibility.熒光信號(hào)的檢測(cè)方法：        1、DNA結(jié)合染料技術(shù)¡       ¡ 2、水解探針技術(shù)（TaqMan probe）技術(shù)        3、雜交探針技術(shù)¡        

24、 CEA§ 基因在消化系統(tǒng)上皮腺癌，     尤其是直結(jié)腸癌和胃癌中高表達(dá)，      因此在腫瘤細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到其轉(zhuǎn)     錄本，而在正常成人體內(nèi)極少表    達(dá)。          在腫瘤發(fā)生血道轉(zhuǎn)移時(shí)，外周血§     中有少量腫瘤細(xì)胞殘留。用靈敏、    特異的技術(shù)檢測(cè)到這些腫瘤細(xì)胞    中CEA基因的轉(zhuǎn)錄本，是發(fā)現(xiàn)腫   &#

25、160; 瘤早期轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。三、多重PCR          在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增一份DNA樣本中多個(gè)不同序列的靶片段。四、免疫PCR       ¡ 將PCR產(chǎn)物用ELISA方法加以檢測(cè)的技術(shù)。在對(duì)目的基因擴(kuò)增時(shí)，dNTP中同時(shí)混有用生物素標(biāo)記的Bio-16-dUTP，使擴(kuò)增產(chǎn)物帶有生物素標(biāo)記。若該產(chǎn)物能與突變點(diǎn)特異的寡核苷酸探針（3端地高辛11-DIG-ddUTP標(biāo)記）雜交，則該產(chǎn)物便帶有地高辛標(biāo)記信號(hào)，可利用與抗地高辛抗體共價(jià)結(jié)合的酶標(biāo)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行顯色反應(yīng)，從而

26、判斷突變的存在。（一）寡核苷酸探針檢測(cè)系統(tǒng)（二）RNA探針-抗體捕獲系統(tǒng)五、差異顯示PCR（differential display PCR,DD-PCR）        一種以逆轉(zhuǎn)錄PCR為基礎(chǔ)的研究基因表達(dá)差異的技術(shù)。¡       ¡ DD-PCR主要用于腫瘤和多種疾病的分子遺傳學(xué)研究，是目前篩選基因表達(dá)差異最有效的方法。六、PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變       ¡ （一）引入點(diǎn)突變        （二）引

27、入大片段缺失¡第三節(jié)  PCR產(chǎn)物的檢測(cè)       ¡ PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）         等位基因特異性寡核苷酸¡   （allele specific oligonucleotide, ASO）        單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation  ¡     polym

28、orphism, SSCP）         變性梯度凝膠電泳（DGGE）¡         融點(diǎn)曲線分析（melting¡ curve analysis）        PCR產(chǎn)物的序列分析¡ 一、PCR-RFLP            利用正常序列或突變序列是否處于限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)而設(shè)計(jì)。若點(diǎn)突變處于某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)內(nèi)，可在突變點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，使PCR產(chǎn)物含有該突變序

29、列。用相應(yīng)的內(nèi)切酶對(duì)正常產(chǎn)物和突變產(chǎn)物進(jìn)行水解并作電泳分離，可根據(jù)水解片段的大小和電泳位置區(qū)分二者。Results of Southern BlotPCR-SSCP單鏈DNA分子具有特定的二級(jí)空間構(gòu)象，取決于該分子本身的堿基組成。突變DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后產(chǎn)生與正常DNA空間構(gòu)象不同的兩條單鏈在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中時(shí)，不同構(gòu)象的單鏈片段具有不同的電泳遷移率，從而能區(qū)別正常與突變的DNA      不同順序              不同構(gòu)象

30、60;             不同電泳行為熔點(diǎn)曲線分析(melting curve analysis）        DNA片段中突變堿基與正常堿基不能配對(duì)而形成異源雙鏈，所產(chǎn)生的Tm較完全配對(duì)的同源雙鏈的Tm低，在儀器上顯示出不同的曲線從而將突變序列檢測(cè)出來。所需儀器如高效液相色譜儀(DHPLC)、WAVE DNA片段分析系統(tǒng)、LightCycler等。PCR產(chǎn)物的序列分析（DNA sequencing）    

31、      主要見于分子克隆時(shí)對(duì)于目的基因擴(kuò)   增片段的序列鑒定以及對(duì)致病基因檢測(cè)時(shí)   分析擴(kuò)增片段中點(diǎn)突變的位置和性質(zhì)。          可將產(chǎn)物純化后作為模板直接測(cè)序，   也可將PCR產(chǎn)物克隆入載體后再測(cè)序，后   者測(cè)序的效果更好 ，常用T-A克隆。Sanger測(cè)序技術(shù)：  以待測(cè)序列的單鏈DNA作為模板，加入一個(gè)引物和dNTP作為底物，并加入一定比例的2，3-ddNTP，在DNA聚合酶的作用

32、過程中，正常dNTP的摻入使鏈延伸，若ddNTP的摻入則使鏈終止，這樣就可以得到一系列長(zhǎng)度不同的以四種ddNTP結(jié)尾的DNA片段，經(jīng)電泳后可直接讀出堿基序列。第四節(jié) PCR技術(shù)在分子診斷中的應(yīng)用PCR技術(shù)在分子診斷中的應(yīng)用        感染性疾病中病原微生物核酸的檢測(cè)¡       ¡ 單基因遺傳性疾病的基因診斷        多基因病相關(guān)基因的檢測(cè)¡        腫瘤相關(guān)基因的檢測(cè)¡

33、0;      ¡ 移植配型和法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用一、感染性疾病的分子診斷         定性或定量檢測(cè)致病微生物的核酸，¡   已經(jīng)用于病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染   的診斷。         動(dòng)態(tài)、定量地檢測(cè)病原體核酸能對(duì)¡   療效判斷和病情預(yù)后提供客觀的依   據(jù)。SARS相關(guān)冠狀病毒的分子診斷     &#

34、161;    2003年4月，香港研究者Peiris等報(bào)     告了50 例SARS病人的臨床表現(xiàn)和    病毒學(xué)研究結(jié)果證明，新冠狀病毒   可能是SARS的致病原因。  （Lancet, 2003, 361: 9365)     ¡    其它實(shí)驗(yàn)室陸續(xù)得出相同結(jié)論。         2003年4月，德國(guó)漢堡Bernhard-&#

35、161;     Nocht熱帶醫(yī)學(xué)研究所學(xué)者 Drosten    等用隨機(jī)擴(kuò)增技術(shù)，獲得長(zhǎng)度為    300 bp的核苷酸序列。         根據(jù)這段序列，建立了檢測(cè)新冠狀¡     病毒的常規(guī)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)。（.org on April 10, 2003）引物和探針     ¡    BNIoutS2-BNIoutAs     &#

36、160;       BNI-1片段，189 bp    BNIinS-BNIinAs             BNI-1片段的內(nèi)套片段，108bp         BNITMSARS1BNITMSARAs2¡    BNITMSARP(熒光素標(biāo)記的探針）             產(chǎn)物長(zhǎng)度

37、：77 bp         檢測(cè)標(biāo)本¡    痰液、咽拭子、鼻拭子、支氣管肺    泡灌洗液 、血漿、糞便。         檢測(cè)方法¡      1. 逆轉(zhuǎn)錄-巢式PCR      2. 逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)PCR結(jié) 果         病人和接觸者（具臨床癥狀）的痰  &

38、#160;¡    液中用外套引物檢測(cè)到了病毒。         病人的其它標(biāo)本用套式PCR檢測(cè)到¡    病毒。     ¡    有報(bào)道顯示，在可能SARS病人    中， 病毒的檢出率為100%。         在疑似SARS病人中的檢出率為¡    23%。    &#

39、160;    所有健康接觸者中未檢測(cè)到病毒。¡         檢測(cè)病毒的3種方¡ 法（血清學(xué)檢測(cè)、    病毒分離、PCR技術(shù)）中，PCR技    術(shù)的檢出率最高。討 論     ¡    疾病的早期即可獲得陽性結(jié)果（早于血     清轉(zhuǎn)換期）。         特異性較高（

40、SARS患者中的陽性率約為¡     80%，對(duì)照中的陰性率約98%100%）。         現(xiàn)有的方法敏感性較差，陰性結(jié)果不能¡    排除病毒感染。討 論        痰液中病毒RNA濃度極高，說明病毒從呼吸道¡    排放是主要傳播途徑。       ¡ 血清中檢測(cè)到極低濃度的病毒RNA，提示病毒    復(fù)

41、制不僅發(fā)生于呼吸道。        病人恢復(fù)晚期的糞便中存在病毒RNA，說明糞¡    便可能也是一種傳播途徑。        鼻、咽拭子中含有的病毒RNA顯著少于痰液，¡    提示不適合作為標(biāo)本（有可能漏檢）。SARS相關(guān)冠狀病毒分子診斷中必須注意的問題     ¡    必須在規(guī)范的基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。         

42、應(yīng)采取必要的質(zhì)控規(guī)程，包括陽性對(duì)照¡     和陰性對(duì)照。         ¡  陽性結(jié)果時(shí)必須對(duì)原始樣本重復(fù)檢驗(yàn)或      者擴(kuò)增基因的另一個(gè)片段或在另一個(gè)實(shí)      驗(yàn)室對(duì)同一樣本進(jìn)行檢測(cè)。 二、單基因疾病的診斷           單基因遺傳病是由于某一基因結(jié)     構(gòu)的變化或由其而引起

43、的基因表達(dá)異    常所導(dǎo)致的疾病，因此用分子生物學(xué)    技術(shù)檢測(cè)致病基因的遺傳缺陷是診斷    這些疾病最根本的手段。1. 血友病的分子診斷        X染色體連鎖隱性遺傳¡         F基因和F基因發(fā)生突變           血漿凝¡   血因子和的合成量和（或）質(zhì)的異常      

44、;     患者反復(fù)自發(fā)性出血2. DMD的分子診斷       ¡ X染色體連鎖隱性遺傳性肌肉疾病，發(fā)病   率為1/3 500個(gè)男孩        DMD基因位于Xp21.2-21.3，全長(zhǎng)2¡ 500Kb    DMD基因的突變導(dǎo)致dystrophin缺陷        檢測(cè)DMD基因的技術(shù)：¡    Southern印跡、多重PCRDMD的

45、基因檢測(cè)         迪謝內(nèi)肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD) 是一種高發(fā)病§     率、高致殘、高致死的X染色體連鎖的遺      傳性疾病，在3500個(gè)活產(chǎn)男嬰中即有一     個(gè)患者。     §    致病基因DMD的全長(zhǎng)為250kb，有79個(gè)外    顯子。       

46、60; DMD 的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，§    約占60%70%。DMD基因外顯子缺失的檢測(cè)LGMD2B的基因定位                和遺傳缺陷的研究 ¡       肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良(limb-girdle muscular dystrophy, LGMD）是一組累及肩胛、骨盆帶    和四肢近端肌肉的遺傳性疾病。       

47、; LGMD1：顯性遺傳（1A、1B、1C）¡       ¡ LGMD2：隱性遺傳（2A2H）        不同類型的LGMD不僅在遺傳學(xué)上具高度異質(zhì)¡    性（不同致病基因，不同基因突變），臨床表    現(xiàn)亦十分不一致，臨床診斷和分類十分困難。 ENMC的診斷標(biāo)準(zhǔn)       ¡ LGMD的診斷必須符合以下2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)之一：  1. 致病基因與已知的某一LGMD基因位點(diǎn)&#

48、160;     連鎖  2. 檢測(cè)到致病基因編碼產(chǎn)物的缺陷家系資料致病基因的定位        用迄今已報(bào)道的 LGMD2A2H 8個(gè)基因¡   所在位點(diǎn)附近共14個(gè)STR標(biāo)記對(duì)家系成   員DNA樣本進(jìn)行連鎖分析，以期找出與   該家系連鎖的致病基因。致病基因定位結(jié)果        連鎖分析顯示此家系在D2S377位點(diǎn)的Lod¡     Score值為1.85，在

49、D2S286 位點(diǎn)的Lod score 值    為0.51，其他各位點(diǎn)的值均為負(fù)數(shù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果    支持D2S337位點(diǎn)和 D2S286 位點(diǎn)與 LGMD2B     致病基因連鎖。其他各位點(diǎn)與致病基因不連    鎖。    Lod score值< 1：不支持連鎖    Lod score值>1：支持連鎖    Lod score值>3：強(qiáng)烈支持連鎖致病基因編碼產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果        先證者L

50、GMD2B基因的編碼蛋白dysferlin¡ 條帶密度與正常對(duì)照相比有明顯下降，其余各蛋白條帶與正常對(duì)照相比無明顯改變。DYSF基因突變的檢測(cè)     ¡    在DYSF基因的突變熱點(diǎn)區(qū)篩查，以期     找出導(dǎo)致 dysferlin缺陷的基因突變。          逆轉(zhuǎn)錄PCR¡ ¡         產(chǎn)物克隆至載體后作序列分析DYS

51、F基因檢測(cè)結(jié)果     ¡    cDNA第6425/6426位(52號(hào)外顯子)缺失     1個(gè)G堿基 (6425/6426 del G)。     ¡    第2019位密碼子agg       agc，下游讀碼    發(fā)生移碼突變，使第2035位密碼子 atg             

52、0;        tga (53號(hào)外顯子，M 2035 X)。         終止密碼的提前產(chǎn)生是 dysferlin缺陷的¡    原因。         是尚未報(bào)道的一個(gè)新突變，也是中國(guó)第¡    一例DYSF基因突變。     ¡    根據(jù)患者病史、體征和分子診斷實(shí)驗(yàn)結(jié)  &#

53、160; 果，這是一個(gè)由于 DYSF 基因突變?cè)斐?#160;   相應(yīng)編碼產(chǎn)物缺陷而導(dǎo)致的疾病。三、多基因病的分子診斷         多基因病具一定的遺傳因素，家庭§   發(fā)病率高于人群發(fā)病率，但是疾病   的產(chǎn)生都以一定的環(huán)境條件為誘因，   遺傳因素在其中所起作用程度各異。     §    多基因病中的遺傳因素是若干個(gè)     易感基因微

54、小作用的累加，某一   易感基因結(jié)構(gòu)的變化不足以導(dǎo)致   疾病的產(chǎn)生。          人類基因組多態(tài)性是多基因病基因§    診斷的基礎(chǔ)，易感基因多態(tài)性的檢    測(cè)能幫助我們理解多基因病發(fā)生的    機(jī)制，有助于對(duì)疾病的診斷和分類?；蚨鄳B(tài)性與鹽敏感性高血壓-內(nèi)收素     a            

55、    血管緊張素轉(zhuǎn)換酶  上皮鈉通道                血管緊張素原  心鈉素                2腎上腺素能受體b           SA                     

56、            G蛋白亞單位3ACE基因多態(tài)性與高血壓靶器官損傷疾病        研究報(bào)告數(shù)      I D                   D D冠心病              30

57、0;                + 11 %             + 32 %  心肌梗死          15                 + 12 %     &

58、#160;       + 39 %腦卒中                5                 + 22 %             + 94 %高血壓腎病       19   

59、60;            + 10 %             + 53 %糖尿病腎病       11                + 40 %             + 56 %    

60、       * 與II型相比，DD型和ID型發(fā)生上述疾病的危險(xiǎn)性增高程度         (145個(gè)ACE基因I/D多態(tài)性研究49959例的薈萃分析）基因多態(tài)性與高血壓靶器官損傷腦卒中    載脂蛋白E    -纖維蛋白原b    血管緊張素原    血管緊張素II的1型受體    內(nèi)皮型一氧化氮合酶    心鈉素冠心病    

61、0;副氧酶     凝血因子V     凝血因子VII     載脂蛋白B基因多態(tài)性檢測(cè)與個(gè)體化治療        人類基因組計(jì)劃已經(jīng)完成，功能基因組¡   計(jì)劃正在實(shí)施。 ¡       有朝一日，臨床醫(yī)師能根據(jù)病人易感基   因的多態(tài)性設(shè)計(jì)有效的、個(gè)體化的治療    方案，以達(dá)到最佳的治療效果。 TOHP試驗(yàn)中AG

62、T基因研究目的：觀察AGT基因分型與限鈉鹽攝入及減輕體重后的             血壓變化和高血壓發(fā)病率間的關(guān)系對(duì)象：1509例基因分析：AGT基因G-A多態(tài)性結(jié)果：            三年后高血壓發(fā)生率（%）                        &#

63、160;        對(duì)照組     限鹽組     減輕體重組       AA型        45              28              &#

64、160; 25        GG型        32             41                32                    

65、0;                              Hunt SC,et al: Hypertension, 1998;32:393-401基因多態(tài)性分析              指導(dǎo)抗高血壓藥物的選擇   藥物種類      

66、;        基因        利尿劑                    -內(nèi)收素a            ACE抑制劑               ACE、AT1-受