細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)課件

1、細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)醫(yī)學(xué)院中心(zhngxn)實(shí)驗(yàn)室谷景義第一頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)主要(zhyo)內(nèi)容： 1、細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí) 2、培養(yǎng)細(xì)胞(xbo)生長的條件 3、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)第二頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 把取得的組織用機(jī)械或消化的方法分散成單個(gè)細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，在體外適宜條件下，使細(xì)胞生長繁殖，并保留其一定(ydng)的結(jié)構(gòu)和功能特性。第三頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 貼附型、懸浮(xunf)型第四頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 體外培養(yǎng)的細(xì)胞(xbo)既保持了一定的體內(nèi)細(xì)胞(xbo)的基本特性，但也具有本身的一

2、些特點(diǎn)。 貼附-伸展 接觸抑制-增殖的密度抑制第五頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)第六頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)接觸抑制 當(dāng)一個(gè)細(xì)胞被其他細(xì)胞圍繞導(dǎo)致無處可去而保持接觸時(shí)，細(xì)胞不再移動(dòng)，在接觸區(qū)域的細(xì)胞膜活動(dòng)將停止(tngzh)。 因此，一般正常細(xì)胞并不相互重疊于其上生長。第七頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)細(xì)胞增殖密度(md)抑制 當(dāng)細(xì)胞生長匯合形成單層時(shí)，細(xì)胞變得比較擁擠，這時(shí)其分裂停止，這種細(xì)胞可在靜止(jngzh)狀態(tài)下維持存活一段時(shí)間，但不會(huì)繼續(xù)分裂生殖。轉(zhuǎn)化細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞不同，他們的接觸抑制和增殖密度抑制常常降低，因而可以增殖至較高的終末

3、細(xì)胞密度。第八頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 單個(gè)細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞(xbo)增殖：增殖：第九頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 高等高等(godng)生物體，細(xì)胞周期時(shí)間的長短變生物體，細(xì)胞周期時(shí)間的長短變化主要集中在化主要集中在G1期，期，S，G2和和M期基本保期基本保持穩(wěn)定。持穩(wěn)定。 Hela 8-16h 5-9h 2-8h 20-28h第十頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)一群細(xì)胞的增殖(zngzh)：細(xì)胞生長曲線 接種后，每天進(jìn)行檢測計(jì)數(shù)，以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，接種后，每天進(jìn)行檢測計(jì)數(shù)，以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制成曲線。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制成曲線。測定細(xì)胞絕對

4、生長數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重測定細(xì)胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。要指標(biāo)，是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。 飽和密度(md)：在特定條件下，培養(yǎng)器皿內(nèi)能達(dá)在特定條件下，培養(yǎng)器皿內(nèi)能達(dá)到的最高細(xì)胞數(shù)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到飽和密度后細(xì)胞群體停止到的最高細(xì)胞數(shù)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到飽和密度后細(xì)胞群體停止繁殖。繁殖。第十一頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)潛伏期/滯留期指數(shù)增長期平臺(tái)(pngti)期/停滯期退化或死亡第十二頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)從原代細(xì)胞或細(xì)從原代細(xì)胞或細(xì)胞系中獲得具有胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物特殊性質(zhì)或標(biāo)志

5、物的細(xì)胞。的細(xì)胞。第十三頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 有限細(xì)胞系：如果不能繼如果不能繼續(xù)傳代或傳代有限，可稱為續(xù)傳代或傳代有限，可稱為有限細(xì)胞系。有限細(xì)胞系。 連續(xù)細(xì)胞系：能夠連續(xù)能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞叫做傳代的細(xì)胞叫做“連續(xù)細(xì)連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系?？膳喟祷驘o限細(xì)胞系?？膳囵B(yǎng)養(yǎng)50代以上并無限培養(yǎng)下代以上并無限培養(yǎng)下去。去。 大多數(shù)的二倍體細(xì)胞為有大多數(shù)的二倍體細(xì)胞為有限細(xì)胞系。無限細(xì)胞系大限細(xì)胞系。無限細(xì)胞系大多已發(fā)生多已發(fā)生(fshng)變異。變異。第十四頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)從機(jī)體取得組織材料，在體外培養(yǎng)從機(jī)體取得組織材料，在體外培養(yǎng)生長，到第一次傳代生長，

6、到第一次傳代(chun di)前。前。 傳代細(xì)胞：當(dāng)原代細(xì)胞持續(xù)生長繁殖一段時(shí)間，達(dá)當(dāng)原代細(xì)胞持續(xù)生長繁殖一段時(shí)間，達(dá)到一定的細(xì)胞密度后傳代的細(xì)胞。到一定的細(xì)胞密度后傳代的細(xì)胞。第十五頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)方法： 將培養(yǎng)(piyng)對象直接接種于培養(yǎng)(piyng)瓶內(nèi)，再放入培養(yǎng)(piyng)箱進(jìn)行培養(yǎng)(piyng)。優(yōu)點(diǎn)：1、可以避免培養(yǎng)瓶表面粗糙等原因?qū)ε囵B(yǎng)物的影響。2、可以方便地進(jìn)行顯微鏡觀察、染色(rns)等操作，以及永久保存。3、增加了培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面積。第十六頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)方法：將培養(yǎng)(piyng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)(piyng)板的孔內(nèi)，然

7、后在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。應(yīng)培養(yǎng)量較小也稱為微量培養(yǎng)。第十七頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)也稱植塊懸滴培養(yǎng)法，是最早建立的體外培養(yǎng)技術(shù)基本要點(diǎn)(yodin)：將組織或器官植塊接種在一張蓋玻片上，滴上一滴培養(yǎng)液，然后翻轉(zhuǎn)蓋玻片使植塊及營養(yǎng)液懸掛在蓋玻片下，再放置于一凹形載片之上，最后用溶蠟密封后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第十八頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 1907 1907 年年 - -Harrison用細(xì)胞培養(yǎng)解決一個(gè)難題用細(xì)胞培養(yǎng)解決一個(gè)難題 蓋玻片覆蓋蓋玻片覆蓋(fgi)凹型載玻片懸滴培養(yǎng)法凹型載玻片懸滴培養(yǎng)法第十九頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)懸滴培養(yǎng)法基本(jbn

8、)步驟1、在蓋玻片上滴加胚胎(piti)提取液、血漿和植塊，混勻。培養(yǎng)基凝固后將植塊包埋。2、在凹載片周圍(zhuwi)涂凡士林。將凹載片向下壓向蓋玻片3、將凹載片反轉(zhuǎn)，蓋玻片周圍涂溶蠟。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)第二十頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 1910 至至 1923年年 Carrel 和早期和早期(zoq)的的組織培養(yǎng)組織培養(yǎng) 卡氏瓶培養(yǎng)法第二十一頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 1943年年Earle、Dulbecco等創(chuàng)建單層細(xì)胞等創(chuàng)建單層細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)(piyng)法，首建長期傳代的法，首建長期傳代的L-細(xì)胞系。細(xì)胞系。 1951年年Gey首建人腫瘤細(xì)胞首建人腫瘤細(xì)胞Hel

9、a細(xì)胞細(xì)胞系。系。 從從50年代末開始，組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用進(jìn)入年代末開始，組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用進(jìn)入了一個(gè)繁盛的階段，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)了一個(gè)繁盛的階段，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究各個(gè)領(lǐng)域。學(xué)研究各個(gè)領(lǐng)域。第二十二頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)無血清無血清(xuq(xuqng)ng)培養(yǎng)培養(yǎng)無血清培養(yǎng)基:是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時(shí)間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分?；境煞譃榛A(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。觀察一種生長因子對某種細(xì)胞的作用，這時(shí)需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種( zhn)生長因子；又如需要測定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中

10、分泌某種物質(zhì)（抗體、生長因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。往往針對性很強(qiáng)，價(jià)格偏高。第二十三頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(jsh)(jsh) 將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體(zit)與各種不同種與各種不同種類的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)類的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng), 使細(xì)胞能夠在載體使細(xì)胞能夠在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長, 構(gòu)成三構(gòu)成三維的細(xì)胞維的細(xì)胞-載體復(fù)合物。載體復(fù)合物。第二十四頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)普通的細(xì)胞培養(yǎng)由于細(xì)胞在體外改變普通的細(xì)胞培養(yǎng)由

11、于細(xì)胞在體外改變(gibin)的環(huán)境下增生逐漸喪失了的環(huán)境下增生逐漸喪失了原有的性狀，往往和體內(nèi)情況不相符，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完全在體內(nèi)進(jìn)行原有的性狀，往往和體內(nèi)情況不相符，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完全在體內(nèi)進(jìn)行, 但由于體內(nèi)的多種因素制約以及體內(nèi)和外界環(huán)境相互影響而變得復(fù)雜化但由于體內(nèi)的多種因素制約以及體內(nèi)和外界環(huán)境相互影響而變得復(fù)雜化, 難以研究單一過程，且難以研究中間過程。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)難以研究單一過程，且難以研究中間過程。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是介于單層細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之間的一種技術(shù)，既能最大程是介于單層細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之間的一種技術(shù)，既能最大程度的模擬體內(nèi)環(huán)境，又能展現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性度的模擬

12、體內(nèi)環(huán)境，又能展現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢。的優(yōu)勢。 應(yīng)用：應(yīng)用：軟骨和骨組織軟骨和骨組織（軟骨細(xì)胞和干細(xì)胞，再生損傷的軟骨、骨）循環(huán)系統(tǒng)和心臟循環(huán)系統(tǒng)和心臟（有目的地改變血管形成）第二十五頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 目前常用目前常用(chn yn)的三維培養(yǎng)模型：的三維培養(yǎng)模型： 基質(zhì)覆蓋培養(yǎng) 旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng) 微載體培養(yǎng) 預(yù)置支架培養(yǎng) 旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 自發(fā)性細(xì)胞聚集第二十六頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：1）研究的條件可以人為控制2）研究的樣本均一3）研究內(nèi)容方便觀察、檢測、記錄4）研究的費(fèi)用相對(xingdu)于經(jīng)濟(jì)缺點(diǎn)：體外培養(yǎng)的細(xì)胞不能完全等同于體

13、內(nèi)的細(xì)胞。第二十七頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 病毒學(xué)：病毒鑒定，病毒抗原作用，疫苗生產(chǎn) 免疫學(xué)：雜交瘤-單克隆抗體 遺傳學(xué)：染色體分析 腫瘤學(xué)：篩選重要的抗腫瘤藥物 分化及發(fā)育：刺激使細(xì)胞群體發(fā)生改變 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)：藥效測試 臨床醫(yī)學(xué)及生物技術(shù)：干細(xì)胞培養(yǎng)定向(dn xin)誘導(dǎo)分化后移植；組織工程軟骨損傷修復(fù)；試管嬰兒第二十八頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)營養(yǎng)(yngyng)需要環(huán) 境 要 求無毒及無污染第二十九頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) （1）氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)離子）氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)離子(lz) （2）促生長因子等）促生長因

14、子等 完全培養(yǎng)基的組成：完全培養(yǎng)基的組成： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80一一95 血清血清 5一一20 碳酸氫鈉碳酸氫鈉 2.0 g/L 青、鏈霉素青、鏈霉素 各各100單位毫升單位毫升第三十頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)基礎(chǔ)(jch)培養(yǎng)基的選擇參考：參考： (1(1）建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基。可以查閱）建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I(xiàn)，或在購買細(xì)胞株時(shí)咨詢。參考文獻(xiàn)，或在購買細(xì)胞株時(shí)咨詢。 (2) (2) 其它實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。其它實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適

15、合多種細(xì)胞。 (3) (3) 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察(gunch)(gunch)其生長狀態(tài)，可以用生其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。這是最客觀的方法，但比較繁瑣。常用的培養(yǎng)基種類常用的培養(yǎng)基種類RPMI-1640RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型）、（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-F12 DMEM-F12 等等第三十一頁，共六十八頁。細(xì)胞培

16、養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)血清(xuqng) 熱滅活：熱滅活：56, 30 56, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清分鐘加熱已完全解凍的血清( (目前少用）目前少用） 熱滅活目的：滅活血清中的補(bǔ)體成分。如果不做熱滅活目的：滅活血清中的補(bǔ)體成分。如果不做細(xì)胞因子和免疫相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，建議血清不要滅活。細(xì)胞因子和免疫相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，建議血清不要滅活。 熱處理造成血清沉淀物增多，影響血清質(zhì)量。熱處理造成血清沉淀物增多，影響血清質(zhì)量。甚至嚴(yán)重影響細(xì)胞生長速度，且細(xì)胞貼壁率降低。甚至嚴(yán)重影響細(xì)胞生長速度，且細(xì)胞貼壁率降低。 血清中的沉淀物血清中的沉淀物 絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物絮狀

17、物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會(huì)影響血清本身的質(zhì)量。可用離心不會(huì)影響血清本身的質(zhì)量。可用離心3000rpm, 5 3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用分鐘去除，也可不用(byng)(byng)處理處理 顯微鏡下顯微鏡下“小黑點(diǎn)小黑點(diǎn)”：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著增多。：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點(diǎn)小黑點(diǎn)”，常誤認(rèn)為血清受污染。一，常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下，此小黑點(diǎn)不會(huì)影響細(xì)胞生長，但如果懷疑血清質(zhì)量，則般情況下，此小黑點(diǎn)不會(huì)影響細(xì)胞生長，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應(yīng)立即

18、停止使用，更換另一批號的血清應(yīng)立即停止使用，更換另一批號的血清第三十二頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 血清血清(xuqng)(xuqng)質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。 常用血清：常用血清： 胎牛血清、小牛血清胎牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，以、兔血清、馬血清等，以胎牛血清質(zhì)量最好。胎牛血清質(zhì)量最好。 優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)： 透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。病毒污染。第三十三頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 一種一種弱酸弱酸，羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細(xì)胞，羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細(xì)胞(

19、xbo)(xbo)無毒性無毒性 主要作用主要作用: :防止培養(yǎng)基防止培養(yǎng)基pHpH迅速變動(dòng)。迅速變動(dòng)。 在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO25%CO2的環(huán)境，的環(huán)境，CO2CO2氣體迅速逸出，氣體迅速逸出，pHpH迅速升高，若加了迅速升高，若加了HEPESHEPES，此時(shí)可以維持，此時(shí)可以維持pH7.0pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPESHEPESmmol/Lmmol/L使用時(shí)可向使用時(shí)可向100ml100ml培養(yǎng)液中加入培養(yǎng)液中加入2ml 2ml 濃縮液，終濃度為濃縮液，終濃度為20

20、mmol/L 20mmol/L 第三十四頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 抗菌素的使用：抗菌素的使用：在培養(yǎng)液配制在培養(yǎng)液配制(pizh)后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長。在的細(xì)菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。最終使用濃度為每毫升最終使用濃度為每毫升100單位。單位。第三十五頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)RPMI1640干粉培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基10.4g（1包）包）超純水超純水400ml磁力攪拌至完全溶解磁力攪拌至完全溶解加超純水定容至加超純水定容至1000ml在超凈臺(tái)內(nèi)無菌條件下

21、，用滅菌后的并置有在超凈臺(tái)內(nèi)無菌條件下，用滅菌后的并置有0.22m孔徑孔徑(kngjng)濾膜的過濾器除菌，濾膜的過濾器除菌，分裝分裝200ml/瓶，瓶，-20保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆?。用前取一瓶溶解，每用前取一瓶溶解，?00ml培養(yǎng)液加滅活的小牛培養(yǎng)液加滅活的小牛血清至終濃度為血清至終濃度為10%，即加，即加22ml。加青霉素和鏈霉。加青霉素和鏈霉素至終濃度各為素至終濃度各為100U/ml。第三十六頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 分離組織和分散細(xì)胞(xbo) 常用：胰蛋白酶、二乙胺四乙酸二鈉(EDTA) 單獨(dú)或混合使用第三十七頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)： 胰蛋白酶作用于與

22、賴氨酸或精氨酸相連接的肽胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。架，從而使細(xì)胞分離。 胰蛋白酶液濃度胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過一越高，作用越強(qiáng)，但超過一定限度定限度(xind)(xind)會(huì)損傷細(xì)胞。會(huì)損傷細(xì)胞。 胰蛋白酶液消化時(shí)間：胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-102-10分鐘。分鐘。 用含血清培養(yǎng)液終止其對細(xì)胞的消化作用用含血清培養(yǎng)液終止其對細(xì)胞的消化作用 第三十八頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)第三十九頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)第四十頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知

23、識(shí)基本技術(shù)第四十一頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)2、 環(huán)境(hunjng)要求 細(xì)胞培養(yǎng)必須具備細(xì)胞生存并繁殖的生細(xì)胞培養(yǎng)必須具備細(xì)胞生存并繁殖的生理學(xué)能接受限度內(nèi)的物理化學(xué)特性理學(xué)能接受限度內(nèi)的物理化學(xué)特性(txng) （1）溫度）溫度 （2）氣相）氣相 （3） PH第四十二頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)溫度溫度(w(wnd)nd) 體外培養(yǎng)(piyng)的細(xì)胞需要在保持一定恒溫的環(huán)境中才能生長。在達(dá)到最適溫度（37）前，一般細(xì)胞繁殖率因溫度的升高而增加，但是，溫度逐步升高并超過最適溫度時(shí)，繁殖會(huì)被抑制。 當(dāng)溫度在25- 35，細(xì)胞的生長速度很慢，但能夠生存；細(xì)胞在4也能

24、存活數(shù)天；只要溫度不低于0，細(xì)胞都能生存；加了保護(hù)劑還能放到液氮中保存。 當(dāng)高溫時(shí)，在41- 42中培養(yǎng)1h，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，43以上，則多數(shù)細(xì)胞死亡。 高溫比低溫對細(xì)胞的影響更為明顯。第四十三頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)氣相和氣相和PHPH 5% CO2 + 95%空氣混合氣體（O2）。 CO2既是細(xì)胞生長所需，同時(shí)(tngsh)又是細(xì)胞代謝的產(chǎn)物，并與維持培養(yǎng)基的PH有關(guān)。 最適PH 7.2 7.4 低于PH 6.8或高于PH7.6可能對細(xì)胞有害，甚至死亡。酚紅指示劑：黃 6.6 橙 8.0 紅第四十四頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)3、無毒無污染無 毒：無毒是培養(yǎng)細(xì)胞的

25、必需條件。凡與 細(xì)胞直接或間接接觸的東西都必須 是無毒的。若具細(xì)胞毒性(d xn)，細(xì)胞容 易導(dǎo)致死亡。因此，選用器皿和材 料時(shí)必須注意。第四十五頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)無微生物的污染不同細(xì)胞類型的交叉污染細(xì)菌霉菌支原體體外培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏機(jī)體免疫系統(tǒng)，無防御能力，一旦發(fā)生細(xì)菌(xjn)等污染，細(xì)胞最終會(huì)死亡。交叉污染容易使細(xì)胞系失去原有特性。第四十六頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)三、細(xì)胞培養(yǎng)基本(jbn)技術(shù) 1、原代細(xì)胞培養(yǎng) 2、傳代細(xì)胞培養(yǎng) 3、培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況(zhungkung)的觀察 4、細(xì)胞凍存、復(fù)蘇、運(yùn)輸?shù)谒氖唔?，共六十八頁。?xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)

26、在無菌操作中，一定要保持工作區(qū)的無菌清潔在無菌操作中，一定要保持工作區(qū)的無菌清潔 操作前操作前, ,無菌室及無菌操作臺(tái)以紫外燈照射無菌室及無菌操作臺(tái)以紫外燈照射30 30 分鐘分鐘滅菌，以滅菌，以75% 75% 或或70% ethanol 70% ethanol 擦拭無菌操作臺(tái)面，擦拭無菌操作臺(tái)面，并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 10 分鐘分鐘 操作時(shí)操作時(shí)，小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，亦不要在打開勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，亦不要在打開(d (d ki)ki)之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開之容器

27、正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開(d ki)(d ki)后，以后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約4545角取用角取用 操作過程中注意操作過程中注意，有菌意識(shí)，無菌操作！，有菌意識(shí)，無菌操作！第四十八頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)1 1、原代細(xì)胞培養(yǎng)、原代細(xì)胞培養(yǎng) 原理：原理： 將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用膠將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用膠原酶）或組織貼壁法處理，得到單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群，置合原酶）或組織貼壁法處理，得到單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以(dy)生存、生長和繁殖。生存、生長

28、和繁殖。 儀器、材料及試劑：儀器、材料及試劑：CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)瓶、平皿、燒杯、吸管、移液槍、手術(shù)器培養(yǎng)箱，培養(yǎng)瓶、平皿、燒杯、吸管、移液槍、手術(shù)器械、計(jì)數(shù)板、離心機(jī)、水浴箱（械、計(jì)數(shù)板、離心機(jī)、水浴箱（37）1640/DMEM F12培養(yǎng)基（含培養(yǎng)基（含10%血清），血清）， 2%膠原酶膠原酶II，PBS，酒精，酒精第四十九頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)組織組織(z(zzhzh) )消化法消化法 1.準(zhǔn)備：準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化(jnghu)臺(tái)臺(tái)面，紫外線消毒面，紫外線消毒30分鐘。開始工作前先洗手、分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭

29、手至肘部。酒精擦拭手至肘部。 2.處理組織：處理組織：采集的標(biāo)本必須在采集的標(biāo)本必須在4H內(nèi)完成。取出內(nèi)完成。取出6-10cm長臍帶，置于燒杯或平皿中，用長臍帶，置于燒杯或平皿中，用PBS液液漂洗漂洗23次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中置于含有青鏈霉素的混合液中3060分鐘。分鐘。第五十頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 3.剪切：剪切：用手術(shù)剪將組織塊剪成用手術(shù)剪將組織塊剪成23立方毫米大立方毫米大小，然后再用眼科剪把組織剪細(xì)成小，然后再用眼科剪把組織剪細(xì)成1立方毫米的立方毫米的小塊，以便于消化。加入與組織塊總量小塊

30、，以便于消化。加入與組織塊總量1：1的的2%膠原酶膠原酶II，然后一并倒入瓶中，封口。，然后一并倒入瓶中，封口。 4.消化：消化：或用恒溫水浴，或置于或用恒溫水浴，或置于37溫箱消化溫箱消化均可，消化中每隔均可，消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動(dòng)一次，如用電分鐘應(yīng)搖動(dòng)一次，如用電磁恒溫?cái)嚢杵飨?。消化時(shí)間磁恒溫?cái)嚢杵飨?。消化時(shí)間(shjin)依組織依組織塊的大小和組織的硬度而定。塊的大小和組織的硬度而定。 37 空氣搖床空氣搖床100轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/min，1.5-2h第五十一頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 5.分離：分離：待組織已分散待組織已分散(fnsn)成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞

31、，立即終止消化，并倒入至少胞，立即終止消化，并倒入至少5倍體積的倍體積的PBS稀釋消化液，隨即通過稀釋消化液，隨即通過200目的不銹鋼篩，目的不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。濾掉尚未充分消化開的組織塊。2500rmp離離心消化心消化20分鐘，吸出上清，加入分鐘，吸出上清，加入8-10ml PBS，1000rmp離心離心5min，吸出上清，加入適量，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。含有血清的培養(yǎng)液。 6. 計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)：用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密：用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過大，再補(bǔ)加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶度過大，再補(bǔ)加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中。中。 7.換液換液：24-

32、48H后觀察細(xì)胞是否貼壁，如已后觀察細(xì)胞是否貼壁，如已有部分細(xì)胞貼壁，可換液繼續(xù)培養(yǎng)。有部分細(xì)胞貼壁，可換液繼續(xù)培養(yǎng)。第五十二頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)2、傳代(chun di)細(xì)胞培養(yǎng) 傳代前的準(zhǔn)備傳代前的準(zhǔn)備(zhnbi) 1. 酒精，棉球，鑷子，雜物盒，試管酒精，棉球，鑷子，雜物盒，試管，吸管筒，離心管，培養(yǎng)瓶或板，計(jì)，吸管筒，離心管，培養(yǎng)瓶或板，計(jì)時(shí)器，筆時(shí)器，筆 2. 0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶 3. 含血清培養(yǎng)基，含血清培養(yǎng)基，PBS第五十三頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 傳代步驟（貼壁細(xì)胞）：傳代步驟（貼壁細(xì)胞）： 1. 鏡下觀察細(xì)胞生長至融合狀態(tài) 2.

33、吸出舊的培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液或PBS清洗兩次（切記要清洗干凈）。 3. 消化(xiohu)細(xì)胞：最常用的方法是在培養(yǎng)瓶中添加1ml 0.25%含EDTA的胰酶，培養(yǎng)箱中37消化5-15s?？筛鶕?jù)不同的細(xì)胞類型調(diào)整消化時(shí)間及程度。 在電鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞突起回縮，細(xì)胞之間間隙增大，細(xì)胞近乎縮成圓形即可。第五十四頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 4. 終止消化：立即加入含有血清終止消化：立即加入含有血清(xuqng)的培養(yǎng)基，用吸管吹打分散細(xì)胞，吹的培養(yǎng)基，用吸管吹打分散細(xì)胞，吹打動(dòng)作不可過猛，力度要適中，否則打動(dòng)作不可過猛，力度要適中，否則容易損傷細(xì)胞并產(chǎn)生能傷害細(xì)胞的氣容易損傷細(xì)胞并產(chǎn)

34、生能傷害細(xì)胞的氣泡。泡。 5. 1000rmp離心離心5min，棄上清。，棄上清。 6. 用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。胞密度。第五十五頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)3 3、培養(yǎng)細(xì)胞生長、培養(yǎng)細(xì)胞生長(sh(shngzhngzhng)ng)狀況的觀狀況的觀察察 常規(guī)常規(guī)(chnggu)觀察：觀察： 培養(yǎng)液顏色（是否變黃）培養(yǎng)液顏色（是否變黃） 生長增殖變化（經(jīng)歷到哪個(gè)時(shí)期，長滿否）生長增殖變化（經(jīng)歷到哪個(gè)時(shí)期，長滿否） 形態(tài)變化（透明度、折光性、細(xì)胞輪廓）形態(tài)變化（透明度、折光性、細(xì)胞輪廓） 微生物污染（細(xì)菌、霉菌）微生物污染（細(xì)菌、霉菌） 可用

35、顯微鏡觀察活細(xì)胞及其動(dòng)態(tài)可用顯微鏡觀察活細(xì)胞及其動(dòng)態(tài)第五十六頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)細(xì)胞細(xì)胞(xb(xbo)o)生長狀況的觀察生長狀況的觀察當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過測定一定體積當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過測定一定體積(tj)懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。第五十七頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 1.將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板。將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板。 2.將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿將細(xì)胞懸液吸出少許，滴

36、加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間，靜置蓋片和計(jì)數(shù)板之間，靜置3min，注意蓋片下不要有氣泡，注意蓋片下不要有氣泡(qpo)，也不能讓懸液流入旁邊槽中。，也不能讓懸液流入旁邊槽中。 3.計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按公式計(jì)算：按公式計(jì)算：細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù)四大格細(xì)胞總數(shù)/4104 說明：公式中除以說明：公式中除以4，因?yàn)橛?jì)數(shù)了，因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。公公式中乘以式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：1.0mm（長）長）1.0mm（寬）（

37、寬）0.1mm（高）（高）=0.1mm3而而1ml=1000mm3（注意：鏡下偶見有兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)（注意：鏡下偶見有兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)胞團(tuán)10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液第五十八頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 細(xì)胞生長細(xì)胞生長(shngzhng)曲線曲線（細(xì)胞計(jì)數(shù)）（細(xì)胞計(jì)數(shù)） 細(xì)胞周期細(xì)胞周期（流式）（流式） 細(xì)胞分裂指數(shù)細(xì)胞分裂指數(shù)（細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù) ） 細(xì)胞貼壁率細(xì)胞貼壁率第五十九頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)4 4、細(xì)胞、細(xì)胞(x

38、b(xbo)o)凍存、復(fù)蘇及運(yùn)輸凍存、復(fù)蘇及運(yùn)輸 及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存十分必要：及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存十分必要：細(xì)胞一旦離開活體開始原代培養(yǎng)，它的各種生物特性都將細(xì)胞一旦離開活體開始原代培養(yǎng)，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化?；粩嘤行碌淖兓?。 細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存在細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存在-70冰箱中可以保存冰箱中可以保存(bocn)3個(gè)個(gè)月到一年之久；細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮中，溫度達(dá)月到一年之久；細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮中，溫度達(dá)-196，理論上儲(chǔ)存時(shí)間是無限的。理論上儲(chǔ)存時(shí)間是無限的。第六十頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本

39、技術(shù)原理原理(yunl(yunl) )： 細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融慢凍快融，可以最大限度的保存細(xì)胞活力?？梢宰畲笙薅鹊谋４婕?xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用二甲基亞砜或甘油作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)目前細(xì)胞凍存多采用二甲基亞砜或甘油作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性，加上緩慢能提高細(xì)胞膜對水的通透性，加上緩慢(hunmn)冷凍可使細(xì)胞冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。 復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化快速融化的方法。的方法。

40、這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損傷?；顾譂B入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損傷。第六十一頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)凍存步驟凍存步驟(bzhu)(bzhu) 1. 配制含配制含10%DMSO或甘油、或甘油、1020%血清血清的凍存的凍存培養(yǎng)液培養(yǎng)液； 2. 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰酶胰酶把單層生長把單層生長的細(xì)胞消化下來，懸浮生長的細(xì)胞則直接將細(xì)的細(xì)胞消化下來，懸浮生長的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至胞移至15ml離心管中；離心管中； 3.

41、 離心離心(lxn)1000rpm，5min； 4. 去除胰酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的去除胰酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5106/ml1107/ml； 第六十二頁，共六十八頁。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù) 5. 將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管11.5 ml； 6. 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間(shjin)及及操作者；操作者； 7. 凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾蕛龃妫簶?biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?-1-2/ min；當(dāng)溫度達(dá)；當(dāng)溫度達(dá)-25以下時(shí)