（精心整理）實驗8 植物組織中可溶性蛋白質(zhì)含量的測定

1、實驗8 植物組織中可溶性蛋白質(zhì)含量的測定斐林-酚試劑法 原 理 斐林(Folin)-酚試劑法結(jié)合了雙縮脲試劑和酚試劑與蛋白質(zhì)的反應(yīng)， 其中包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下，與銅試劑作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物；第二步是此絡(luò)合物將磷鉬酸、磷鎢酸試劑還原，生成磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)的深藍(lán)色混合物，顏色深淺與蛋白含量成正相關(guān)。在650nm時比色測定的靈敏度比雙縮脲法高100倍。由于膚鍵顯色效果增強(qiáng)，從而減少了因蛋白質(zhì)種類引起的偏差。該法適于微量蛋白的測定(范圍為5l00g蛋白質(zhì))。 材料、儀器設(shè)備及試劑(一)材料 各種植物材料。 (二)儀器設(shè)備 722分光光度計，離心機(jī)，恒溫水浴，定量加樣器，冷凝回流裝置一套

2、，研缽，離心管，刻度移液管，微量滴定管，試管等。 (三)試劑 (1)05molL Na0H。 (2)斐林-酚試劑甲液：由A、B兩種溶液組成：A液：4碳酸鈉(Na2C03)溶液與0.2mol/L氫氧化鈉(Na0H)溶液等體積混合。B液：1硫酸銅(CuS04·5H20)溶液與2酒石酸鉀鈉溶液等體積混合。使用前將A與B按50:1的比例混合即成，此試劑只能在使用當(dāng)天配制。 (3)斐林-酚試劑乙液：稱取鎢酸鈉(Na2W04。H20)100g，鉬酸鈉(Na2Mo04·2H20)25g，加蒸餾水700ml溶解于1500mL的圓底燒瓶中。之后加入85的H3PO450mL，濃Hcl 100

3、mL，安上回流裝置(使用磨口接頭，若用軟木塞或橡皮塞時，就必須用錫鉑紙包起來)，使其慢慢沸騰10h。冷卻后加入硫酸鋰（Li2SO4.H2O）150g,蒸餾水50ml，溴水2-3滴，打開瓶口煮沸15min，以逐出過量的溴，冷卻后溶液呈黃色（若仍綠色，須再滴加幾滴溴水，繼續(xù)煮沸15min）。待冷卻后稀釋至1000ml，過濾入棕色瓶中保存。使用時大約加水1倍，使最終濃度相當(dāng)于1mol/L酸度。因此在使用前應(yīng)進(jìn)行標(biāo)定。標(biāo)定方法：取5ml福林-酚試劑乙液放入錐形瓶內(nèi)，用1mol/L標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，酚酞作指示劑，當(dāng)溶液突然轉(zhuǎn)紅再轉(zhuǎn)灰綠時，即為滴定終點。計算其相當(dāng)?shù)乃岫?，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)至相當(dāng)于

4、1mol/L的酸度。 在測定時要注意，因為酚試劑僅在酸性穩(wěn)定，但此實驗的瓜只在pH10的情況下發(fā)生，所以當(dāng)加酚試劑時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞前即能發(fā)生還原反應(yīng)，否則會使顯色程度減弱。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱取25mg牛血清蛋白，溶于100ml蒸餾水中，使終濃度為250g/ml。實驗步驟 （一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 （1） 取18mm×200mm試管7支，1-7編號，分別加入0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用蒸餾水補(bǔ)足1mL，使每管含蛋白量分別為0mol/L、25mol/L、50mol/L、100mol/L、150

5、mol/L、200mol/L、250mol/L。 （2） 用定量加樣器給每支試管中加入5mL甲液，混勻，于30下放置10min。（3） 再向試管中噴射加入0.5mL乙液，立即振蕩混勻，在30下準(zhǔn)確保溫30min（4） 以不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白的1號管為空白，在650nm下用1cm光徑的比色皿測定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(二)樣品的測定 樣品的提?。悍Q取鮮樣05g，用5mL蒸餾水或緩沖液研磨成勻漿后，10000 rmin離心10min，取上清液10mL（視蛋白質(zhì)含量適當(dāng)稀釋)于試管中，然后重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制中的24步驟，以空白管調(diào)零，測定吸光度。根據(jù)吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求

6、出樣品中的蛋白質(zhì)含量。結(jié)果計算 樣品中蛋白的含量 (mgg) 式中：C為查標(biāo)準(zhǔn)曲線值，g；VT為提取液總體積，mL；WF為樣品鮮重，g；Vs為測定時加樣量，mL。 ' 注意事項 還原物質(zhì)，其他酚類物質(zhì)及檸檬酸對此反應(yīng)有干擾?？捡R斯亮藍(lán)G-250染色法原 理 考馬斯亮藍(lán)G-250(Coomassie brilliant blue G-250)測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。該染料在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中當(dāng)它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，前者最大光吸收?65nm，后者在59511nm。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)(11000g)，蛋白質(zhì)與色素結(jié)合物在595nm波長下的吸光度與蛋白

7、質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測定?？捡R斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)十分迅速，2min左右即達(dá)到平衡。其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。此法靈敏度高(比斐林-酚法還高4倍)，易于操作，干擾物質(zhì)少，是一種比較好的定量法。其缺點是在蛋白質(zhì)含量很高時線性偏低，且不同來源蛋白質(zhì)與色素結(jié)合狀況有一定差異。材料、儀器設(shè)備及試劑(一)材料 小麥葉片及其他植物材料。(二)儀器設(shè)備 722分光光度計，研缽，燒杯，量瓶，移液管，具塞刻度試管等。(三)試劑(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：100gmL牛血清白蛋白：稱取牛血清蛋白25g，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸餾水稀釋至100mL即可。(2)

8、考馬斯亮藍(lán)G-250溶液：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL 90乙醇中，加入100mL 85(WV)的磷酸，再用蒸餾水定容到1L，貯于棕色瓶中。常溫下可保存一個月。實驗步驟(一)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取6文具塞試管，按表2-29-1加入試劑(0100gmL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白)?；旌暇鶆蚝?，向各管中加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，搖勻，并放置5min左右，用1cm光徑比色皿在595nm下比色測定吸光度。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(二)樣品測定 (1)樣品提取。方法與斐林-酚試劑法相同。(2)吸取樣品提取液10mI，放人具塞試管中(每個樣品重復(fù)2次)，加入5mL考馬

9、斯亮藍(lán)G-250溶液，充分混合，放置2min后在595nm下比色，測定吸光度，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。 結(jié)果計算 樣品中蛋白質(zhì)的含量 (mgg) 式中：C、VT、WF、Vs的表示意義與斐林-酚法相同。紫外吸收法原 理 蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、色氨酸等殘基在280nm波長下具有最大光吸收。由于各種蛋白質(zhì)中都含有酪氨酸，因此280nm的光吸收度是蛋白質(zhì)的一種普遍性質(zhì)。在一定程度下，蛋白質(zhì)溶液在280nm吸光度與其濃度成正比，故可作定量測定。核酸在紫外區(qū)(260nm)也有吸收，可通過校正加以消除。材料、儀器設(shè)備及試劑 (一)材料 小麥葉片及其他植物材料。 (二)儀器設(shè)備 紫外分光光度計，離心機(jī)，刻度移液管。(三)試劑 0 1mol/L PH 70磷酸緩沖液。 實驗步驟 （一）樣品提取 與菲林-酚法相同。（二）測定 取適量的樣品提取液，根據(jù)蛋白質(zhì)濃度，用0.1mol/L pH7.0磷酸緩沖液適當(dāng)稀釋后，用紫外分光光度計分別在280nm和260nm波長下讀取吸光度，以pH7.0磷酸緩沖液為空白調(diào)零。結(jié)果計算 蛋白質(zhì)濃度=1.45A280-0.744A260（mg/mL） 蛋白質(zhì)含量= 式中：1.45和0.74為校正值：A280為蛋白質(zhì)溶