保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌相互作用的研究

1、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌相互作用的研究摘要：探討了嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌之間的相互作用（拮抗和共生效果），指出這兩個菌種的許多菌株在代謝過程中會產(chǎn)生過氧化氫、細(xì)菌素等抑菌性物質(zhì)，導(dǎo)致嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌間表現(xiàn)出非協(xié)同生長的現(xiàn)象。在此基礎(chǔ)上，建立了評價發(fā)酵劑之間相互作用的新的指標(biāo)體系，旨在方便優(yōu)良酸奶發(fā)酵劑菌種的篩選工作。關(guān)鍵字：嗜熱鏈球菌；保加利亞乳桿菌；共生；拮抗0 引言普通酸奶發(fā)酵劑是由保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌共同制備的，兩菌種之間的共生作用已被廣泛認(rèn)可。然而，近年來的大量研究表明，保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌之間存在不協(xié)同生長的現(xiàn)象。鑒于酸奶最終質(zhì)量的好壞與酸奶發(fā)酵劑密切相關(guān)

2、，重新討論二者之間的相互關(guān)系，探索影響二者之問協(xié)同生長的各種因素，生產(chǎn)中就能因勢利導(dǎo)，控制其維持良好的比例狀態(tài)，提高酸奶產(chǎn)品的最終質(zhì)量。此外，加強(qiáng)保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌兩者關(guān)系的研究，對于研制穩(wěn)定高效的直投式酸奶發(fā)酵劑也是極為有益的。本文對保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌問的相互作用的機(jī)理作了探討，特別是對考察兩菌種間相互關(guān)系的檢測方法作了重點評述，并建立了評價酸奶發(fā)酵劑優(yōu)劣的指標(biāo)體系，以期為篩選出適用于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良菌株提供重要的科學(xué)依據(jù)。1 兩者之間的相互影響1.1 共生作用眾所周知，與兩者單獨培養(yǎng)相比，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合培養(yǎng)后的產(chǎn)酸速度非?？?，因為混合培養(yǎng)過程將促進(jìn)兩者維持更

3、好的生長（見圖 1）。1950 年，Pette 等人首次證實保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳中的無菌過濾物可以促進(jìn)嗜熱鏈球菌的生長。進(jìn)一步的研究指出，刺激嗜熱鏈球菌生長的這種過濾物中富含氨基酸。其后 orlaJensn 等的研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)熱處理的乳可以加速保加利亞乳桿菌的產(chǎn)酸過程，因為熱處理的乳中含有甲酸鈉，甲酸鈉可以促進(jìn)保加利亞乳桿菌的生長。，由于甲酸來源于加熱處理過程中乳糖的分解，所以，人們在很長一段時間中忽略了嗜熱鏈球菌在促進(jìn)保加利亞乳桿菌生長中的作用。事實上，在無氧或氧含量很低的情況下，嗜熱鏈球菌能代謝產(chǎn)生一些促進(jìn)保加利亞乳桿菌生長的化合物，從而提高保加利亞乳桿菌的酸化活力。Veringa 等”研究

4、發(fā)現(xiàn)，嗜熱鏈球菌刺激保加利亞乳桿菌生長的促進(jìn)物質(zhì)是甲酸。Higashio 等舊 l 發(fā)現(xiàn)，除甲酸是必需的生長刺激物外，丙酮也能夠刺激保加利亞乳桿菌的生長，而且其它有機(jī)酸可以取代丙酮酸的這一作用效果。由于乳酸菌能夠利用這些有機(jī)酸并形成丙酮酸，所以其他有機(jī)酸對保加利亞乳桿菌的生長也有一的促進(jìn)作用。大量的實驗證實，在酸奶菌種混合培養(yǎng)過程中，甲酸并不是促進(jìn)保加利亞乳桿菌生長的唯一物質(zhì)晨如在乳中生長時嗜熱鏈球菌可產(chǎn)生 CO,CO 能在一定程度上刺激酸奶發(fā)酵劑中保加利亞乳桿菌的生長|4J。Raiagopal 等？研究發(fā)現(xiàn)，九株嗜熱鏈球菌菌株與保加利亞乳桿菌的混合培養(yǎng)物在蛋白質(zhì)水解活性上存在良好的協(xié)同作用，

5、結(jié)果如表 1 所示。培養(yǎng)時 fnJ/h 一LB:-口一 St:-LB+ST圖 1 保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌（單獨或混合）的酸化活力（42C）1.2 拮抗作用近年來的研究表明，盡管嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌兩個種之間存在協(xié)同共生作用，但并非所有的菌株之間都是共生的。事實上，它們的菌株之間仍然存在不同程度的拮抗抑制作用。Vinderola 和 Moc-chivittil6I 研究了嗜熱鏈球菌無細(xì)胞發(fā)酵液對保加利亞乳桿菌菌株的生長狀況的影響。結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)液中含有嗜熱鏈球菌無細(xì)胞發(fā)酵液時，保加利亞乳桿菌菌株 Dbl,Eb3,Eb4 和 Hb2 等的生長受到明顯的抑制，而 Abl 和 Ab 酒個菌

6、株受到的抑制較弱。他們進(jìn)一步考察了保加利亞乳桿菌無細(xì)胞發(fā)酵液對嗜熱鏈表 l 巴氏脫脂消毒奶中嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌的水解蛋白活性及生長狀況pH 值酪氨酸/（mgL-1）Lb1St*發(fā)酵劑 0h2h4h0h2h4h0h2h4h0h2h4hLBRl+STCRl56.606.225.27011.552.96.206.747.186.577.9l8.85LBCRl4+STCRl46.606.065.09029.6117.86.536.907.006.647.919.00LBCH3+STCH36.606.104.8208.1140.25.806.958.115.767.948.79注：培養(yǎng)條件為 4

7、 小時，42C；為活菌數(shù)用對數(shù)（lg）表示，單位 mI,-1,球菌菌株生長的影響。 結(jié)果表明， 嗜熱鏈球菌菌株 175 和 Dcl 的生長明顯受到保加利亞乳桿菌無細(xì)胞發(fā)酵液的抑制。在實驗的 64x,l 菌株組合中，僅有 12 對菌株間存在共生作用，即 80%的嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌菌株間存在拮抗作用。這些實驗數(shù)據(jù)反映了嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌的某些菌株之間的確存在拮抗抑制作用，它們之問不可能表現(xiàn)出協(xié)同生長的能力（結(jié)果見表 2）Bielecka 和 MajkaowskaI71 在研究了 366 對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌菌株間的協(xié)同生長后發(fā)現(xiàn)，僅有下列 8 對菌株間（7046 和 608

8、6,151 和 MC10,BI 和 Bsbg 和 As,Cl 和 Cs,IBI和 IBs,ZBL 和 ZBs 以及 Db,和 T。M）存在協(xié)同共生作用，即保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌菌株間的非協(xié)同生長的比例為97.9%。表 2 嗜熱鏈球菌對保加利亞乳桿菌生長的影響嗜熱鏈球保加利亞乳桿菌菌株菌菌株 Ab1Bb1Cb1Db1Eb3bEb4Cb1Hb2A4-+-A5-+-+A10-+-+A3-+-+175+XXXXX+X176-+-+Cc1+Dc1+XXXXX+X注：x 為完全抑制；+為部分抑制；一為沒有影響。1引起協(xié)同生長不平衡的因素除以乳酸作為最終代謝產(chǎn)物外，乳酸菌還能夠產(chǎn)生細(xì)菌素、其他形式的有機(jī)

9、酸、H:O:、乙醇和羅伊氏素（Feuterin）等多種抑菌物質(zhì)。這些抑菌物質(zhì)不僅能控制食品腐敗菌和病原菌的生長和存活，延長食品的貨架期，而且對近緣相關(guān)的種或菌株也有生長抑制作用。近年來，有關(guān)乳酸菌細(xì)菌素的研究報道較多，細(xì)菌素是一類具有生物活性的多肽或蛋白類物質(zhì)，具有抑制近緣相關(guān)種或菌株的效果。長期以來，人們在研究生長抑制因素時很少關(guān)注德氏乳桿菌所產(chǎn)生的抑制物質(zhì)和效果，因而傳統(tǒng)上德氏乳桿菌是與嗜熱鏈球菌搭配用于乳品的發(fā)酵生產(chǎn)。Miteva 等在對大量分離獲得的德氏乳桿菌菌株產(chǎn)細(xì)菌素能力的研究表明，德氏乳桿菌菌株代謝生成細(xì)菌素是一種普遍現(xiàn)象。VandeGuchte 和 Ehrlich 的研究也指出

10、，德氏乳桿菌可以產(chǎn)生除乳酸外的多種抑菌物質(zhì)，包括過氧化氫和細(xì)菌素等生長抑制因素。Vinderola 等 16I 最近的調(diào)查表明， 德氏保加利亞乳桿菌對嗜熱鏈球菌菌株表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用。 顯然，當(dāng)保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌共同培養(yǎng)時，這些生長抑制因子的存在勢必會干擾兩種菌的協(xié)同效果，導(dǎo)致生長不平衡出現(xiàn)。2.1過氧化氫的效果vandevoorde 等認(rèn)為許多乳桿菌、鏈球菌和片球菌都能代謝產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫抑菌作用主要來源于它能夠產(chǎn)生更多的有活性的、對細(xì)胞具有毒素作用的羥基。另外，Monnom等認(rèn)為過氧化氫可以導(dǎo)致鉀離子泄漏，抑制氨基酸和碳水化合物的吸收，達(dá)到抑菌的目的。當(dāng)?shù)率先樗崛闂U菌和德氏

11、保加利亞乳桿菌無細(xì)胞發(fā)酵液中的過氧化氫達(dá)到（510）x10-6時，金黃色葡萄球菌的生長受到顯著的抑制。保加利亞乳桿菌產(chǎn)生的過氧化氫對具有益生作用的乳酸菌有抑制作用。VandeGuchte等的研究發(fā)現(xiàn)，添加過氧化氫酶到保加利亞乳桿菌菌株 V11007 的無細(xì)胞發(fā)酵液中，就可以消除其對嗜熱鏈球菌的抑制作用，特別是添加過氧化氫酶后可以使嗜熱鏈球菌表現(xiàn)出高的生長速率，而且提高了最終菌體的細(xì)胞數(shù)量。此外，即便是對保加利亞乳桿菌物細(xì)胞發(fā)酵液加熱（100C）處理 15min,也不能緩解其對鏈球菌的抑制作用。這個實驗證明，保加利亞乳桿菌對嗜熱鏈球菌的抑制作用與過氧化氫的存在有關(guān)。2.2細(xì)菌素的效果將細(xì)菌素分為

12、三類：羊毛硫細(xì)菌素；小分子量熱穩(wěn)定性的非羊毛硫細(xì)菌素；大分子量熱敏感性蛋白質(zhì)。細(xì)菌素的殺菌作用是通過干擾能量生成、大分子化合物的生物合成、膜的運(yùn)輸和滲透作用而實現(xiàn)的。目前，乳酸菌細(xì)菌素的抑菌機(jī)制有兩種：羊毛硫素型，即在一定的膜電位下，羊毛硫型細(xì)菌素能吸附于感受菌的細(xì)胞膜上，侵入膜內(nèi)形成通透孔道，允許分子量為 0.5ku 的親水溶液通過并導(dǎo)致鉀離子從細(xì)胞內(nèi)流出，細(xì)胞膜失去極化，ATP 世漏，細(xì)胞自溶而死亡；非羊毛硫素型，該類型的細(xì)菌素也是在細(xì)胞膜上形成一個親水孔道，但這個親水孔道是經(jīng)膜上特定的受體蛋白介導(dǎo)的，與膜電位無關(guān)。它的主要作用是破壞膜功能的穩(wěn)定性（如能量傳導(dǎo)），而不是破壞膜結(jié)構(gòu)的完整性”

13、。由于細(xì)菌素是對與產(chǎn)生菌親緣關(guān)系較近的菌株具有抑菌活性的蛋白類物質(zhì)，所以，認(rèn)為嗜酸乳桿菌對德氏乳酸桿菌的抑制作用主要與細(xì)菌素物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)。研究表明，乳桿菌之間的生長抑制作用是由細(xì)菌素引起的，這種細(xì)菌素屬于熱穩(wěn)定的、小分子量的非羊毛硫多肽物質(zhì)。研究證實，嗜熱鏈球菌能夠產(chǎn)生細(xì)菌素；同樣也指出，保加利亞乳桿菌可以產(chǎn)生細(xì)菌素，細(xì)致研究了保加利亞乳桿菌菌株 V11005 與德氏乳桿菌菌株V11007 之問的相互關(guān)系。他們指出，當(dāng)在菌株 V11005 的培養(yǎng)液中添加菌株 V11007 無細(xì)胞發(fā)酵液后，42c 培養(yǎng) 4h 時，菌株V11005 的活菌數(shù)較培養(yǎng)開始時下降了 1000 倍，24h 后的活菌數(shù)為

14、 0;而 V11005 菌株對照組的活菌數(shù)培養(yǎng) 4h 后增加了 40 倍（見表 3）。進(jìn)一步的工作表明，V11007 菌株的無細(xì)胞表 3VI1005 生長在經(jīng)蛋白酶處理的 VI1007 的無細(xì)胞發(fā)酵液中的平板計數(shù)結(jié)果注：德氏保加利亞乳桿菌；嗜熱鏈球菌；模式菌株。發(fā)酵液經(jīng) 70100c 處理 15rain 后，可以消除其對菌株 VI1005 的殺菌作用，但 50c 的加熱處理并不影響其殺菌效果。如果用蛋白酶處理菌株 V11007 的無細(xì)胞發(fā)酵液，則可以緩解德氏乳桿菌 V11007 無細(xì)胞發(fā)酵液對保加利亞乳桿菌 V11005 的殺菌作用，這意味著菌株 V11007 無細(xì)胞發(fā)酵液的抑菌物質(zhì)屬于蛋白類

15、成分（見表 4）。表 4 經(jīng)蛋白酶處理后的 V11007株無細(xì)胞發(fā)酵液對 V11005株生長的影響處理Tc/ml-1T4/m1-1MRS3.0 x10352.6X10MRS+”-胰凝乳蛋白酶3.6X1031.4X105SB2.7x1033.0SB30min 在 37C5.8X1031.0SB+a-胰凝乳蛋白酶3.0 x1032.0X103注：分別指培養(yǎng)時問為 T0,和 T4時的活細(xì)胞數(shù)。在此基礎(chǔ)上，他們討論了嗜熱鏈球菌 CNRN302 菌株 VI1007 無細(xì)胞發(fā)酵液存在下的生長情況。 結(jié)果表明， 鏈球菌菌株 CNRN302 生長明顯受至 IJ 抑制， 特別是添加對數(shù)期的德氏乳桿菌 V1100

16、7的無細(xì)胞發(fā)酵液的抑制效果要大于延遲期，而電種抑制效果既便是加入過氧化速酶也不能被消除.顯然，除了 HQ 的抑制效果外，嗜熱鏈球菌 CNRN30 的生長抑制也與菌株VI1007 無細(xì)胞發(fā)酵液中存在的其他物質(zhì)有關(guān)。，在對菌株 V11007 的無細(xì)胞發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮并使其通過 50ku 的濾膜，截留到的無細(xì)胞發(fā)酵液對嗜熱鏈球菌 CNRN302 有殺菌效果。相反，通過 100ku 濾膜所截留到的菌株 VI1007 無細(xì)胞發(fā)酵液對菌株 CNRN302 生長具有強(qiáng)烈的抑制效果。這表明菌株 VI1007 的無細(xì)胞發(fā)酵液中具有殺菌作用的蛋白類物質(zhì)的分子量變化相：50100ku 之間。.鑒于這種具有殺菌作用

17、的蛋白物質(zhì)的分子最處在 50100ku 之間，且具有不耐熱的特性，所以按乳酸蔭細(xì)菌素分類標(biāo)準(zhǔn)，將它們的蛋白物質(zhì)歸結(jié)為大分子量的熱敏感型的細(xì)菌素。這類細(xì)菌素是由染色體基因編碼，編碼區(qū)中存在兩個完整的開放的讀碼框 ORF 和 ORF2 如由瑞士乳桿菌481 產(chǎn)生的屬于此類細(xì)菌素，研究表明，當(dāng)保加利亞乳桿菌菌株 Lb.Abl 的無細(xì)胞發(fā)酵液存在時，嗜熱鏈球菌菌株 St.A10 的生長完全受到抑制，抑制作用的原因也是因為無細(xì)胞發(fā)酵液存在細(xì)菌素類物質(zhì)。3 評價拮抗作用的方法有機(jī)酸抑菌實驗分析由于有機(jī)酸具有殺菌作用，為了證明這種抑菌作用不是由于有機(jī)酸的存在而發(fā)生的，需用的 NaO 的液調(diào)整無細(xì)胞發(fā)酵液的

18、pH 值到 6.57.0 之間，消除有機(jī)酸的影響，然后，利用中和后的抑制菌發(fā)酵液作拮抗試驗，判斷是否存在其他抑菌物質(zhì)。過氧化氫酶試驗為了確定過氧化氫的抑菌效果，可將待定菌株（保加利亞乳桿菌或嗜熱鏈球菌）的無細(xì)胞發(fā)酵液調(diào)整至 pH 中性后，加入過氧化氫酶（質(zhì)量濃度為 5mL）38c 反應(yīng) 1h,然后與未經(jīng)處理的發(fā)酵液（對照）一起作交叉拮抗試驗，判斷待定菌株產(chǎn)生的物質(zhì)是否為過氧化氫。蛋白類抑菌物質(zhì)的確定為了判斷菌株是否產(chǎn)生蛋白類抑菌物質(zhì)，試驗中可將待定菌株的無細(xì)胞發(fā)酵液 pH整至中性，并分裝到 Eppendorf 管中，然后向發(fā)酵液中添加蛋白酶酶液（如蛋白酶 K、胰蛋白酶、胃蛋白酶、d 一胰凝乳蛋白酶等），混勻，