臨床免疫學檢驗標準操作程序SOP

1、臨床磁酶免疫學定量檢驗 可調式移液器的標準操作程序（SOP）實驗室名稱項 目編 號制定日期內分泌檢驗室可調式移液器的標準操作程序00000105年01月03日【目的】規(guī)范儀器設備的操作程序，保證加樣器的正常狀態(tài)?！具m用范圍】本實驗室加樣器的操作?！静僮魅藛T】本實驗室實驗人員?！静僮鞑襟E】1設定容量值：轉動加樣器的調節(jié)旋鈕，反時針方向轉動旋鈕，可提高設定移液量。順時針方向轉動旋鈕，可降低設定移液量。在調整設定移液量的旋鈕時，不要用力過猛，并應注意使移液器顯示的數(shù)值不超過其可調范圍。2預洗：當裝上一個新吸頭時應預洗吸頭，先吸入一次液體并將之排回原容器中。3吸液：1 選擇合適的吸頭安放在移液套筒上，

2、稍加扭轉壓緊吸嘴使之與套筒之間無空氣間隙。2 取液之前，所取液體應在室溫（1525）平衡。3 把按鈕壓至第一停點，垂直握持加樣器,使吸頭浸入液面下23毫米處,然后緩慢平穩(wěn)地松開按鈕,吸入液體，等一秒鐘，然后將吸頭提離液面，貼壁停留2-3秒，使管尖外側的液滴滑落。4放液:1 將吸頭口貼到容器內壁底部并保持10040°傾斜。2 平穩(wěn)地把按鈕壓到第一停點,等一秒鐘后再把按鈕壓到第二停點以排出剩余液體。3 壓住按鈕,同時提起加樣器,使吸頭貼容器壁擦過。4 松開按鈕。5 按吸頭彈射器除去吸頭。5加樣器吸嘴為一次性使用。【加樣器的維護保養(yǎng)程序】加樣器應根據(jù)使用頻率進行維護，但至少應每3個月進行一

3、次，具體方法如下：1.一般維護可用中性洗滌劑清潔，或者用60的異丙醇，然后用蒸餾水反復洗滌，去除洗滌劑或異丙醇，晾干。清潔后活塞處可使用一定量的潤滑劑。2.如果有液體進入加樣器內的嚴重污染，可將加樣器拆開后進行清潔，具體拆開步驟參照加樣器說明書。3.高壓消毒，有的加樣器的吸管部分可高壓消毒，但需注意的是消毒時不可超溫超時，也不能擠壓放置，以免造成變形。4.可調式移液器在不使用時應妥善地豎立放于支架上，遠離潮濕及腐蝕性物質。5.在移液操作過程中為防止液體進入加樣器套筒內，必須注意：壓放按鈕時保持平穩(wěn)；加樣器不得倒轉；吸頭中有液體時不可將加樣器平放。6.每天開始工作之前應檢查移液器的外表面是否有灰

4、塵或污物，若有則小心抹去。操作人員 部門主管 質量負責人姓名 楊晉紅 王雅萍 楊晉紅日期 05年01月03日洗板機的標準操作程序（SOP）實驗室名稱項 目編 號制定日期*洗板機的標準操作程序（BI0-RAD）*年*月*日【目的】規(guī)范洗板機的操作程序，保證洗板機的正常狀態(tài)?！具m用范圍】本實驗室洗板機的操作?！静僮魅藛T】本實驗室實驗人員?！静僮鞑襟E】1.拔掉廢液瓶口的塞子（接有與洗板機相連的廢液管），倒掉廢液瓶的廢液，再把塞子安緊在廢液瓶口上。注意不要讓廢液管擰勁，以保證廢液管的通暢。2.擰開洗液瓶的蓋子（接有與洗板機相連的洗液管），倒掉前一天洗液瓶里剩余的洗液，倒進新配的洗液。擰緊蓋子，注意不要

5、讓洗液管擰勁，以保證洗液管的通暢。3.保證待洗反應板所有的孔處于同一水平位置，以免孔邊緣過高碰到洗板機的吸液針。4.插上電源，打開電源開關（按后面板POWER鍵），出現(xiàn)如下界面：SELECT: RUN IN YES OUT5.按“OUT”鍵，載板臺彈出。將待洗反應板放在載板臺上。6.按“YES”鍵后再按或鍵以選擇相應程序，然后按再“YES”鍵，此時屏幕顯示“LAST STRIP 12”。LAST STRIP 12 YES ESC7.再按或鍵以選擇待洗板條的數(shù)目。然后按“YES”鍵即可。RUN： P01 STRIP 12 YES ESC8.清洗完成后，重新出現(xiàn)4的界面。拿下已洗好的反應板，按“I

6、N”鍵，載板架彈進。再按后面板POWER鍵關閉電源。9.若中途退出，按“ESC”鍵。【洗板機的維護保養(yǎng)】1.平常不用時，拔掉電源插頭。2.每天洗板機工作結束時，要對內外其進行清潔，用濕抹布擦洗洗板機的外壁及載物臺，以保證其潔凈。用蒸餾水將所有的管道清洗一遍，防止洗液的結晶堵塞管道。3.及時倒棄廢液，以免廢液瓶過滿致使廢液回流而造成洗板機的故障。4.保證待洗的反應板的孔邊緣不要過高且水平，以免造成吸液針損傷。5.定期將洗液及廢液管道拆卸下來進行沖洗，以保證管道的通暢?！揪幹葡礈斐绦颉?. 插上電源，打開電源開關（按后面板POWER鍵），出現(xiàn)如下界面：SELECT: RUN IN YES OUT按

7、“”“”鍵使RUN變成EDIT后按“YES”鍵進入如下界面：SELECT: EDIT IN YES OUT然后，根據(jù)自己的需要選擇適合的洗滌方式，一般選擇整板洗滌且8孔模式，每一洗滌循環(huán)包括吸液（根據(jù)自己的需要設定吸液的速度）、注水（根據(jù)自己的需要設定注水量）、再吸液（根據(jù)自己的需要設定吸液的速度）三步，設定5或6個循環(huán)即可。編程完成后，按EXIT回到1的界面。操作人員 部門主管 質量負責人姓名 * * *日期 *年*月*日 酶標儀的標準操作程序（SOP）實驗室名稱項 目編 號制定日期*酶標儀的標準操作程序*年*月*日【目的】規(guī)范儀器設備的操作程序，保證酶標儀的正常狀態(tài)?！具m用范圍】本實驗室加

8、樣器的操作?！静僮魅藛T】：本實驗室實驗人員。【操作步驟】：1. 插上電源，打開電源開關（按后面板POWER鍵），出現(xiàn)如下界面：Th 01 Jan 00：00Measure此時按“”或“”鍵可選擇Measure或quick及其它操作（如編程、查找前面的測試結果等）。若通過標準曲線進行定量檢測的項目用Measure；若只是需要反應的光密度值，則用quick。2.在1的界面時，按面板上的“”鍵彈出載物臺。3.將待測板放置于載物臺上4.按“ENTER”鍵后再按“”或“”鍵以選擇待測項目的相應程序（每個通道存放的程序已由本室人員根據(jù)試劑盒的要求事先輸入）。Select Test 1項目名稱5.連按“EN

9、TER”鍵3次即可。6.打開打印機電源，放上A4紙，打印出測試結果。7.測試完畢后，若Measure測試則酶標儀自動彈出載物臺；若quick測試則需按面板上的“”鍵彈出載物臺。拿下測試完的反應板，再按“”鍵將載物臺彈進酶標儀內。8.關閉酶標儀及打印機電源?！久笜藘x的維護保養(yǎng)】1.平常不用時，拔掉電源插頭。2.使用完畢，一定要拿下測試完的反應板，千萬不要將反應板留在載物臺上，并且要把載物臺彈進酶標儀內。3.若有液體濺到載物臺或酶標儀外壁，應用濕抹布及時擦去。4.每次使用完畢用濕抹布擦拭酶標儀，以保持其潔凈。【編制測試程序】1. 插上電源，打開電源開關（按后面板POWER鍵），出現(xiàn)如下界面：Th

10、01 Jan 00：00Measure2.此時按“”或“”鍵可進入如下界面Th 01 Jan 00：00test data3.按ENTER 確認這個選擇，再按“”或“”鍵可進入如下界面test datadefine4.按ENTER 確認這個選擇，再按“”或“”鍵選擇程序號，并按。ENTER 確認。Select test define test test name輸入實驗名稱，利用”或“”鍵選擇所需參數(shù)。 define test filter 此指令用于進入測試濾光片和參比濾光片的波長。確定所虛波長后，按EXIT鍵返回此界面，再利用”或“”鍵進入如下界面：define test shanking

11、此指令用于選擇振搖時間、方式和位置。確定需求后，按EXIT鍵返回此界面，再利用”或“”鍵進入如下界面：define test layout此指令用于定義盤孔分布及輸入各標準品相應濃度。本室一般把標準品定義在反應板的第一列。確定需求后，按EXIT鍵返回此界面，再利用”或“”鍵進入如下界面：define test eval mode此指令用于選擇被執(zhí)行的報告方式，定性、定量或其他報告方式。確定需求后，按EXIT鍵返回此界面，再利用”或“”鍵進入如下界面：define test validations校驗公式，此指令用于檢查結果是否正確。確定需求后，按EXIT鍵返回此界面，再利用”或“”鍵進入如下界

12、面：define test exict按此鍵退出,編程結束。操作人員 部門主管 質量負責人姓名 * * *日期 *年*月*日 HBsAg 檢測的標準操作程序實驗室名稱 項目 編號制定日期* ELISA方法* *年*月*日【目的】保證檢測結果準確可靠.【該SOP變動程序】本標準操作程序的變動，可由任一使用本SOP的工作人員提出，并報經下述人員批準簽字：專業(yè)主管、科主任?！緲吮镜牟扇『捅４妗侩S機靜脈血2ml，分離血清備用。也可使用血漿標本進行檢測。標本宜新鮮，無污染，避免無溶血，避免反復凍融，不可用NaN3防腐?！静僮鞒绦颉?1實驗準備：從冷藏環(huán)境中取出試劑盒，在室溫下平衡30分鐘，同時將濃縮洗滌

13、液作1:20稀釋。 2加待測標本：加入待測標本每孔0.05毫升，并設HBsAg陽性對照2孔，HBsAg陰性對照2孔，空白對照1孔。 3加酶結合物：每孔0.05毫升，空白對照孔不加，充分混勻，置37孵育30分鐘。 4洗 板：1)手工洗板：棄去反應板條孔內液體拍干；用洗滌液注滿每孔，靜置510秒，棄去孔內洗滌液拍干，如此反復5次，拍干。2)洗板機洗板：選擇洗滌5次的程序洗板，最后拍干。5加顯色劑：先加顯色劑A，每孔0.05毫升；再加顯色劑B，每孔0.05毫升；充分混勻，放置37避光孵育15分鐘。6終止反應：每孔加入終止液0.05毫升，混勻。7測定：用酶標儀讀數(shù)，可選擇唯波長450nm(以空白孔校零

14、)或雙波長450630nm，讀取各孔OD值?！窘Y果判斷】 Cutoff值計算：COV=陰性對照平均OD值×2.1 標本OD值>COV為陽性，標本OD值<COV為陰性 注：陰性對照OD值低于0.05作0.05計算，高于0.05按實際OD值計算?！咀⒁馐马棥?1試劑使用前應搖勻，并棄去1-2滴后垂直滴加，注意均勻用力。 2從冷藏環(huán)境中取出的試劑盒應置室溫平衡30分鐘再進行測試，余者應及時封存，置冰箱內貯藏備用。 3洗板時所用的吸水紙請勿反復使用。 4不同批號試劑請勿通用。 5結果判斷須在10分鐘內完成。 6封片不能重復使用。 7用本試劑盒應視為有傳染性物質，請按傳染病實驗室檢

15、查規(guī)程操作。操作人員 部門主管 質量負責人姓名 * * * 日期 *年*月*日 免疫學檢驗室內質量控制的標準操作程序實驗室名稱項目編號制定日期*ELISA方法*年*月*日【目的】保證ELISA檢測結果準確可靠, 充分發(fā)揮其方法學的優(yōu)點?！驹揝OP變動程序】本標準操作程序的變動，可由任一使用本SOP的工作人員提出，并報經下述人員批準簽字：專業(yè)主管、科主任。【方法】【分析前質控】1. 人員培訓 實驗是人操作的，因此檢驗人員需經過培訓，熟練掌握本專業(yè)如下幾方面的技術知識：1 檢驗項目的基本原理 （ELISA原理）；2 臨床意義；3 熟悉檢測技巧，了解易出差錯的環(huán)節(jié)及難點；4 熟悉檢測試劑性能（包括試

16、劑盒組成，包被片段及其組成）；5 熟悉檢測儀器的原理及性能；掌握數(shù)據(jù)處理的能力和質量控制知識。6 某些特殊項目的檢測如抗HIV等需經有關部門組織的專門培訓班，考試合格后持證上崗。2. 室內質控血清的制備：1 收集陽性血清(無明顯溶血、黃膽、脂肪血和污染血清,到一定量（夠本室使用3-6個月的量）；2 傳染性病毒陽性需經56、10小時滅活后使用；3 過濾，除纖維沉淀物；4 稀釋，用正常人血清或10%小牛血清PBS溶液稀釋；5 測定值，與定值參考品進行對比、求值，一般定在Cut Off值附近的陽性值；6 分裝小瓶（每日用量），加蓋、貼簽，-20凍存?zhèn)溆谩驹噭┖羞x擇】衛(wèi)生部規(guī)定乙肝試劑，丙肝試劑，艾滋

17、病試劑，梅毒試劑及血型試劑必須使用經衛(wèi)生部生物制品檢定所檢定合格，并貼有防偽標簽的產品?！驹噭┖性u價】試劑評價需要有權威的血清考核盤（Panel）進行檢測，價格昂貴，操作繁瑣，一般實驗室不易開展，可以通過以下信息，了解試劑質量。1.根據(jù)該試劑生物制品鑒定所的批批檢定報告，了解其質量水平，按照質量計劃選擇靈敏度高的或特異性高的試劑；2.通過詢問試劑包被物的組成，如原料來源（基因工程或合成多肽），片段的組合（按比例混合或化學合成），片段的長短等判斷試劑的優(yōu)劣；3.參考室間質評報告中對試劑的評價結果，了解不同試劑的質控成績。4.根據(jù)權威部門發(fā)布的試劑評價結果，了解市場上試劑的質量優(yōu)劣?！緝x器質控】為

18、使儀器保持最佳工作狀態(tài)應建立維護和校正儀器的標準操作程序（SOP），所要控制的儀器包括移液器（加樣槍），水浴箱（溫箱），洗板機和酶標儀。1.移液器：ELISA加樣量?。?-100l），其準確性直接影響實驗結果，利用稱重法檢查：吸取刻度指示量的水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準確，一般應在±10%以內；2.水浴箱：經常檢查水浴箱溫度計所示的溫度和水中（或溫箱內）實測溫度是否一致，允許有±1的誤差；3.洗板機：每個廠家設置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過2ul ，人工扣板時，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞；4.酶標儀：經常維護其光學部分，防止濾光片霉變，定期檢測校正，使其

19、保持良好的工作性能。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%。酶標儀的可測范圍視各酶標儀的性能而不同。普通的酶標儀在0.0002.000，新型號的酶標儀上限拓寬達2.900，甚至更高。超出可測上限的A值常以"*"或"over"或其它符號表示。應注意可測范圍與線性范圍的不同，線性范圍常小于可測范圍，比如某一酶標儀的可測范圍為0.0002.900，而其線性范圍僅0.0002.000，這在定量ELISA中制作標準曲線時應予注意?！久笜?/p>

20、儀校正程序】1.濾光片波長精度檢查：將不同波長的濾光片從酶標儀上卸下，用UV-2201型紫外-可見分光光度計（波長精度±0.3nm）于可見光區(qū)對每個濾光片進行掃描，其檢測值與標定值之差為濾光片波長精度。一般酶標儀無585nm濾光片，可選用550nm或630nm濾光片。450nm 濾光片的檢定選用普魯蘭溶液（校正波長為630nm）。2.通道差與孔間差檢測：通道差檢測是取一只酶標板小孔杯（杯底須光滑，透明，無污染以酶標板架作載體， 將其（內含200ul甲基橙溶液吸光度調至0.500A左右）置于8個通道的相應位置，蒸溜水調零，于490nm處連續(xù)測三次,觀察其不同通道的檢測器測量結果的一致性

21、，可用極差值來表示?？组g差的測量是選擇同一廠家，同一批號酶標2板條（8條共96孔）分別加入200ul甲基橙溶液（吸光度調至0.100A左右）先后置于同一通道，蒸溜水調零,于490nm處檢測，其誤差大小用±1.96s衡量。3. 零點飄移（穩(wěn)定性觀察）：取8只小孔杯分別置于8個通道的相應位置，均加入200ul蒸餾水并調零，于490nm處每隔30分鐘測一次，觀察各個通道4小時內吸光度的變化。4.精密度評價：每個通道3只小杯分別加入200ul高中低3種不同濃度的甲基橙溶解，蒸餾水調零，于490nm作雙份平行測定，每日測二次（上下午各一次），連續(xù)測定20天。分別計算其批內精密度，日內批精密度,

22、日間精密度和總精密度及相應的CV值。5.線性測定：用電子天平精確稱取甲基橙配制5個系列的溶液，于490nm平行測8次，取其均值。計算其回歸方程，相關系數(shù)及標準估計誤差s，并用±1.96s表示樣品測量的誤差范圍.雙波長測定評價：取一分甲基橙溶液，分別加入3種不同濃度的溶血液（測定波長為490nm，校正波長為585nm），先后于8個通道檢測，每個通道測3次，比較各組之間是否具有統(tǒng)計學差異，以考察雙波長消除干擾組分的效果?！緲吮镜牟杉捅４妗?.標本采集時應盡量避免溶血，因紅細胞破裂可釋放過氧化物酶活性物質干擾立可讀方法的結果，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本會增加非特異性顯色造

23、成假陽性。2.長菌的標本同樣的道理也易產生假陽性，因菌體中可能含有內源性HRP也會產生假陽性反應。3.抗凝不完全的標本因纖維蛋白元的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是不使用用肝素抗凝劑。4.標本在冰箱中保存時間過長易導致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深，一般血清置4冰箱5天內完成測試。如需保存一周以上則要-20冰凍保存，凍結血清融解后，蛋白質局部濃縮，分布不均，融解時應上下顛倒充分混勻，同時避免氣泡?？缮舷骂嵉够旌?，不要在混勻器上強烈振蕩。反復凍融會使抗體效價跌落，如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。5. ELISA的靈敏度>1ng/ml水平上,標本間的污染要盡量避免，尤其

24、不應與生化試驗用同一管標本。 【分析中質控】ELISA實驗的結果受操作影響很大，每個步驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標儀讀數(shù)均應認真負責才能充分發(fā)揮ELISA的高靈敏，強特異的優(yōu)點。因此,應建立實驗項目的標準操作程序(SOP)。1. 加樣1 加樣應用微量移液器（加樣槍）按規(guī)定的量加入微孔板底部，避免加在孔壁上部，不可濺出，不可產生氣泡。2 每次加樣應更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發(fā)生交叉污染;干吸頭預先在血清中抽吸三次。3 樣本稀釋，目的是為了減少非特異性反應，所以一定要先加稀釋液后加樣本，特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘，同時注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時均需

25、振蕩混勻。4 如用滴瓶滴加試劑應先將滴瓶搖勻并擠去第一滴有氣泡的試劑后加樣。2. 溫育1 抗原抗體反應需要在一定溫度下（37°C），經過一定的時間才能達到反應的平衡點2 ELISA邊緣效應是由溫育形成的。所以溫育一般采用能使反應液溫度迅速達到平衡的水浴法。水要浸至板條的1/3處。3 反應板不宜疊放，注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定控制，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。 3. 洗滌1 手工洗滌一般采用浸泡方法：1）甩去孔內反應液； 2）用洗滌液過洗一遍（即注滿孔后即甩去）；3）微孔重新注滿洗液后浸泡2-3分鐘，間歇搖動；4）甩去孔內液體，拍板，用紙吸干。重復以上操作至少5次。注意

26、各種試劑盒的洗滌液盡量不要混用。2 洗板機洗板一定要預先把板架放平，使洗板機上的每個放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底，將孔內液體全部吸干，同時要設置一定的浸泡時間。如出現(xiàn)機洗后拍板有較多殘留液時應再用手工洗2次以上。關機前要用蒸溜水沖洗管道，避免堵孔。4. 顯色1 HRP催化底物的一步呈色反應，同樣需要一定的時間和溫度，2 一定要按照說明書規(guī)定的時間溫度（一般為37°C，10-15分鐘）恒定反應后終止3 或根據(jù)臨界值質控血清吸光度值達0.2左右使的時間而恒定反應時間.5. 酶標儀判讀結果1.顯色反應終止后應立刻比色（30分鐘內）。2.常見的顯色系統(tǒng)有OPD和TMB二種，以后者最為常見

27、，而TMB酸不易終止因此必須盡快比色以免影響結果。OPD終止后顯棕色，測定波長為490nm；TMB終止后顯黃色，測定波長為450nm，二種底物的校正波長均用630nm。3.使用雙波長的優(yōu)點可以消除反應板條上的劃痕手印的干擾。同時要注意反應板應用紙吸干后才能置酶標儀中比色，否則吸光度易出現(xiàn)負值或損壞濾光片?！痉治龊筚|控】【報告方式】1.定性試驗：國內外為便于統(tǒng)一計算，一律按S/COV方式報告，S為標本A值，COV即Cut Off值（或COV）1 夾心法和間接法以S/COV1為陽性；競爭法與中和法以S/COV1為陽性2 COV的計算公式以試劑盒說明書的為準常見的有：A） COV=2.1×

28、N（當N不足0.05時按0.05計），此公式由P/N>2.1換算而來，常用于夾心法。B） COV=0.5×N，從抑止率公式換算而來，常用于競爭，中和法。C） COV=N+C（C為常數(shù)），用于間接法。D) COV=C×P+N（C為常數(shù)），用于間接法。此公式最客觀，但對廠家要求很高，陰陽性對照測定值要基本恒定。2.定量分析：嚴禁用定性試劑盒做定量分析。1 用已知量的系列標準品，繪制標準曲線，結果以絕對量或單位表示。ELISA的標準曲線每次都要和待測標本做在同一塊板上。2 現(xiàn)有的ELISA定量試劑盒標準曲線只有在較窄的濃度范圍內成直線，要得到精確的結果實屬不易?！居涗洝?1

29、 所有實驗的原始資料均應存檔；所有的記錄均應規(guī)范登記在冊；原始登記表應記錄試劑來源、批號；質控血清的來源及測定值并注明是否在控；簽上實驗者姓名及審核者姓名。2 如試驗結果對臨床診斷有決定意義，其樣本應保留，至少與病歷保存期一致【定性試驗】ELISA定性試驗的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無關，因此QC要保證試驗的靈敏度和特異性。生化的質控圖方法僅能觀察靈敏度而無法監(jiān)控特異性。建議使用臨界值血清界定法：將試劑盒所設的陰陽性對照作為內對照指示反應；另設臨界值、高值質控血清，正常人血清作為外對照，與標本同時檢測，臨界值S/C.O1，高值質控血清S/C.O10，正常人血清A值在0.050.07之

30、間。陽性質控血清失控（臨界值為靈敏度，高值為"HOOK"效應監(jiān)控）應重做陰性標本；陰性對照失控應重做陽性標本。以表格式記錄每塊板的外對照實驗結果，作為QC資料存檔?！径吭囼灐縀LISA定量試驗常見于腫瘤因子（如AFP，CEA，CA系列），激素類，免疫球蛋白類，這些物質在體內有一定的量（正常范圍），超出這個量才呈病理情況，故需定量測定。定量試驗的質控方法可參考生化方式。 【"即刻性"質控】在開始進行質控時，只需要有3個質控血清測定值即可進行質控。當這組數(shù)據(jù)擴大到20次有效值時就可以計算RCV的X，s。方法：1. 先將測定值從小到大排列，X1最小，Xn最大

31、；2.計算X和s；3.計算SI上限值和下限值。SI上=（X最小-X）/S， SI下=（X最大-X）/S4.對照SI表，檢查是否出控，SI上、下限規(guī)定值，在控；SI上或下限>規(guī)定值，失控。操作人員 部門主管 質量負責人姓名 * * * 日期 *年*月*日 免疫學檢驗室間質量評價的標準操作程序（EQA）實驗室名稱項目編號制定日期*ELISA方法*年*月*日【目的】采用一系列的辦法連續(xù)地、客觀地評價各實驗室的試驗結果，并發(fā)現(xiàn)室內質控不易發(fā)現(xiàn)的不準確性，了解各實驗室之間結果的差異，并幫助校正，使具有可比性?！驹揝OP變動程序】本標準操作程序的變動，可由任一使用本SOP的工作人員提出，并報經下述人

32、員批準簽字：專業(yè)主管、科主任?！净靖拍睢俊举|量控制】是監(jiān)視ELISA操作全過程，排除誤差，維持標準化操作的一個管理過程。這一過程是通過一個反饋環(huán)路進行的：1.確定控制的對象；2.規(guī)定控制對象的標準（預期值）；3.制定或選擇控制方法和手段；4.測量實際數(shù)據(jù)；5.比較或較對實際數(shù)據(jù)與預期值之間的差異，并說明原因。超出預定誤差范圍，報警系發(fā)出信號，反饋通道中斷。6.采取行動，解決差異?；謴驮瓲睿ㄔ瓨藴薁顟B(tài)）的手段發(fā)揮作用。質量控制主要采用質控圖進行。質控圖是把某一檢驗的性能數(shù)據(jù)與所計算出來的預期的"控制限"進行比較的圖。這種性能數(shù)據(jù)是在按規(guī)程正常進行時，按時間順序而抽選出來的，

33、其目的是檢測檢驗過程中變異的可追查性原因?？勺纺嫘缘恼`差原因，是指除去隨機誤差以外的其他原因。在GLP概念里QC即指IQC，其定義為：由實驗室工作人員采取一定的方法和步驟，連續(xù)評價本室工作的可靠性，旨在監(jiān)測和控制本室常規(guī)工作的精密度，提高批內批間樣本檢驗的一致性，以確定檢驗報告是否可靠或可否發(fā)出的一項工作。免疫測定方法的靈敏度和特異性要比生化方法高得多，因此QC手段不能照搬生化模式。【灰區(qū)概念】把定量分析的正常值范圍引入定性分析建立灰區(qū)概念，即將COV值上下的一段區(qū)域定為陽性可疑，需重復實驗或換試劑重測以確定其陰陽性，如仍落在灰區(qū)范圍內則報告+（陽性）?；覅^(qū)概念對血站系統(tǒng)的獻血員篩查尤為重要。

34、灰區(qū)的設置有二種：1.COV×（1±CV）， CV為該試劑的批內CV (一般在15-20%間)；2.COV±2s，s為實驗室做室內質控ROC的s?！靖咧点^鐮效應（HD-HOOK）】在二位點夾心ELISA中，其劑量反應曲線的高劑量（HIGH DOSE，HD）區(qū)段，線性走向不是呈平臺狀無限后延，而是向下彎曲狀，似一只鉤子或一把鐮刀（HOOK），MILES（1974）根據(jù)此現(xiàn)象寫實性地稱之為"HD-HOOK"效應。產生該現(xiàn)象的分子機理有"分子變構說"和"濃度效應"等推論。一步法和二步法均存在"HD-H

35、OOK"效應，只是前者出現(xiàn)的更早些，大多數(shù)是高值低吸光度，很少陰性結果?！举|量控制血清】質控血清是已有靶值的血清，在每次的常規(guī)檢驗中加入一份或數(shù)份，通過所得結果來了解本次檢驗的情況。質控血清檢驗的結果如能控制其誤差在一定范圍內，就說明該檢驗沒有發(fā)生不允許的誤差。如果出現(xiàn)超過允許誤差范圍的異常結果，提示該檢驗不合格，應尋找原因，糾正后，重檢待測標本。因此質控血清在質控工作中起重要作用。衛(wèi)生部臨床檢驗中心制備的乙肝標志物質控血清，可以在-20保持半年定值不變。冰凍狀態(tài)融化使用時，應先混勻，未用完部分可在4保存5天。不宜反復冰融或自行分裝。開展某項檢驗的室內質控工作需要的質控血清，一般按3

36、-6個月用量準備。自制的不定值質控血清，在一批質控血清將用完之前，需準備下一批質控血清。質控血清要求性能穩(wěn)定，較長期內效價不變，其理化性質應與病人樣本相近，這樣才能有效地起到監(jiān)測作用。質控制血清分定值和未定值兩種。如只用一份質控血清定值，一般定在正常值與異常值交界點上，定性測定時處于弱陽性水平，稱為臨界值。乙肝標志物臨界值的制定，應按臨床要求，為臨床提供統(tǒng)一的判斷弱陽性的標準。 臨界值質控血清可以作為試劑盒中的陽性對照品和陰性對照品以外的第三個對照品，它可以靈敏地反映出試劑盒的檢出水平，確保弱陽性反應的標本不漏檢。質控血清的制備，每個實驗室可以根據(jù)自己的條件，選用臨床中心提供的質控血清，或按以

37、下方法自己制備本室使用的質控血清（以乙肝質控血清為例）。1. 收集新鮮的無溶血、無黃疸、無細菌污染的陽性血清。2. 56加熱10小時滅活。3. 離心或過濾除去沉淀。4. 用10%的小牛血清或正常人血清（PBS緩沖液）將收集的血清稀釋至所需的濃度。如能用正常的人血清稀釋更好，因其成份更接近于檢測標本。5. 抽濾除菌。按一次使用的量分裝小安瓿，封口，20保存?zhèn)溆?。不可反復凍融。被檢物要求檢出的水平常被認為是質控血清應選擇的水平。如果該試驗還有其它要求，則應加所要求濃度的質控物。6. 標定含量。20-30次測定結果刪除>±2SD數(shù)據(jù)的均值作為靶值，并與已知定值血清對比測定?！臼议g質評

38、的方法】1.發(fā)質控物進行調查，這是目前國內外常見的形式，采用定期發(fā)放質控物至各實驗室，各實驗室在規(guī)定的日期進行檢驗，并將結果報至組織者（部、省臨檢中心）。組織者通過統(tǒng)計分析，再將評價結果寄回實驗室，使其了解工作質量，發(fā)現(xiàn)問題，提高質量。其缺點為由于各實驗室吃小灶或互相打電話修改結果而達不到真正評價作用。這是國內外室間質評的常用形式。部臨檢中心對乙肝標志物ELISA檢驗的室間質評采用定期發(fā)放質控物至各實驗室，各實驗室在規(guī)定的日期進行檢驗，并將檢驗結果報至部臨檢中心。部臨檢中心經統(tǒng)計分析，將評價結果寄回各實驗室。通過評價，各實驗室了解本室工作質量，發(fā)現(xiàn)差距，并設法改進，以不斷提高檢驗質量。 這種評

39、價方式有一定缺點，即各實驗室常對質控物特殊對待，在檢驗時選用特殊試劑盒，選派特別的技術員進行檢驗，有的實驗室互相和對結果并作修改。這就使EQA的結果不能反映該實驗室日常工作水平。2.現(xiàn)場調查，事先不通知，臨時派出人員到各實驗室，規(guī)定采用常規(guī)方法，檢測一組標本，進行評價。這種方法可以解決實際問題，進行現(xiàn)場指導，組織者常因人力、物力的原因而不能經常性進行。派觀察員到實驗室進行試劑調查，這種調查事先不通知，臨時派觀察員到實驗室，指定采用常規(guī)方法，檢驗規(guī)定的一組標本，進行評價?！境煽冇嬎惴椒ā?.定性試驗：檢驗結果與預期結果一致，得100分，錯誤不得分，總計實驗室的得分。從全部參評單位的得分中求出該批

40、質控物平均分（X）和標準差（s），再通過公式計算出每一個實驗室的得分比值（SI） SI=（實驗室得分-平均分X）/平均標準差（s），SI在0.0-0.9間為良好,1.0-1.9間為優(yōu)秀,SI為負值時數(shù)值越大成績越差。2.定量試驗：SI=（實驗室測定值-預期值X）/預期值的標準差s，SI越小，表明越靠近靶值，成績越好。0-1.0為優(yōu)秀,1.1-2.0為良好,>2.0為差。SI無正負之分?！举|量改進（Quality Improvement，QI）】質量改進的建議來源于三方面：1.室內質控：提示實驗的精密度差，應規(guī)范各項操作；2.室間質評：提示實驗的準確性差，應改進設備的準備或更換試劑；3.病

41、人或醫(yī)生的報怨：提示實驗的偶然誤差，應分析實驗的質控過程是否達標。操作人員 部門主管 質量負責人姓名 * * * 日期 *年*月*日 免疫金標記檢測方法標準操作程序實驗室名稱項目編號制定日期*年*月*日【目的】保證免疫金標技術檢驗準確性【本SOP適用范圍】免疫金標技術【該SOP變動程序】本標準操作程序的變動，可由任一使用本SOP的工作人員提出，并報經下述人員批準簽字：專業(yè)主管、科主任。【原理】氯化金分子在還原劑作用下聚合形成金顆粒，顆粒與顆粒之間因靜電作用而相互排斥，使其保持一個比較穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱作膠體金。利用膠體金顆粒的高電子密度及其表面能結合生物大分子(如抗體、SPA、植物血凝素和刀

42、豆蛋白A等)以 及具有一定顏色等特性，可用光鏡和電鏡對細胞內抗原進行定位、定性的研究?！痉椒▽W分類】1. 班點金免疫滲濾試驗 固相膜免疫測定中液體在微孔膜中穿過流出呈穿流形式，為斑點金免疫滲濾試驗(dot immunogold filtration assay，DIGFA)，亦有稱免疫金溶膠斑點法、滴金免疫測定法等。試驗單位為三層反應盒，第一層為過濾器(濾紙層)，第二層為反應膜(NC膜或MC膜)上點加有特異性抗原或抗體，第三層為吸水墊料，有稱此滲濾裝置為滴金反應板。以雙抗體夾心法測dsDNA為例：試驗中將標本加在反應盒上，血清(標本)透過過濾層進入反應層，反應層上點有“一”字形抗IgG(或某種

43、人血清蛋白作為試驗陽性對照)及“”形被測物相應抗體，血清中抗原與反應層中抗體結合，其余無關蛋白等濾出膜片，加入金標記抗體試劑，反應膜上“一”字形及“”形均顯紅色為試驗陽性，僅“一”形顯紅色為試驗陰性(試劑盒狀態(tài)良好)，“一”不顯色提示試劑盒質量不合格，需另取反應盒重做試驗。試劑盒基本試劑成分有滴金反應板、金標記試劑及洗滌液。2. 斑點金免疫層析試驗 固相膜免疫測定中液體通過毛細管作用在膜上向前移行呈橫流形式，為斑點金免疫層析試驗(dotimmunogoldchromatographyassay，DIGCA)。試驗單位為一濾膜條，自上而下分有多個層次。如單克隆雙抗體法測HCG，濾膜條各區(qū)域分別為

44、：吸水濾紙固定有金標二抗的MC膜固定有抗-HCG抗體的MC膜金標記抗。-HCG玻璃纖維吸尿玻璃纖維。試驗中將濾膜條浸入被測尿液或滴加尿液，尿液在毛細管作用下向試紙條上端緩緩移行，尿液將金標抗。-HCG溶解并帶動它向前移動，結合尿中HCG至抗-HCG抗體處形成復合物，并在抗-HCG抗體固定處顯示膠體金特有紅色，提示試驗陽性。尿中無HCG時，溶解的抗-HCG至固定有金標二抗的MC膜處顯示膠體金特有紅色(質控線條)，提示試驗陰性。試劑盒基本單位僅有一濾膜條，只有一步操作。3. 膠體金顆粒的制備在氯化金溶液中加入不同的還原劑，可制備出不同大小的金顆粒。常采用檸檬酸、抗壞血酸和白磷。用這三種還原劑可分別

45、制備出大、中、小三種主要膠體金顆粒。目前，有更多的實驗室僅以檸檬酸為還原劑，在檸檬酸還原氯化金時，加入不同量的單寧酸即可獲得大小不同的金顆粒，所制備金顆粒的大小非常一致。1 以抗壞血酸為還原劑制備1015nm直徑的膠體金(Au l5) 在一個洗凈烤干的250 ml容量的三角燒瓶中，加入20ml三蒸去離子水(3DW)、l ml 0.1 mol/L K2CO3和l ml氯化金水溶液于冰浴中混勻，立即加入l ml 0.7 抗壞血酸，并充分搖動至溶液呈紫紅色，加3DW至100ml，100水浴5min后，溶液變成紅色，放室溫冷卻待用。2 以檸檬酸為還原劑制備810 nm直徑的膠體金(Au l0) 125

46、 ml 3 DW煮沸后加入1 檸檬酸7.5 ml，再煮沸5 min，迅速加入1.25 ml氯化金溶液，100水浴15 min，溶液置室溫待用。3 以檸檬酸為還原劑制備56 nm直徑膠體金(Au 6) 將l ml氯化金加入100 ml 3DW中煮沸，快速加進245ml檸檬酸單寧酸的混合液(2 ml 1 檸檬酸三鈉、0.45 ml 1 單寧酸)，繼續(xù)煮沸5 min，放室溫待用。4 白磷為還原劑制備5 nm直徑的膠體金(Au 5) 將120 ml 3DW、1.5 ml氯化金和2.7 ml 1 mol/L K2CO3，混合，緩慢攪拌中快速加進l ml白磷一乙醚溶液，室溫輕攪拌15 min，100水浴3

47、0 min后放室溫待用。膠體金制備一般需在中性pH(7.2左右)條件下進行，也可在稍偏酸或稍偏堿的環(huán)境中進行。制備的膠體金其大小和形狀可在電鏡下觀察確定。一般膠體金溶液呈紅葡萄酒顏色，大顆粒膠體金是紫紅色。正常情況下，膠體金溶液應清澈而不含任何可見的沉淀或漂浮物，如溶液、試劑、瓶皿等不干凈。將造成如下結果：第一不能獲得預期大小的膠體金顆粒，第二將影響到下一步生物大分子的吸附過程和包被后膠體金的穩(wěn)定性。因此，為了獲得滿意的膠體金，應選擇最純凈的各有關試劑和液體。如有條件，所有試劑最好經過超過濾處理，以除去其中的分子聚合體和可能混入的雜質塊。制備過程中所用的水以三蒸去離子水最合適，各類器皿均應嚴格

48、清洗，盛膠體金的瓶皿先經過硅化則更為理想。膠體金顆粒在吸附生物大分子之前具有一定的穩(wěn)定性，4可存放一周左右，如果經超過濾和透析處理后加0.002 疊氮鈉，能保存5個月左右。4. 膠體金和生物大分子的結合任何蛋白質都能結合到膠體金顆粒表面，膠體金和蛋白質結合后，并不影響蛋白質的反應性。1生物大分子的準備 鹽類成分能影響膠體金的吸附能力，并使膠體金顆粒發(fā)生聚集，因此，生物大分子在包被金顆粒前，常需透析，使溶液無鹽或鹽的濃度極低，常用的透析液為0.003ml/L NaCI。2膠體金顆粒的包被 以生物大分子包被膠體金顆粒時，首先需要確定其精確用量，即蛋白質完全包被膠體金所需蛋白質的最小劑量。因為過多或過少地結合生物大分子均可使膠體金呈不穩(wěn)定狀態(tài)，它們的最佳濃度可通過如下方法獲得。制備好的膠體金以0.1mol/L K2CO3，調pH至6.2(SPA的等電點)待與SPA結合。用一個滴定盤或一排小試管，以0.005mol/L NaCl連續(xù)稀釋50µl SPA(1mgm1)至第十孔或第十管為止。然后，分別于每孔中加入250µ1的膠體金，5min后再加入250µ1 10 NaCl，l min后震蕩試管，這時SPA濃度較低的孔中，膠體金由紅色變?yōu)樽仙f明SPA的量不足以包