實(shí)驗(yàn)二飲料中大腸菌群的測(cè)定

1、大腸桿菌的定義大腸桿菌的定義大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌），分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。大腸桿菌指革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、IMViC試驗(yàn)（靛基質(zhì)、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗(yàn)）為+-或-+-的細(xì)菌。與人類有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏附性大腸桿菌（EAEC）。大腸菌群和大腸桿菌的關(guān)系大腸菌群和大腸桿菌的關(guān)系衛(wèi)生學(xué)意義大腸菌群和大腸桿菌是評(píng)價(jià)衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)，作為食品中的糞便污染指標(biāo)。食品中檢出大腸菌群，表明該食品有糞便污染，既可能有腸道致病菌存

2、在，因而也就有可能通過(guò)污染的食品引起腸道傳染病的流行。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對(duì)人體健康危害性的大小。大腸桿菌在外界存活時(shí)間與一些主要腸道致病菌接近，它的出現(xiàn)預(yù)示著某些腸道病原菌的存在，因此該菌是國(guó)際上公認(rèn)的衛(wèi)生監(jiān)測(cè)指示菌。近年來(lái)，有些國(guó)家在執(zhí)行HACCP管理中，將大腸桿菌檢測(cè)作為微生物污染狀況的監(jiān)測(cè)指標(biāo)和HACCP實(shí)施效果的評(píng)估指標(biāo)。大腸桿菌的生物學(xué)特性基本形態(tài)： 此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多單獨(dú)存在或成雙，但不呈長(zhǎng)鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過(guò)10根，故菌體動(dòng)力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢

3、膜或微莢膜，不形成芽孢，對(duì)普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。大腸桿菌的生物學(xué)特性培養(yǎng)特性：大腸桿菌合成代謝能力強(qiáng)，在含無(wú)機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。最適生長(zhǎng)溫度為37，在42-44 條件下仍能生長(zhǎng)，生長(zhǎng)溫度范圍15-46 。l 在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上有3種菌落形態(tài)： 1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤(rùn)、 光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易 在生理鹽水中自凝； 3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。大腸菌群及大腸桿菌測(cè)定 MPN法檢驗(yàn)流程（FDA BAM） 檢樣50g+450ml稀釋液 適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液

4、，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯（每管9ml LST肉湯并加有導(dǎo)管），每管接種1mL 35 ，24 2h 48 2h 沒(méi)有產(chǎn)氣管 有產(chǎn)氣管 報(bào)告陰性 接種BGLB肉湯管 接種EC肉湯 35 ，48 2h 44.50.5 （水浴培養(yǎng)） 24 2h 48 2h 查MPN表報(bào)告結(jié)果 產(chǎn)氣管接種EMB平板（35、1824h） （大腸菌群） 從EMB平板上挑取5個(gè)可疑菌轉(zhuǎn)接到PCA斜 面，進(jìn)行革蘭氏染色、IMVC生化鑒定、接 種LST復(fù)檢產(chǎn)氣 查MPN表報(bào)告結(jié)果（大腸桿菌） 大腸菌群測(cè)定MPN法檢驗(yàn)幾點(diǎn)說(shuō)明MPNMPN檢索表：檢索表： MPN 為最大可能數(shù)(Most Probable Number)的簡(jiǎn)稱

5、。這種方法，對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)系列稀釋，加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽(yáng)性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來(lái)推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn)：初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn)： 1）兩步法進(jìn)行了兩次乳糖發(fā)酵試驗(yàn)。初發(fā)酵和證實(shí)實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基不同，但都是為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。 LST中提供了磷酸鹽緩沖體系，氯化鈉可維持滲透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長(zhǎng)，這個(gè)緩沖蛋白胨乳糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵（Slow lactose fermentations）”來(lái)促進(jìn)菌體產(chǎn)氣。BGLB中

6、膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細(xì)菌。 2）初發(fā)酵陽(yáng)性管，不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過(guò)證實(shí)試驗(yàn)后，有時(shí)可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率，初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相差較大。因此，在實(shí)際檢測(cè)工作中，證實(shí)試驗(yàn)是必需的。產(chǎn)氣量與倒管：產(chǎn)氣量與倒管： 在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)工作中，經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時(shí)比小米粒還?。?，有時(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實(shí)驗(yàn)表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問(wèn)時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即

7、應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。 大腸桿菌測(cè)定EMB選擇性分離鑒別EMB平板典型大腸桿菌菌落特征：中心黑色或紫紅色，有或無(wú)綠色金屬光澤大腸桿菌測(cè)定EMB選擇性分離鑒別EMB是一種弱選擇性培養(yǎng)基，一些球菌也可在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；高壓滅菌可使得美藍(lán)還原從而使培養(yǎng)基的顏色呈不均一橘黃色，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)基可以恢復(fù)原有的正常紫色，傾注平板前應(yīng)先搖勻；大腸桿菌在該培養(yǎng)基上并不一定總是呈現(xiàn)綠色的金屬光澤；該培養(yǎng)基受可見光易使其中的成分氧化，儲(chǔ)存及培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)都應(yīng)在避光條件。菌名菌落形態(tài)大腸埃希氏菌 紫黑色，有綠色金屬光澤肺炎克雷伯氏菌粉色，中心色深陰溝腸桿菌粉色，中心色深弗氏志賀氏菌無(wú)色鼠傷寒沙門氏菌 無(wú)

8、色糞鏈球菌無(wú)色大腸桿菌測(cè)定革蘭氏染色基本原理： 革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種重要的鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。此法可將細(xì)菌分為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌兩大類。 革蘭氏染色的機(jī)理主要是利用兩類細(xì)菌的細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)的不同。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中含有較多的類脂質(zhì)，而肽聚糖的含量較少。當(dāng)用酒精或丙酮酸脫色時(shí)，類脂質(zhì)被溶解，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染后的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)胞被脫色，經(jīng)復(fù)染后，又染上復(fù)染液的顏色。而革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中肽聚糖的含量多而且交聯(lián)度大，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)乙醇或丙酮洗脫后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此細(xì)胞仍保留初染時(shí)的顏色。大腸

9、桿菌測(cè)定革蘭氏染色基本步驟：將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脫色約1530s,直至染色液被洗掉，不要過(guò)分脫色，水洗；滴加番紅復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗、待干、鏡檢。結(jié)果：革蘭氏陽(yáng)性菌呈，革蘭氏陰性菌呈。大腸桿菌測(cè)定生化鑒定Testpositivenegativebiotype1biotype2reagentIndole紅色環(huán)不變色+-KovacsMR紅色不變色+甲基紅V-P玫瑰紅色環(huán)不變色-V-P甲、乙液Citrate生長(zhǎng)不生長(zhǎng)-實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 飲料中大腸菌群的測(cè)定飲料中大腸菌群的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)飲料中大

10、腸菌群檢測(cè)程序、方法；、學(xué)習(xí)飲料中大腸菌群檢測(cè)程序、方法；2、掌握飲料中大腸菌群檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告方式。、掌握飲料中大腸菌群檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告方式。二、實(shí)驗(yàn)材料二、實(shí)驗(yàn)材料1、設(shè)備和材料、設(shè)備和材料溫箱、水浴鍋、天平、顯微鏡、均質(zhì)器或乳缽、溫度計(jì)、溫箱、水浴鍋、天平、顯微鏡、均質(zhì)器或乳缽、溫度計(jì)、平皿、試管、發(fā)酵管、吸管、載玻片、接種針平皿、試管、發(fā)酵管、吸管、載玻片、接種針2、培養(yǎng)基及試劑、培養(yǎng)基及試劑乳糖乳糖膽鹽發(fā)酵管、乳糖發(fā)酵管、蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑、膽鹽發(fā)酵管、乳糖發(fā)酵管、蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑、麥康凱、伊紅美藍(lán)瓊脂（麥康凱、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）、革蘭氏染色液）、革蘭氏染色液GB4789.3-

11、2010 大腸菌群計(jì)數(shù)GB4789.3-2010 大腸菌群計(jì)數(shù)（一）最先準(zhǔn)備的器材（一）最先準(zhǔn)備的器材規(guī)格名稱 數(shù)量 用途1、500ml三角瓶 1個(gè) 稀釋樣品2、250ml三角瓶 1個(gè) 制EMB瓊脂3、18180mm試管 9支 單料乳糖膽鹽發(fā)酵管4、18180mm試管 3支 稀釋樣品（9ml）5、1ml移液管 5 支6、10ml移液管 3 支7、直徑為90mm平皿 2套制EMB平板8、250ml量筒 1支9、玻璃珠：直徑約5mm（二）應(yīng)滅菌消毒的器材（二）應(yīng)滅菌消毒的器材剪刀1把不銹鋼藥匙1把 滴管膠頭5只稱量紙適量（三）應(yīng)制備的培養(yǎng)基（三）應(yīng)制備的培養(yǎng)基 培養(yǎng)基 總量 所用容器l蒸餾水 22

12、5ml 500ml三角瓶l蒸餾水 9ml/ 3支 27ml 18180mm試管（稀釋樣品）l乳糖膽鹽發(fā)酵管（單料）： 10ml/ 9支 100ml18180mm試管(裝杜氏小管 )lEMB瓊脂： 1瓶 150ml 250ml三角瓶（每 組配一瓶）蛋白胨20g、膽鹽5g、乳糖10g、0.4%溴甲酚紫乙醇溶液25ml、蒸餾水1000ml（將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于水中，校正PH值至7.4，加入指示劑）；或購(gòu)買制好的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、按說(shuō)明配置。分裝試管，每管10ml，并放入一個(gè)到氣管（杜氏小管），高壓滅菌115、15分鐘。雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基除蒸餾水外，其它成分加倍。乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基：乳糖膽鹽

13、發(fā)酵培養(yǎng)基：P99 蛋白胨 10.0g 乳糖 10.0g 磷酸氫二鉀 2.0g 瓊脂 15.0g伊紅 0.4g美藍(lán)0.065g 或20ml 伊紅 (20g /L)和 10ml 美藍(lán)(6.5 g /L) 蒸餾水 1000.0mL最終pH7.10.2 (25) 先將蒸餾水中加入磷酸氫二鉀及蛋白胨、乳糖使之溶解，后加瓊脂加熱溶解，再調(diào)pH=7.2-7.4,再加入伊紅,美藍(lán)水溶液, 高壓滅菌115、15分鐘。 蛋白胨提供細(xì)菌生長(zhǎng)發(fā)育所需的氮源、維生素和氨基酸，乳糖提供發(fā)酵所需的碳源，磷酸氫二鉀維持緩沖體系，伊紅Y和美藍(lán)抑制絕大部分革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)。瓊脂是凝固劑。 大腸桿菌在EMB上發(fā)酵乳糖，形成黑色

14、菌落，大部分有金屬光澤。沙門氏菌形成無(wú)色菌落。金黃色葡萄球菌基本上不生長(zhǎng)。 EMB（伊紅美藍(lán)瓊脂）（伊紅美藍(lán)瓊脂）質(zhì)控：質(zhì)控：此培養(yǎng)基呈紫色，可有細(xì)微沉淀。質(zhì)此培養(yǎng)基呈紫色，可有細(xì)微沉淀。質(zhì)控菌株接種后，控菌株接種后，3535培養(yǎng)培養(yǎng)18182424小時(shí)，小時(shí)，觀察結(jié)果應(yīng)如下表所示：觀察結(jié)果應(yīng)如下表所示：菌株 菌號(hào) 生長(zhǎng)情況 菌落產(chǎn)氣腸桿菌 ATCC 13048 好 粉紅，無(wú)光澤大腸埃希氏菌 ATCC 25922 好，極好 有紫綠金屬光澤中心肺炎克雷伯氏菌 ATCC 13883 好 綠金屬光澤，有黑心奇異變形桿菌 ATCC 25933 好，極好 無(wú)色鼠傷寒沙門氏菌 ATCC 14028 好，極

15、好 無(wú)色金黃色葡萄球菌 ATCC 25923 被抑制 說(shuō)明：（1）伊紅又稱署紅或四溴熒光素，為酸性染料。美藍(lán)又稱亞甲藍(lán)，為堿性染料。當(dāng)大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸時(shí)，細(xì)菌帶正電荷，染上紅色，再與美藍(lán)結(jié)合而形成紫黑色菌落，并有綠色金屬光澤。二者除了作為指示劑外，還有抑制格蘭氏陽(yáng)性菌的作用。（2）在堿性環(huán)境中，不分解乳糖產(chǎn)酸的細(xì)菌不著色。伊紅、美藍(lán)不能結(jié)合，故沙門氏菌和志賀氏菌等為無(wú)色或琥珀色半透明菌落。（3）此培養(yǎng)基用于鑒別大腸桿菌及產(chǎn)氣桿菌，并可快速鑒定白色念珠菌及鑒定凝固酶陽(yáng)性葡萄球菌。美國(guó)公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)和美國(guó)細(xì)菌協(xié)會(huì)推薦，用于增殖或鑒別大腸桿菌的檢查。但某些沙門氏菌、志賀氏菌可被抑制。培養(yǎng)基保存應(yīng)注

16、意避光防止氧化。 樣品1.酸奶12.鮮奶3.水樣14.水樣25.水樣36.水樣47.水樣58.酸奶2A1組組 酸奶1 A2A2組組 水樣1 A3組組 水樣2 A4組組 水樣3 B1B1組組 鮮奶 B2B2組組 水樣4 B3B3組組 水樣5 B4組組 酸奶2 三、實(shí)驗(yàn)方法與三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟步驟1、采樣及稀釋、采樣及稀釋以無(wú)菌操作將檢樣以無(wú)菌操作將檢樣25g（或（或25ml）放于含有）放于含有225ml滅菌生理滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨

17、做成1：10的均勻稀釋的均勻稀釋液。固體檢樣最好用無(wú)菌均質(zhì)器，以液。固體檢樣最好用無(wú)菌均質(zhì)器，以800r/min1000r/min的的速度處理速度處理1min，做成，做成1：10的稀釋液。的稀釋液。用用1ml滅菌吸管吸取滅菌吸管吸取1：10稀釋液稀釋液1ml，注入含有，注入含有9ml滅菌生滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖混勻，做成理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖混勻，做成1：100的稀釋的稀釋液，換用液，換用1支支1ml滅菌吸管，按上述操作依次作滅菌吸管，按上述操作依次作10倍遞增稀釋倍遞增稀釋液液2. 乳糖初發(fā)酵試驗(yàn)乳糖初發(fā)酵試驗(yàn) 即通常所說(shuō)的假定試驗(yàn)。其目的在于檢查樣品中有無(wú)發(fā)即通常

18、所說(shuō)的假定試驗(yàn)。其目的在于檢查樣品中有無(wú)發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體的細(xì)菌。酵乳糖產(chǎn)生氣體的細(xì)菌。 將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1ml以上以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；1ml及及1ml以下者，用單料乳糖以下者，用單料乳糖發(fā)酵管。每一個(gè)稀釋度接種發(fā)酵管。每一個(gè)稀釋度接種3管，置（管，置（361）0C溫箱內(nèi)，培溫箱內(nèi)，培養(yǎng)（養(yǎng)（242）h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)生者，則按下列程續(xù)進(jìn)行為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)生者，則按下列程續(xù)進(jìn)行根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z驗(yàn)樣

19、品污染情況估計(jì)，選擇三根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z驗(yàn)樣品污染情況估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管。也可直接用樣品接種。管。也可直接用樣品接種。10， 100, 1000 倍稀釋（倍稀釋（-1，-2，-3）3.分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)（10倍稀釋倍稀釋） 將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂板或麥康凱瓊將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂板或麥康凱瓊脂平板上，置（脂平板上，置（361）0C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18h24h，然后取出，然后取出，觀察菌落形態(tài)并作革蘭氏染色鏡檢和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。觀察菌落形態(tài)并作革蘭氏染色鏡檢和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。4.乳糖復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)乳糖復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 即通常所說(shuō)的證實(shí)試驗(yàn)，其目的在于證明從乳糖初酵管即通常所說(shuō)的證實(shí)試驗(yàn)，其目的在于證明從乳糖初酵管試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)的試管內(nèi)分離到的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌，試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)的試管內(nèi)分離到的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌，確能發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體。確能