基于組合化學(xué)庫(kù)的藥物設(shè)計(jì)

1、本章本章內(nèi)容內(nèi)容組合化學(xué)的基本原理組合庫(kù)的構(gòu)建高通量篩選技術(shù)概念原理設(shè)計(jì)構(gòu)建方法合成技術(shù)生分物結(jié)活構(gòu)性識(shí)成別概念組成計(jì)虛算擬機(jī)篩 選發(fā)的現(xiàn)基藥本物過(guò) 程 人體內(nèi)重要的生物大分子：人體內(nèi)重要的生物大分子：蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)糖糖核酸核酸第一節(jié) 組合化學(xué)的基本原理一、組合化學(xué)(Combinatorial chemistry) 是將一些基本的小分子構(gòu)建模塊如氨基酸、單核苷酸、單糖及各種各樣的化學(xué)小分子通過(guò)化學(xué)或者生物合成的手段，將他們系統(tǒng)地用共價(jià)鍵裝配成不同的組合，構(gòu)建由此得到大量的具有結(jié)構(gòu)多樣性的分子，從而建立化學(xué)分子庫(kù)的方法。用靈敏、快速的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，篩選其活性，發(fā)現(xiàn)具有應(yīng)用開發(fā)潛力的化合物或化

2、合物群，然后測(cè)定其結(jié)構(gòu)，批量合成，并進(jìn)一步評(píng)價(jià)其藥理活性。二、二、組合化學(xué)組合化學(xué)的的原理原理 傳統(tǒng)的化學(xué)合成，每次進(jìn)行一個(gè)反應(yīng)，生成一個(gè)化合物，經(jīng)過(guò)分離、純化后進(jìn)行下一個(gè)反應(yīng)，以此反復(fù)， 最終得到目標(biāo)產(chǎn)物(圖1) 。A + B AB；AB + C ABC；ABC + D ABCD； 圖圖1.傳統(tǒng)化學(xué)合成原理圖示傳統(tǒng)化學(xué)合成原理圖示特點(diǎn)：效率低、速度慢、周期長(zhǎng)、成本高、反應(yīng)的步驟數(shù)遠(yuǎn)大于所需的化合物數(shù)。 組合合成選擇一系列結(jié)構(gòu)、反應(yīng)性能接近的構(gòu)建模塊(A1An)與另一構(gòu)建模塊(B1Bn)進(jìn)行反應(yīng)(圖2)，這樣進(jìn)行一步，就可生成 n n 個(gè)化合物。若將AiBj 與構(gòu)建模塊(C1Cn)和(D1Dn

3、)反應(yīng)，可生成更多的化合物。A1A2A3An特點(diǎn)：能在短時(shí)間內(nèi)合成大量的化合物B1B2B3BnAiBj(i=1n;j=1n)圖2 組合化學(xué)合成原理圖示 組合合成的特點(diǎn)是能在短時(shí)間內(nèi)合成大量的化合物，用少數(shù)的幾步就可以得到數(shù)以萬(wàn)計(jì)的化合物。從表 1 可看出，庫(kù)中分子數(shù)與模塊數(shù)成線形關(guān)系，與反應(yīng)步驟數(shù)成指數(shù)關(guān)系。表1.庫(kù)中分子數(shù)與構(gòu)建模塊數(shù)及反應(yīng)步驟數(shù)的關(guān)系第二節(jié) 組合化學(xué)庫(kù)的構(gòu)建一、組合庫(kù)的設(shè)計(jì) 虛擬組合庫(kù)的設(shè)計(jì) 虛擬組合庫(kù)(vartual combinatorial library)即應(yīng)用電子信息技術(shù)生成和貯存的組合庫(kù)。 實(shí)驗(yàn)組合庫(kù)的設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)組合庫(kù)的實(shí)質(zhì)就是將設(shè)計(jì)的含大量化合物的虛擬組合庫(kù)進(jìn)

4、行精選和優(yōu)選。虛擬組合庫(kù)的虛擬組合庫(kù)的設(shè)計(jì)步驟：設(shè)計(jì)步驟：根據(jù)已知的藥物實(shí)踐以及分子生物學(xué)等其他學(xué)科的成果根據(jù)已知的藥物實(shí)踐以及分子生物學(xué)等其他學(xué)科的成果確定組合合成的目標(biāo)；確定組合合成的目標(biāo)；根據(jù)合成的目標(biāo)設(shè)計(jì)合適的組合合成策略，選擇和設(shè)計(jì)根據(jù)合成的目標(biāo)設(shè)計(jì)合適的組合合成策略，選擇和設(shè)計(jì)組合合成路線；組合合成路線；根據(jù)組合合成路線以及所能得到的基本構(gòu)建單元，選定根據(jù)組合合成路線以及所能得到的基本構(gòu)建單元，選定組合合成的維數(shù)和各維合成的集合；組合合成的維數(shù)和各維合成的集合；獲得虛擬組合庫(kù)。獲得虛擬組合庫(kù)。二、組合庫(kù)的構(gòu)建方法二、組合庫(kù)的構(gòu)建方法(一) 平行法 特點(diǎn)：合成速度較快、化合物的結(jié)構(gòu)測(cè)

5、定相對(duì)容易、化合物數(shù)目較大、可用于固相組合合成和液相組合合成中。l 是指在合成過(guò)程中以平行的方式同時(shí)合成多種反應(yīng)產(chǎn)物。l 每個(gè)反應(yīng)是獨(dú)立進(jìn)行的，如上述反應(yīng)當(dāng)每個(gè)反應(yīng)同時(shí)獨(dú)立進(jìn)行時(shí)，即為平行合成方式。 SR1R2R3R4SR1SR2SR3SR4 1 多針?lè)?poly pin) 是Geyson發(fā)明的用于多肽合成的一種以96孔微量滴定板反應(yīng)裝置為基礎(chǔ)的平行合成法。 操作步驟：將浸在丙烯酸溶液中的聚乙烯小棒用射線照射，使針的表面活化，活化后的針被羧基覆蓋，把不同的氨基酸溶液反應(yīng)試劑轉(zhuǎn)移到96孔微板的每個(gè)孔中，即可對(duì)每一根針進(jìn)行獨(dú)立的合成反應(yīng)。2 茶葉袋法(tea bags) 該法是Houghten發(fā)明

6、的一種組合合成的方法。其固相載體為聚苯乙烯二酯，反應(yīng)容器為化學(xué)惰性的多孔PE小袋，袋子的大小尺寸約為1522，茶葉袋網(wǎng)眼74m，可防止樹脂珠漏出，保證可溶性物質(zhì)的出入。為了高通量合成大容量的多肽庫(kù)，節(jié)省時(shí)間和工作量，在相同的化學(xué)反應(yīng)步驟中，每一個(gè)反應(yīng)器中可容納多個(gè)袋子，同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)，集中進(jìn)行洗滌、脫保護(hù)和中和，在集中切除樹脂珠。3 點(diǎn)陣法(dot matrix) 是一種以纖維素紙片作為固相載體的合成技術(shù)。 特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，但不耐受強(qiáng)酸環(huán)境，僅適合Fmoc保護(hù)方式的模塊。4 光印法(optical printing) 是一種將固相合成技術(shù)與光敏式印刷技術(shù)結(jié)合為一體的高通量合成方法。(二二) 混分

7、法混分法 基本原理：將幾個(gè)模塊分別混合或者將幾個(gè)模塊分別與反應(yīng)珠上的功能集團(tuán)銜接后混合等分成n份，然后分別與m個(gè)構(gòu)建中的每一個(gè)進(jìn)行反應(yīng)，所得產(chǎn)物再混合并分成p等份，分別與p個(gè)構(gòu)建中的每一個(gè)反應(yīng)。，如此逐步繼續(xù)，直到反應(yīng)結(jié)束。最后得到的是一組一組的混合物，所得合物的總數(shù)是nmp。圖圖3 混分法合成過(guò)程混分法合成過(guò)程XYZYZZXXYZYYXXZXXYYZZXYZZZZYYYXXXXZZYXXZYYXYYZXXYZZYZXZXYXYXZYXYXYXZXXXYYYXZZXYZYZXZXYZZYZYXZXZYXXZYYZZZYXYZ混合均分偶聯(lián)混合均分偶聯(lián) 如三個(gè)構(gòu)建單元X、Y、Z，經(jīng)三次組合合成，得

8、3組混合物，每組9個(gè)化合物，一共有333共27個(gè)化合物(圖3)。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：必須鑒定混合物，當(dāng)獲得具有活性的物質(zhì)時(shí)，要經(jīng)過(guò)回溯合成鑒定可能活性化合物的結(jié)構(gòu)，耗費(fèi)時(shí)間和財(cái)力重要重要三、組合庫(kù)合成技術(shù)三、組合庫(kù)合成技術(shù)(一) 固相合成技術(shù) 固相合成是使用固態(tài)的聚合物載體，在其上進(jìn)行合成反應(yīng)，所得最終產(chǎn)品用化學(xué)或者光化學(xué)法使其與作為支點(diǎn)的聚合物脫離。 關(guān)鍵：載體，連接載體和反應(yīng)底物的連接基團(tuán)，相應(yīng)的從載體上解離產(chǎn)物的方法。v 載體的要求： 對(duì)合成過(guò)程中的化學(xué)和物理?xiàng)l件穩(wěn)定； 有可使目標(biāo)化合物連接的反應(yīng)活性位點(diǎn)； 對(duì)所用的溶劑有足夠的溶脹性； 用溫和的條件可使目標(biāo)化合物從載體上選擇性卸脫。 將三氯三嗪

9、與結(jié)合于PEG-PS的各種氨基酸反應(yīng)，得到結(jié)合于固相載體的二氯三嗪，后者仍有兩個(gè)位置可發(fā)生親核取代反應(yīng)，從而可引入新的結(jié)構(gòu)多樣性中心，在親核取代胺化反應(yīng)之后，將產(chǎn)物用氨從固相載體上切割下來(lái)。第一個(gè)反應(yīng)用20個(gè)結(jié)合于PEG-PS的氨基酸；第二、第三個(gè)反應(yīng)，依次用30個(gè)和20個(gè)胺分別進(jìn)行兩次胺化反應(yīng)，可得到12000個(gè)化合物的化合物庫(kù)。v反應(yīng)類型：反應(yīng)類型： 親核取代反應(yīng)、縮合反應(yīng)、雜化合成反應(yīng)、環(huán)加成反應(yīng)等。固相合成的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 可用過(guò)量的試劑使反應(yīng)完全，不受反應(yīng)收率低的限制； 可用過(guò)濾，洗滌的辦法去掉多余的試劑及副產(chǎn)物，分離、純化簡(jiǎn)單； 可用混合法等，反應(yīng)序列可自動(dòng)化； 一次合成化合

10、物數(shù)量可以很多。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 需有和固相載體連接和解離的步驟； 載體和連接基團(tuán)限制了一些反應(yīng)的應(yīng)用； 鑒定反應(yīng)的方法還不夠完善； 產(chǎn)物量有限制。(二) 液相合成技術(shù) 1 液相組合合成液相組合合成(LPCS) 是一種將固相合成易分離的優(yōu)點(diǎn)與液相反應(yīng)結(jié)合起來(lái)，用可溶性的高分子載體代替不溶性的交聯(lián)樹脂來(lái)解決產(chǎn)物的提純(如進(jìn)行重結(jié)晶、超過(guò)濾等)問(wèn)題的技術(shù)。 LPCS的載體需滿足： 1) 易得或易和成； 2) 有良好的機(jī)械和化學(xué)穩(wěn)定性； 3) 含有能鍵合有機(jī)小分子的官能團(tuán)，并在適當(dāng)條件下可以解離； 4) 顯示較好的溶解性能，能在有機(jī)溶劑中與有機(jī)小分子互溶。2 樹狀載體組合合成 是在樹狀載體上進(jìn)行的液相組

11、合合成。在概念上類似于固相組合合成，不同的是反應(yīng)在液相中進(jìn)行。樹狀載體的結(jié)構(gòu)是從一個(gè)中心出發(fā)形成許多支鏈，其分子量比有機(jī)小分子要大，但又比高分子載體小得多，因而其負(fù)載容量比固相載體要大。反應(yīng)結(jié)束后，樹狀中間體可通過(guò)大小排斥色譜或超過(guò)濾等方法進(jìn)行分離，最后得到的樹狀載體可回收利用。圖圖5 樹狀載體組合合成樹狀載體組合合成AAAAAAAABABAABABBABAABABBABA3 氟合成 利用含氟的有機(jī)分子在有機(jī)(水)相中不溶的特點(diǎn)，進(jìn)行“氟相有機(jī)相”萃取操作。 如先將過(guò)量的烯丙醇與溴硅烷反應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記，再與腈N-氧化物進(jìn)行環(huán)加成反應(yīng)，產(chǎn)物異噁唑啉帶有氟標(biāo)記，可萃取進(jìn)氟溶劑相，與未反應(yīng)的起始原料分離

12、。氟化氫催化切割氟標(biāo)記物，經(jīng)三相分配萃取，純的異噁唑啉產(chǎn)物存在于有機(jī)溶劑相中。4 高聚物試劑的使用 使用一種特殊高聚物固相試劑，將試劑被“封鎖”在樹脂珠內(nèi)。因而，選用這種高聚物試劑和合適的底物，在同一容器中反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)完成后，產(chǎn)物擴(kuò)散回溶液中，在進(jìn)入另一個(gè)樹脂珠內(nèi)，與封鎖在其中的試劑反應(yīng)，之后，產(chǎn)物在擴(kuò)散回溶液中，如此，直到最后獲得所需要的化合物庫(kù)。 如取代吡唑的合成，在環(huán)己烷中，將底物-苯乙醇和三種樹脂試劑混合。依次發(fā)生氧化、溴化、醚化反應(yīng)，以48的總收率分離出產(chǎn)物，而分布反應(yīng)中收率為42.液相合成技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)液相合成技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 原則上所有的有機(jī)反應(yīng)都可采用，且已知的反應(yīng)條件可

13、直接反應(yīng)； 無(wú)須多余的步驟，如固相載體的連接與解離； 產(chǎn)量較大。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 分離、純化較為困難； 一次合成化合物的數(shù)量受限制； 反應(yīng)收率要求80%以上。 組合化學(xué)的運(yùn)用加快了制造許多化合物的速度，以求提高發(fā)現(xiàn)新藥的成功率。組合庫(kù)的合成和篩選工作是按先后順序獨(dú)立進(jìn)行的，從所合成的組合庫(kù)中是否能篩選出有效的生物活性分子，取決于化學(xué)家分子設(shè)計(jì)的工作經(jīng)驗(yàn)，并有相當(dāng)大的幸運(yùn)成分。 近年來(lái)出現(xiàn)了一些新嘗試：其一，把按先后順序進(jìn)行的組合庫(kù)生產(chǎn)和篩選工作改為同時(shí)進(jìn)行。在組合庫(kù)的生產(chǎn)過(guò)程中加入了篩選的模板，所形成的部分化合物就可能是模板的配體，成為有效的生物活性分子。其二，如果化合物形成的反應(yīng)是可逆的，模板的

14、引進(jìn)可促使反應(yīng)達(dá)到一個(gè)新的平衡，從而模板配體(與模板結(jié)合的化合物)的比例逐漸變大，這是一個(gè)分子識(shí)別自組裝過(guò)程。結(jié)合這兩個(gè)特點(diǎn)，動(dòng)態(tài)組合化學(xué)因而問(wèn)世。(三) 動(dòng)態(tài)組合化學(xué)(dynamic combinatorial chemistry,DCC)圖圖7 動(dòng)態(tài)組合化學(xué)庫(kù)的圖解動(dòng)態(tài)組合化學(xué)庫(kù)的圖解 DCC 的概念可以用鎖與鑰匙的關(guān)系來(lái)形象的描述。(I)由初始三組分子單元A1、A2、B1、 B2和C1、C2拼組構(gòu)成的數(shù)個(gè)可逆變化的“鑰匙”D1(A1B1C1)、D2(A1B1C2)、D3(A1B2C1)、D7(A2B2C1)、D8(A2B2C2)，形成了一個(gè)潛在的動(dòng)態(tài)庫(kù)。()在分子“鎖”E(模板)加入后，

15、“ 鑰匙”D8與“鎖”E結(jié)合從中篩選出與分子“鎖”結(jié)合最緊密的結(jié)合體F ()，剩下的D1D7離解，放出分子單元，其中包含A2，B2和C2；它們通過(guò)(I)和()的過(guò)程 ，進(jìn)行重排以便產(chǎn)生更多的結(jié)合體F。四四 化合物庫(kù)生物活性成分結(jié)構(gòu)識(shí)別化合物庫(kù)生物活性成分結(jié)構(gòu)識(shí)別 組合化學(xué)的目的是通過(guò)活性篩選發(fā)現(xiàn)新的先導(dǎo)化合物或者對(duì)先導(dǎo)化合物進(jìn)行優(yōu)化。因此，在整個(gè)組合合成中確定生物活性化合物的結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。 目前，獲取目標(biāo)分子信息的方法有： 1) 結(jié)構(gòu)同步識(shí)別法； 2) 利用編碼的方式記錄； 3) 直接進(jìn)行結(jié)構(gòu)測(cè)定。(一)結(jié)構(gòu)同步識(shí)別法 1 循序篩選 是基于裂分合成組合庫(kù)時(shí)，活性評(píng)價(jià)在最后合成的幾個(gè)子庫(kù)中進(jìn)行，

16、而每個(gè)子庫(kù)中混合物最后耦聯(lián)的殘基是唯一的原理，通過(guò)重復(fù)的的合成與活性鑒定，得到活性化合物的結(jié)構(gòu)信息。圖8 循序篩選法的原理2 正交組合 正交組合庫(kù)的每個(gè)化合物被合成兩次，但設(shè)計(jì)每個(gè)化合物在兩次合成中處于不同的組合之中，通過(guò)兩個(gè)庫(kù)中活性最高的兩個(gè)混合物確定活性最高化合物的結(jié)構(gòu)。3 親核性與質(zhì)譜豐度相關(guān)法 配體與受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合時(shí)，活性最強(qiáng)的組分與受體的結(jié)合量最多，在質(zhì)譜(MS)中的離子強(qiáng)度也最大。結(jié)合反應(yīng)后先經(jīng)電噴霧化質(zhì)譜(ESI-MS)氣化，再將一定強(qiáng)度的受體配體n-n- 峰成分解離，去除受體。最后經(jīng)傅立葉變換將配體峰的組分放大，即可讀出活性結(jié)構(gòu)。4 索引組合 與正交組合類似，找出活性最強(qiáng)的兩組

17、，由互補(bǔ)的組成推出先導(dǎo)化合物結(jié)構(gòu)。以二元索引組合庫(kù)的構(gòu)建為例，在A+B AB反應(yīng)中，假設(shè)用10中A構(gòu)件與20中B構(gòu)件按圖9方式編組合成和篩選。圖圖9 索引組合庫(kù)的合成、篩選和先導(dǎo)化合物識(shí)別索引組合庫(kù)的合成、篩選和先導(dǎo)化合物識(shí)別A1B1-20A2B1-20.A10B1-20A庫(kù)，200個(gè)產(chǎn)物，分10份樣品篩選，每份含20個(gè)產(chǎn)物A1-10B1A1-10B2.A1-10B20 B庫(kù)，200個(gè)產(chǎn)物，分20份樣品篩選，每份含10個(gè)產(chǎn)物篩選篩選A7B1-20(活性最強(qiáng))A1-10B19(活性最強(qiáng))A7B19(活性結(jié)構(gòu))5 定位掃描法 在這一方法中，不是合成一個(gè)庫(kù)，而是合成幾個(gè)庫(kù)，這幾個(gè)庫(kù)中包含的化合物種類

18、相同，定位掃描法的第一個(gè)應(yīng)用實(shí)例中是用18種氨基酸作為單體合成了一個(gè)六肽庫(kù)，相同的化合物被合成6次，見(jiàn)圖10。第1個(gè)庫(kù)用來(lái)確定第1位上的氨基酸，根據(jù)O1位上氨基酸的不同分為18個(gè)組，根據(jù)表現(xiàn)出的活性不同，由活性最高的組定出O1位上的氨基酸，其他5個(gè)庫(kù)分別定出另五位氨基酸。第第1 個(gè)庫(kù)個(gè)庫(kù)O1XXXXX-NH2 第第4 個(gè)庫(kù)個(gè)庫(kù)XXXO4XX-NH2第第2 個(gè)庫(kù)個(gè)庫(kù)XO2XXXX-NH2 第第5 個(gè)庫(kù)個(gè)庫(kù)XXXXO5X-NH2第第3 個(gè)庫(kù)個(gè)庫(kù)XXO3XXX-NH2 第第6 個(gè)庫(kù)個(gè)庫(kù)XXXXXO6-NH2O 代表在其位置上單體的種類是確定的代表在其位置上單體的種類是確定的; X 代表在其位置上單體

19、的種類是所有可能單體的等摩爾混合物代表在其位置上單體的種類是所有可能單體的等摩爾混合物圖圖10 用定位掃描法確定活性化合物用定位掃描法確定活性化合物(二) 利用編碼的方法記錄化合物的結(jié)構(gòu)信息1 物理編碼1) 茶袋法 在聚丙烯袋中放入供肽偶聯(lián)反應(yīng)的支持物樹脂珠, 聚丙烯袋的網(wǎng)眼的大小可以保證溶劑和反應(yīng)物進(jìn)入“茶袋”而樹脂珠不會(huì)漏出, “茶袋”每進(jìn)行一次偶聯(lián)反應(yīng), 就用筆記錄在標(biāo)簽上, 為了節(jié)省時(shí)間和工作量, 操作相同時(shí), 將“茶袋”放在一起進(jìn)行, 經(jīng)過(guò)幾次“茶袋”的重組和偶聯(lián)反應(yīng)之后, 每一個(gè)“茶袋”中的樹脂珠上為一種特定的肽序列。反應(yīng)結(jié)束后, 將肽從樹脂珠上解離下來(lái), 進(jìn)行性質(zhì)測(cè)定及活性篩選,

20、 當(dāng)然定性分析是為了驗(yàn)證標(biāo)記結(jié)果, 化合物的結(jié)構(gòu)可以直接從“茶袋”的標(biāo)簽上讀出?！安璐钡臉?biāo)記由手工操作, 效率低, 在庫(kù)容量大時(shí), 使用受到限制。2）高周波標(biāo)記 在惰性的多孔容器中裝入樹脂球和芯片，用高周波在芯片上記錄下樹脂球所發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的歷史，或者將芯片預(yù)先編碼，信息可通過(guò)微片發(fā)射的高周波在75 150 mm 的距離內(nèi)讀出，根據(jù)編碼的信息進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)。與“茶袋”法相比，它的優(yōu)點(diǎn)在于可以省去大量繁瑣的手工操作，尤其在庫(kù)容量大時(shí)該優(yōu)點(diǎn)更為突出。3）激光編碼法 在一塊10mm10mm的平板狀固相合成載體( 也叫激光合成芯片) 的中間是一個(gè)3mm3mm惰性的氧化鋁陶瓷片，在進(jìn)行組合化學(xué)反應(yīng)之前，

21、用二氧化碳激光在陶瓷片上蝕刻上二維條碼，在進(jìn)行每一步反應(yīng)之前，根據(jù)條碼上的信息對(duì)芯片進(jìn)行定向分類，這種方法可以在每塊芯片上合成一種特定的化合物，反應(yīng)后根據(jù)條碼信息確定庫(kù)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。2 化學(xué)編碼 在每一個(gè)珠子上合成一種或幾種標(biāo)記化合物用以標(biāo)記該珠子上庫(kù)化合物的合成歷史，標(biāo)記化合物的結(jié)構(gòu)很容易通過(guò)光譜、色譜法解析，從而間接推出活性庫(kù)化合物的結(jié)構(gòu)。用于標(biāo)記的化合物應(yīng)滿足以下條件：用于標(biāo)記的化合物應(yīng)滿足以下條件：標(biāo)記化合物的合成標(biāo)記化合物的合成不能干擾庫(kù)化合物的合成；不能干擾庫(kù)化合物的合成；標(biāo)記化合物必須能與庫(kù)化合物分開；標(biāo)記化合物必須能與庫(kù)化合物分開；標(biāo)記化合物的濃度應(yīng)該盡量低，標(biāo)記化合物的濃

22、度應(yīng)該盡量低，否則占據(jù)珠子上過(guò)多的功能基；否則占據(jù)珠子上過(guò)多的功能基；標(biāo)記化合物應(yīng)該改能夠應(yīng)用標(biāo)記化合物應(yīng)該改能夠應(yīng)用光譜和色譜法快速測(cè)定其結(jié)構(gòu)。光譜和色譜法快速測(cè)定其結(jié)構(gòu)。(三) 直接對(duì)活性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定 為了避開庫(kù)的重復(fù)合成和復(fù)雜的編碼解碼過(guò)程，人們?cè)O(shè)想是否存在一種能直接鑒定出組合庫(kù)中活性化合物的方法。在這方面組合化學(xué)工作者做了一些嘗試。 在研究合成肽庫(kù)與天然抗體萬(wàn)古霉素結(jié)合活性的研究中，將萬(wàn)古霉素加入到毛細(xì)管電泳緩沖溶液中，肽庫(kù)中100個(gè)化合物的混合物注入毛細(xì)管電泳柱中，與萬(wàn)古霉素有親合力的肽在電泳過(guò)程中就進(jìn)行締合與解離過(guò)程，而使其在電泳中移動(dòng)速度減慢，與其他組份分開，流出順序與親合

23、常數(shù)有關(guān)，流出的組份用電噴霧離子化質(zhì)譜直接測(cè)定其結(jié)構(gòu)。同一研究小組，將庫(kù)擴(kuò)展為1000個(gè)化合物，也能通過(guò)這一方法進(jìn)行研究。 第三節(jié) 高通量篩選技術(shù) 一、概念 高通量篩選(High throughput screening,HTS)技術(shù)是指以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗(yàn)過(guò)程，以靈敏快速的檢測(cè)儀器采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，以計(jì)算機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，同一時(shí)間對(duì)數(shù)以千萬(wàn)樣品檢測(cè)，并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)支持整體運(yùn)轉(zhuǎn)的技術(shù)體系。二二、高通量篩選技術(shù)體系的組成高通量篩選技術(shù)體系的組成 化合物樣品庫(kù)化合物樣品庫(kù)自動(dòng)化的操作系統(tǒng)自動(dòng)化的操作系統(tǒng)高靈敏度的檢測(cè)系

24、統(tǒng)高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng) (一一) 化合物樣品庫(kù)化合物樣品庫(kù) v 傳統(tǒng)化學(xué)合成、分離合成化合物分離的天然產(chǎn)物純化合物和粗提物、有效部位經(jīng)典方法分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、活性測(cè)試費(fèi)時(shí)、效率低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代高通量篩選的需要。從結(jié)構(gòu)多樣性的角度考慮，大自然可能給予我們的結(jié)構(gòu)多樣性大大高于組合化學(xué)，因而天然產(chǎn)物或天然來(lái)源的樣品的重要性不容忽視。v 組合化學(xué)合成從化合物數(shù)量和結(jié)構(gòu)多樣性上，充實(shí)供篩選的化合物庫(kù)v 與其他機(jī)構(gòu)的合作、交換或購(gòu)買(二) 自動(dòng)化的操作系統(tǒng) 一般采用具有固定分布模式的微孔板作為反應(yīng)容器，不同的微孔板通過(guò)條形碼加以標(biāo)記。由計(jì)算機(jī)及其操作軟件、自動(dòng)化加氧設(shè)備、溫

25、孵、離心等組成。通過(guò)光電閱讀器可在特定的微孔板的特定位置進(jìn)行操作，并將操作結(jié)果及相關(guān)數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)中，使篩選結(jié)果準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)過(guò)程快速。Matrix of Wells864963841536 WellRowColumnVolume9681230038416241001536324810v微孔板的顏色和材料v微孔板微孔的設(shè)計(jì)和密度 微孔板微孔密度的增加可以顯著提高單位時(shí)間內(nèi)篩選的通量。 節(jié)約成本。 提高篩選質(zhì)量。lWhatman過(guò)濾型孔板是種多孔形狀物體，便于快速和批量處理樣品。板上刻有號(hào)碼適合于各種微孔板配用儀器和白動(dòng)控制裝置。l微孔板振蕩器的特點(diǎn)獨(dú)立設(shè)定溫度，振蕩速度和混合時(shí)間；混勻器可以編程

26、設(shè)定運(yùn)行一定時(shí)間或者瞬時(shí)混合3秒；內(nèi)置的蓋可以減少污染，樣品揮發(fā)或者噪音的危險(xiǎn)。l一次性吸取大量液體，然后每次按動(dòng)按鈕，僅僅釋放小量等體積的液體。大量液體進(jìn)行等體積分裝。連續(xù)移液器連續(xù)移液器v條形碼 條形碼(barcode)是將寬度不等的多個(gè)黑條和空白，按照一定的編碼規(guī)則排列，用以表達(dá)一組信息的圖形標(biāo)識(shí)符。常見(jiàn)的條形碼是由反射率相差很大的黑條（簡(jiǎn)稱條）和白條（簡(jiǎn)稱空）排成的平行線圖案。215全自動(dòng)移液工作站1.大容量，可自動(dòng)處理12個(gè)96孔反應(yīng)板或480個(gè)試管的樣品。 2.特別適合于HPLC或LC/MS的樣品處理。 3.使用709軟件，有易用的圖示管架編輯器。 4.無(wú)論開口試管或密封試管都有很

27、高精確度。5.Micro215進(jìn)樣量可低至0.5ul。 6.多通道215自動(dòng)樣品處理系統(tǒng)可同時(shí)處理8個(gè)樣品。 (三) 高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng) 高通量藥物篩選模型只有采用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法，才能以可視化的形式將分子、細(xì)胞水平上的相互作用反映出來(lái)，因此，高通量篩選的檢測(cè)技術(shù)是實(shí)現(xiàn)高通量篩選的關(guān)鍵技術(shù)之一。 高通量篩選現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)可分為光學(xué)檢測(cè)技術(shù)和色譜-光譜聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)。1 光學(xué)檢測(cè)技術(shù) (1) 紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)技術(shù)： 主要用于酶抑制藥物的高通量篩選中，通過(guò)酶促反應(yīng)產(chǎn)物的光吸收強(qiáng)度來(lái)測(cè)定酶活力，從而評(píng)價(jià)不同抑制劑的抑制程度。 (2) 發(fā)光檢測(cè)技術(shù)： 通過(guò)產(chǎn)物的化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度來(lái)評(píng)價(jià)藥物的生物活性。(3)

28、熒光標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)： 基于有些物質(zhì)可以發(fā)出熒光的原理設(shè)計(jì)而成，但對(duì)于缺乏熒光活性的篩選系統(tǒng)，一般采用將熒光活性分子與篩選系統(tǒng)內(nèi)分子鍵合標(biāo)記，作為探針?lè)从硺悠返淖饔们闆r。 (4)鄰近閃爍檢測(cè)技術(shù)(Scintillation Proximity Assay, SPA)： 應(yīng)用一種鍵和有受體分子的熒光微球，當(dāng)放射性核素標(biāo)記的配體與受體分子結(jié)合，放射性核素分子與熒光微球之間的距離足夠近，此時(shí)放射性核素發(fā)射出的粒子能夠激發(fā)微球發(fā)射熒光，而游離的放射性核素標(biāo)記的配體與熒光微球之間的距離較遠(yuǎn)，不能激發(fā)熒光，因此無(wú)須分離游離的和結(jié)合的標(biāo)記配體，只要通過(guò)檢測(cè)篩選系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度的變化就可以實(shí)現(xiàn)受體的親和力篩選。 S

29、PA技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)、已被廣泛應(yīng)用于以酶、蛋白受體為靶點(diǎn)的高通量篩選中。鄰近鄰近閃爍檢測(cè)法閃爍檢測(cè)法(Scintillation Proximity Assay, SPA)放射性標(biāo)記配體與SPA微粒上的生物大分子結(jié)合，親近閃爍產(chǎn)生可檢測(cè)的光未標(biāo)記配體不產(chǎn)生親近閃爍-射線作用與微粒上的閃爍劑發(fā)射可檢測(cè)的光SPA 微粒-射線在介質(zhì)中被消散放射性標(biāo)記配體 (5) 光學(xué)傳感器技術(shù) 目前應(yīng)用于藥物篩選的光學(xué)傳感器多是通過(guò)包被在傳感器件敏感膜表面(sensor substrate)的生物識(shí)別分子，與篩選分子特異性結(jié)合時(shí)引起傳感器件的光電物理特性(如光強(qiáng)、折射率或電阻等)的變化，再通過(guò)適當(dāng)?shù)膿Q能器轉(zhuǎn)換

30、為檢測(cè)信號(hào)，從而定性、定量地檢測(cè)樣品的作用情況(圖6)。圖6 光學(xué)傳感器的檢測(cè)原理示意圖2 色譜-光譜聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)(1) 親和色譜技術(shù) 是一種利用生物分子間親和力進(jìn)行分離的液相色譜技術(shù)。 常將生物靶分子固定于基質(zhì)作為固定相，在色譜分離過(guò)程時(shí)樣品與受體的特異性結(jié)合能力決定了樣品的保留，因此通過(guò)保留時(shí)間可以直接獲得樣品與受體親和力的信息，從而實(shí)現(xiàn)藥物的活性篩選。(2)毛細(xì)管電泳技術(shù) 以常規(guī)的緩沖溶液為分離介質(zhì)，進(jìn)樣樣品為平衡的藥物與受體混合物，運(yùn)行過(guò)程中游離的藥物與受體分離，經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)形成平臺(tái)峰，利用峰高可以計(jì)算游離藥物的濃度，進(jìn)而求得藥物與受體的親和力大小(圖 7)。圖7 FACE法測(cè)定藥物與

31、HSA親合力示意圖: H1代表藥物對(duì)照品進(jìn)樣分析后的峰高, H2代表藥物與HSA混合物進(jìn)樣分析后游離藥物的峰高, 兩者比值 fu= H2/H1代表了藥物與HAS的親和力大小(3)質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù) 應(yīng)用質(zhì)譜法進(jìn)行藥物篩選可以同時(shí)檢測(cè)剩余底物量和生成產(chǎn)物量, 因而比光學(xué)檢測(cè)技術(shù)能夠提供更多的樣品作用信息。如Deng等應(yīng)用質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了MurC酶抑制劑的篩選，方法靈敏度高、線性范圍寬，與傳統(tǒng)的比色法相比避免了大量的假陽(yáng)性篩選結(jié)果。(4)電化學(xué)檢測(cè)技術(shù) 膜片鉗技術(shù)一般將玻璃電化學(xué)微電極尖端吸附于細(xì)胞膜，在微電極尖端的邊緣與細(xì)胞膜之間形成高阻抗封接，記錄通過(guò)離子通道的微小離子電流，從而研究其功能。(5)

32、 熱分析檢測(cè)技術(shù) 在研究藥物分子與受體間相互作用時(shí)，常采用一定量的受體分子作為被滴定物，而一定濃度的藥物分子作為滴定配體勻速地滴加到受體分子所處的隔熱罩中，同時(shí)測(cè)量滴定過(guò)程中樣品池(sample cell)和參比池(reference cell)熱量差的變化，獲得滴定熱量差隨時(shí)間的變化曲線圖，結(jié)合根據(jù)單點(diǎn)結(jié)合模型所建立的數(shù)學(xué)表達(dá)式對(duì)該變化曲線進(jìn)行非線性擬合。圖圖 5 等溫滴定量熱儀工作示意圖等溫滴定量熱儀工作示意圖(6) 核磁共振檢測(cè)技術(shù) Robert等提出將1H-NMR應(yīng)用于藥物篩選的方法,其主要原理在于通過(guò)滴加受體分子,根據(jù)不同受體濃度對(duì)于小分子化合物1H譜吸收峰強(qiáng)弱的變化,結(jié)合一定的數(shù)學(xué)

33、處理模型計(jì)算得到親和力的大小。通過(guò)不同濃度樣品與檢測(cè)信號(hào)變化的關(guān)系來(lái)測(cè)定受體親和力的大小是高通量篩選中常用的篩選形式，應(yīng)用該法時(shí)一般測(cè)量6個(gè)濃度點(diǎn)以上樣品,以便獲得穩(wěn)定的親和力常數(shù)。 Microplate reader 最新的微孔板檢測(cè)器具備高速，高靈敏度，通用的特點(diǎn)。 PerkinElmer公司的EnVision 檢測(cè)器可以在36s內(nèi)完成對(duì)一塊1536孔板的熒光強(qiáng)度檢測(cè)。 整合了光吸收，熒光強(qiáng)度，熒光偏振，時(shí)間分辨熒光，化學(xué)發(fā)光，激光等多種檢測(cè)手段。EnVision (PERKINELMER)Safire (TECAN)SpectraMax M5 (Molecular Devices)(四) 數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng) 1 樣品庫(kù)的管理功能 對(duì)進(jìn)行篩選的化合物的各種理化性質(zhì)進(jìn)行存儲(chǔ)管理； 對(duì)每一個(gè)新入庫(kù)的化