PCR原理技術(shù)與應(yīng)用附教學(xué)用ppt課件

1、PCR原理技術(shù)與運(yùn)用 PCRPolymerase Chain Reaction即即聚合酶鏈?zhǔn)椒错懀侵冈诰酆厦告準(zhǔn)椒错?，是指在DNA聚合酶催化聚合酶催化下，以母鏈下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，經(jīng)過變性、退火、延伸等步驟，伸起點(diǎn)，經(jīng)過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。的過程。 是一項(xiàng)是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA?？捎糜诨？捎糜诨蚍謩e克隆，序列分析，基因表達(dá)調(diào)控，因分別克隆，序列分析，基因表達(dá)調(diào)控，基因

2、多態(tài)性研討等許多方面?；蚨鄳B(tài)性研討等許多方面。 PCR技術(shù)的根本原理技術(shù)的根本原理一一.PCR反響成分：反響成分：1.模板模板DNA；2.引物；引物；3.四種脫氧核糖核苷酸；四種脫氧核糖核苷酸；4.DNA聚合酶；聚合酶；5.反響緩沖液、反響緩沖液、Mg2 等。等。二二.PCR反響根本步驟：反響根本步驟：1.變性：高溫使雙鏈變性：高溫使雙鏈DNA解離構(gòu)成單鏈解離構(gòu)成單鏈94，30s。2.退火：低溫下，引物與模板退火：低溫下，引物與模板DNA互補(bǔ)區(qū)結(jié)合互補(bǔ)區(qū)結(jié)合55，30s。3.延伸：中溫延伸。延伸：中溫延伸。DNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反響鏈延伸反響7

3、072，3060s1.變性變性(denaturation)：經(jīng)過加：經(jīng)過加熱使模板熱使模板DNA的雙鏈之間的氫鍵的雙鏈之間的氫鍵斷裂，雙鏈分開而成單鏈的過程。斷裂，雙鏈分開而成單鏈的過程。 2.退火退火(annealling)：當(dāng)溫度降：當(dāng)溫度降低時(shí)，引物與模板低時(shí)，引物與模板DNA中互補(bǔ)區(qū)中互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合成雜交分子。域結(jié)合成雜交分子。 3.延伸延伸(extension)：在：在DNA聚合聚合酶、酶、dNTPs、 Mg2 存在下，存在下，DNA聚合酶催化引物按聚合酶催化引物按53方方向延伸，合成出與模板向延伸，合成出與模板DNA鏈互鏈互補(bǔ)的補(bǔ)的DNA子鏈。子鏈。 以上述三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，以上述

4、三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物均可作為下一個(gè)每一循環(huán)的產(chǎn)物均可作為下一個(gè)循環(huán)的模板，經(jīng)過循環(huán)的模板，經(jīng)過n次循環(huán)后，次循環(huán)后，目的目的DNA以以2n的方式添加。的方式添加。 PCR反響的成分和作用 總體積：普通為25l100 l 一無Mg2+ buffer：由純水、KCl、Tris組成。Tris用于調(diào)理反響體系pH值，使Taq酶在偏堿性環(huán)境中反揮活性。 KCl可降低退火溫度，但不能超越50 mmol/L，否那么會(huì)抑制DNA聚合酶活性。 二 Mg2+ :終濃度為1.52.0mmol/L，其對(duì)應(yīng)dNTP為200 mol/L，留意Mg2+與dNTPs之間的濃度關(guān)系，由于dNTP與Taq酶竟?fàn)嶮g

5、2+ ，當(dāng)dNTP濃度到達(dá)1 mmol/L時(shí)會(huì)抑制Taq酶的活性。 Mg2+ 能影響反響的特異性和產(chǎn)率。 三BSA(牛血潔白蛋白：普通用乙?；腂SA，起著減少PCR管對(duì)Taq酶的吸附作用，對(duì)Taq酶有維護(hù)作用。 四底物dNTPs：dNTPs具有較強(qiáng)酸性，其儲(chǔ)存液用NaOH調(diào)pH值至7.07.5，普通存儲(chǔ)濃度為 10 mmol/L，各成份以等當(dāng)量配制，反響終濃度為20200mol/L。高濃度可加速反響，但同時(shí)添加錯(cuò)誤摻入和實(shí)驗(yàn)本錢；低濃度可提高準(zhǔn)確性，而反響速度會(huì)降低。五Taq酶：能耐95高溫而不失活，其最適pH值為8.38.5，最適溫度為7580，普通用72。能催化以DNA單鏈為模板，以堿基

6、互補(bǔ)原那么為根底，按53方向逐個(gè)將dNTP分子銜接到引物的3端，合成一條與模板DNA互補(bǔ)的新的DNA子鏈。無35的外切酶活性，沒有校正功能。某種dNTP或Mg2+ 濃度過高,會(huì)添加其錯(cuò)配率。用量普通為0.55個(gè)單位/100l。六模板：PCR對(duì)模板DNA的純度不要求很高，但應(yīng)盡量不含有對(duì)PCR反響有抑制造用的雜質(zhì)存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制劑、能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。 模板DNA的量不能太高，否那么擴(kuò)增能夠不會(huì)勝利，在此情況下可適當(dāng)稀釋模板。 七引物：引物濃度普通為0.10.5mol/L，濃度過高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異擴(kuò)增，濃度過低那么得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過低。引物長度普通1530個(gè)堿

7、基，引物過長或過短都會(huì)降低特異性。其3末端一定要與模板DNA配對(duì)，末位堿基最好選用A、C、G因T錯(cuò)配也能引發(fā)鏈的延伸。 引物G C約占4555%，堿基應(yīng)盡量隨機(jī)分布，防止嘧啶或嘌呤堆積，兩引物之間不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，不能與非目的擴(kuò)增區(qū)有同源性。 PCRPCR反響條件的選擇影響要素反響條件的選擇影響要素溫度參數(shù)：溫度參數(shù)： 1.1.變性：模板變性完全與否是變性：模板變性完全與否是PCRPCR勝利的關(guān)鍵，普通先于勝利的關(guān)鍵，普通先于9494或或9595變變性性3 310min10min，接著，接著9494變性變性303060s60s。 2.2.退火：退火溫度普通低于引物本身變性溫度退火：退火溫度普通

8、低于引物本身變性溫度55。引物長度在。引物長度在151525bp25bp可可經(jīng)過公經(jīng)過公Tm=(G C)Tm=(G C)4 (A T)4 (A T)22計(jì)算退火溫度，普通退火溫度在計(jì)算退火溫度，普通退火溫度在40406060之之間，時(shí)間為間，時(shí)間為303045s45s。假設(shè)。假設(shè)(G C)(G C)低于低于50%50%，退火溫度應(yīng)低于，退火溫度應(yīng)低于5555。較高的退。較高的退火溫度可提高反響的特異性。火溫度可提高反響的特異性。 3.3.延伸：延伸溫度應(yīng)在延伸：延伸溫度應(yīng)在TaqTaq酶的最適溫度范圍之內(nèi)，普通在酶的最適溫度范圍之內(nèi)，普通在70707575。延伸。延伸時(shí)間要根據(jù)時(shí)間要根據(jù)DNA

9、DNA聚合酶的延伸速度和目的擴(kuò)增片段的長度確定，通常對(duì)于聚合酶的延伸速度和目的擴(kuò)增片段的長度確定，通常對(duì)于1kb1kb以內(nèi)的片段以內(nèi)的片段1min1min是夠用的。是夠用的。 循環(huán)數(shù)：循環(huán)數(shù)： PCRPCR的循環(huán)數(shù)主要由模板的循環(huán)數(shù)主要由模板DNADNA的量決議，普通的量決議，普通20203030次循環(huán)數(shù)較適宜，過多的次循環(huán)數(shù)較適宜，過多的循環(huán)數(shù)會(huì)添加非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，詳細(xì)要多少循環(huán)數(shù)可經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。循環(huán)數(shù)會(huì)添加非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，詳細(xì)要多少循環(huán)數(shù)可經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。 PCR常見問題常見問題一.沒有擴(kuò)增產(chǎn)物 1.循環(huán)溫度：變性溫度、退火溫度 2.引物設(shè)計(jì) 3.DNA聚合酶活性 4.抑制性成份(蛋白酶

10、、核酸酶、其它抑制聚合 酶活性的成份) 5、DNA樣品 二.非特異產(chǎn)物及電泳呈涂布狀 1.Mg2 濃度 2.調(diào)整引物、模板、聚合酶的用量 3.適當(dāng)減少循環(huán)數(shù) 4.適當(dāng)提高退火溫度，縮短退火或延伸時(shí)間 三.引物二聚體的構(gòu)成 1.檢查引物的序列 2.提高退火溫度 3.調(diào)整引物與模板濃度 4.添加引物長度 四.假陽性結(jié)果的預(yù)防 1、實(shí)驗(yàn)器材應(yīng)一次性運(yùn)用(吸咀、PCR管) 2、留意操作環(huán)境，戴一次性手套 3、嚴(yán)厲PCR操作規(guī)程 4、多次取樣的試劑應(yīng)分裝 5、設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照 PCR相關(guān)技術(shù)相關(guān)技術(shù) 一.錨定PCR(anchored PCR)： 引進(jìn)錨定引物，可以協(xié)助抑制序列未知或序列未全知的妨礙

11、。 在DNA3-末端加上poly(dG)尾，與此相對(duì)應(yīng)的錨定引物poly(dC)普通應(yīng)在十二聚體以上。 二.不對(duì)稱PCR(asymmetric PCR)不對(duì)稱PCR主要是在PCR體系中設(shè)計(jì)不同的引物濃度，兩條引物濃度比為1：50或1：100，前12個(gè)循環(huán)兩條模板等量擴(kuò)增，之后低濃度引物耗費(fèi)殆盡，其擴(kuò)增產(chǎn)物減少以致于無；而高濃度引物介導(dǎo)產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物即單鏈DNA逐漸添加，可得到大量單鏈DNAssDNA用于直接測序。 四.多重PCR(multiplex PCR) 多重PCR是用多對(duì)引物同時(shí)對(duì)模板DNA上的多個(gè)區(qū)域進(jìn)展擴(kuò)增。 多重PCR技術(shù)的難點(diǎn)不是在于其原理和操作的復(fù)雜性，而是在于其多對(duì)引物的設(shè)計(jì)

12、，必需保證多對(duì)引物之間不構(gòu)成引物二聚體，引物與目的模板區(qū)域具有高度特異性。 運(yùn)用于基因診斷，對(duì)與疾病相關(guān)的基因龐大進(jìn)展擴(kuò)增檢測。 五.逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)由mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA鏈作為PCR反響模板。 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA時(shí)，引物可選用特異引物、隨機(jī)六聚體引物或寡聚dT(12-18)。 設(shè)計(jì)RT-PCR的引物時(shí)最好是分散在不同的外顯子上，以免基因組DNA的污染導(dǎo)致假陽性結(jié)果 六.差別PCR(differential PCR) 差別PCR是將靶基因與知拷貝的參照基因置于同一PCR反響體系中，用同一套引物進(jìn)展擴(kuò)增，電泳染色后可根據(jù)參照基

13、因的擴(kuò)增產(chǎn)物與待測基因擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)豐度對(duì)待測基因進(jìn)展定量。 七.原位PCR(In situ PCR)原位PCR是指在組織或細(xì)胞標(biāo)本片上直接進(jìn)展PCR，對(duì)細(xì)胞中的靶DNA進(jìn)展擴(kuò)增，經(jīng)過摻入標(biāo)志基團(tuán)直接顯色或結(jié)合原位雜交進(jìn)展檢測的方法。可分為直接法和間接法。根本步驟：組織切片或細(xì)胞固定蛋白酶消化原位PCR擴(kuò)增沖洗產(chǎn)物檢測優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，可進(jìn)展細(xì)胞內(nèi)定位 八.熒光定量PCR(FQ-PCR)熒光定量PCR：融匯PCR技術(shù)、DNA探針雜交技術(shù)(標(biāo)志有熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán))，結(jié)合先進(jìn)的光譜檢測技術(shù)開展起來的一項(xiàng)新技術(shù)。主要原理是在待擴(kuò)增區(qū)域結(jié)合上DNA探針，PCR過程中，具有53外切酶活性的Taq

14、酶延伸引物鏈到DNA探針時(shí)，將DNA探針逐個(gè)降解，釋放出熒光報(bào)告基團(tuán)，這樣PCR體系中熒光的強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物量之間存在正比關(guān)系，可經(jīng)過測定熒光強(qiáng)度而對(duì)PCR產(chǎn)物定量。 熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn)： 1.可進(jìn)展準(zhǔn)確的定量檢測。用于基因診斷。 2.定量范圍寬。 3.特異性更強(qiáng)，抑制了假陽性。 4.操作簡單快速，無須后處置和電泳檢測。 5.平安，技術(shù)易于學(xué)習(xí)，易于進(jìn)展電腦化 數(shù)據(jù)管理。 PCR技術(shù)的運(yùn)用技術(shù)的運(yùn)用1.遺傳性疾病的基因診斷遺傳性疾病的基因診斷2.傳染病的診斷傳染病的診斷(肝炎病毒肝炎病毒)3.癌基因檢測癌基因檢測4.法醫(yī)學(xué)法醫(yī)學(xué)(親子鑒定親子鑒定)上的運(yùn)用上的運(yùn)用5.DNA測序測序6.基因克隆基因克隆7.引入基因點(diǎn)突變引入基因點(diǎn)突變,基因交融等基因交融等關(guān)于親子鑒定 人類基因組是一個(gè)構(gòu)造非常穩(wěn)定的體系，同時(shí)又是一個(gè)變異的體系，在長期的進(jìn)化過程中，基因組 DNA的序列不斷發(fā)生變異。這些變異有些被保管下來，導(dǎo)致了不同種族，群體和個(gè)體基因組的差別和多態(tài)性，除同卵雙生子外，沒有兩個(gè)個(gè)體基因組是完全一樣的。吳乃虎 P112 用隨機(jī)引物擴(kuò)增出來的PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳之后呈現(xiàn)的帶型，反響了模板DNA分子的總體特征。假設(shè)起始資料用的是細(xì)胞的總DNA，那