脂質(zhì)體的制備及包封率的測(cè)定

1、脂質(zhì)體的制備及包封率的測(cè)定脂質(zhì)體的制備及包封率的測(cè)定 鄧意輝鄧意輝沈沈 陽(yáng)陽(yáng) 藥藥 科科 大大 學(xué)學(xué) 藥藥 學(xué)學(xué) 院院 一、一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握薄膜分散法制備脂質(zhì)體的工藝。2、掌握用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂測(cè)定脂質(zhì)體包封率的方法。3、熟悉脂質(zhì)體形成原理，作用特點(diǎn)。4、了解“主動(dòng)載藥” 與“被動(dòng)載藥” 的概念。 二、二、 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 脂質(zhì)體是由磷脂與(或不與)附加劑為骨架膜材制成的，具有雙分子層結(jié)構(gòu)的封閉囊狀體。 常見(jiàn)的磷脂分子結(jié)構(gòu)中有兩條較長(zhǎng)的疏水烴鏈和一個(gè)親水基團(tuán)。將適量的磷脂加至水或緩沖溶液中，磷脂分子定向排列，其親水基團(tuán)面向兩側(cè)的水相，疏水的烴鏈彼此相對(duì)締和為雙分子層，構(gòu)成脂質(zhì)體。

2、 用于制備脂質(zhì)體的磷脂有天然磷脂，如大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂等；合成磷脂，如二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿等。常用的附加劑為膽固醇。膽固醇也是兩親性物質(zhì)，與磷脂混合使用，可制得穩(wěn)定的脂質(zhì)體，其作用是調(diào)節(jié)雙分子層的流動(dòng)性，降低脂質(zhì)體膜的通透性。其他附加劑有十八胺、磷脂酸等，這些附加劑能改變脂質(zhì)體表面的電荷性質(zhì)，從而改變脂質(zhì)體的包封率、體內(nèi)外穩(wěn)定性、體內(nèi)分布等其他相關(guān)參數(shù)。 脂質(zhì)體的制備方法有多種，根據(jù)藥物的性質(zhì)或研究需要來(lái)進(jìn)行選擇。 (1)薄膜分散法 這是一種經(jīng)典的制備方法，它可形成多室脂質(zhì)體，經(jīng)超聲處理后得到小單室脂質(zhì)體。此法優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)典型，但包封率較低。 (2)注入法

3、有乙醚注入法和乙醇注入法等。“乙醇注入法”是將磷脂等膜材料溶于乙醇中，在攪拌下慢慢滴于55-65含藥或不含藥的水性介質(zhì)中，蒸去乙醇，繼續(xù)攪拌12h，即可形成脂質(zhì)體。 （3）逆相蒸發(fā)法 系將磷脂等脂溶性成分溶于有機(jī)溶劑，如氯仿、二氯甲烷中，再按一定比例與含藥的緩沖液混合、乳化，然后減壓蒸去有機(jī)溶劑即可形成脂質(zhì)體。該法適合于水溶性藥物、大分子活性物質(zhì)，如胰島素等的脂質(zhì)體制備，可提高包封率。 其他方法：冷凍干燥法 、熔融法 等。 在制備含藥脂質(zhì)體時(shí)，根據(jù)藥物裝載的機(jī)理不同，可分為“主動(dòng)載藥” 與“被動(dòng)載藥”兩大類(lèi)。所謂“主動(dòng)載藥”，即通過(guò)脂質(zhì)體內(nèi)外水相的不同離子或化合物梯度進(jìn)行載藥，主要有K+-Na

4、+梯度和H+梯度(即pH梯度)等。傳統(tǒng)上，人們采用最多的方法是“被動(dòng)載藥”法。所謂“被動(dòng)載藥”，即首先將藥物溶于水相或有機(jī)相(脂溶性藥物)中，然后按所選擇的脂質(zhì)體制備方法制備含藥脂質(zhì)體，其共同特點(diǎn)是：在裝載過(guò)程中脂質(zhì)體的內(nèi)外水相或雙分子層膜上的藥物濃度基本一致，決定其包封率的因素為藥物與磷脂膜的作用力、膜材的組成、脂質(zhì)體的內(nèi)水相體積、脂質(zhì)體數(shù)目及藥脂比(藥物與磷脂膜材比)等。 對(duì)于脂溶性的、與磷脂膜親和力高的藥物，“被動(dòng)載藥”法較為適用。而對(duì)于兩親性藥物，其油水分配系數(shù)受介質(zhì)的pH值和離子強(qiáng)度的影響較大，包封條件的較小變化，就有可能使包封率有較大的變化，首選“主動(dòng)載藥” 方法。 下圖為“主動(dòng)載

5、藥”中pH梯度法載藥原理示意圖H+H+DDDH+DH+insideacid pHoudsideneutral pH 評(píng)價(jià)脂質(zhì)體質(zhì)量的指標(biāo)有粒徑、粒徑分布和包封率等。其中脂質(zhì)體的包封率是衡量脂質(zhì)體內(nèi)在質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。常見(jiàn)的包封率測(cè)定方法有分子篩法、超速離心法、超濾法等。本文采用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂法測(cè)定包封率?！瓣?yáng)離子交換樹(shù)脂法”是利用離子交換作用，將荷正電的未包入脂質(zhì)體中的藥物(即游離藥物)，如本實(shí)驗(yàn)中的游離小檗堿，通過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附除去，包封于脂質(zhì)體中的藥物(如小檗堿)，由于脂質(zhì)體荷負(fù)電荷，不能被陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附，從而達(dá)到分離目的，用以測(cè)定包封率。示意圖見(jiàn)下圖。Na+ SO-3Na+ S

6、O-3Na+ SO-3Na+ SO-3Ber +Ber +Ber +Ber +Ber 三、三、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 （一）（一） 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備 1.實(shí)驗(yàn)材料：鹽酸小檗堿、注射用大豆卵磷脂、膽固醇、無(wú)水乙醇、95乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、NaHCO3、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。 2.實(shí)驗(yàn)設(shè)備與儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、燒瓶、恒溫水浴鍋、磁力攪拌器、吸耳球、光學(xué)顯微鏡、玻璃棉、5ml注射器筒、08 m微孔濾、紫外分光光度儀、溶量瓶等。 （二）實(shí)驗(yàn)部分（二）實(shí)驗(yàn)部分1 1空白脂質(zhì)體的制備（用于測(cè)定柱分離度用）空白脂質(zhì)體的制備（用于測(cè)定柱分離度用）【處方】 注射用大豆卵磷脂 0.9g

7、 膽固醇 0.3g 無(wú)水乙醇 2-20m1 磷酸鹽緩沖液 適量 制成約30m1脂質(zhì)體 【制備】 （1）磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制 稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）0.37g與磷酸二氫鈉（NaH2PO42H2O）2.0g,加蒸餾水適量，溶解并稀釋至1000ml（pH約為5.7）。 （2）稱取處方量磷脂、膽固醇于100ml（也可以是250ml、500ml或1000ml ）燒瓶中，加無(wú)水乙醇1-2ml（根據(jù)情況可以加10ml或20ml ），置于65-70水浴中，攪拌使溶解，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)，使磷脂的乙醇液在壁上成膜，減壓除乙醇，制備磷脂膜。 （3）另取PBS 30ml于小燒杯中，同置于

8、65-70水浴中，保溫，待用。 （4）取預(yù)熱的PBS 30ml，加至含有磷脂膜的燒瓶中，65-70水浴中攪拌水化10-20min。取出脂質(zhì)體液體于燒杯中，置于磁力攪拌器上，室溫下，攪拌30-60min，如果溶液體積減少，可補(bǔ)加水至30m1，混勻，即得。（整個(gè)過(guò)程也可在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上完成，其它的脂質(zhì)體制備也可在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上完成。） （5）取樣，在油鏡下觀察脂質(zhì)體形態(tài)，畫(huà)出所見(jiàn)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，記錄最多和最大的脂質(zhì)體的粒徑；隨后將所得脂質(zhì)體溶液通過(guò)0.8m微孔濾膜兩遍，進(jìn)行整粒，再于油鏡下觀察脂質(zhì)體的形態(tài)，畫(huà)出所見(jiàn)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，記錄最多和最大的脂質(zhì)體粒徑。 【注意事項(xiàng)】 (1)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中禁止用火。 (

9、2)磷脂和膽固醇的乙醇溶液應(yīng)澄清，不能在水浴中放置過(guò)長(zhǎng)時(shí)間。磷脂和膽固醇的比例可以采用4：1或5：1或6：1，如果磷脂和膽固醇的質(zhì)量不好，建議采用6：1 。 (3)磷脂、膽固醇形成的薄膜應(yīng)盡量薄。 (4)60-65水浴中攪拌水化10-20min時(shí)，一定要充分保證所有脂質(zhì)水化，不得存在脂質(zhì)塊。2 2鹽酸小檗堿脂質(zhì)體的制備（被動(dòng)載藥法）鹽酸小檗堿脂質(zhì)體的制備（被動(dòng)載藥法） 【處方】 注射用豆磷脂 0.6 g 膽固醇 0.2 g 無(wú)水乙醇 2-20m1 鹽酸小檗堿溶液(1mgm1) 30ml 制成30ml脂質(zhì)體 【制備】被動(dòng)載藥法被動(dòng)載藥法 (1)鹽酸小檗堿溶液的配制 稱取適量的鹽酸小檗堿溶液，用磷

10、酸鹽緩沖液配成 lmgml和3mgm1兩種濃度的溶液。 (2)鹽酸小檗堿脂質(zhì)體的制備 按處方量稱取豆磷脂、膽固醇置于100ml燒瓶中，加無(wú)水乙醇，余下操作除將PBS換成鹽酸小檗堿溶液外，同“空白脂質(zhì)體制備”，即得“被動(dòng)載藥法 ”制備的小檗堿脂質(zhì)體。 【質(zhì)量檢查】觀察粒子形態(tài)，最大粒徑與最多粒徑，藥物的包封率。 【注意事項(xiàng)】同前。3 3鹽酸小檗堿脂質(zhì)體的制備（主動(dòng)載藥法）鹽酸小檗堿脂質(zhì)體的制備（主動(dòng)載藥法） 【空白脂質(zhì)體處方】 注射用豆磷脂 0.9 g 膽固醇 0.3 g 無(wú)水乙醇 2-20 m1 檸檬酸緩沖液 30 ml 制成約30ml脂質(zhì)體 【制備】主動(dòng)載藥法主動(dòng)載藥法 （1）空白脂質(zhì)體制備

11、 稱取磷脂0.9g和膽固醇0.3g，加入無(wú)水乙醇，置于65-70水浴中，攪拌使溶解，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)，使磷脂的乙醇液在壁上成膜，減壓除乙醇。加入同溫的檸檬酸緩沖液30ml，6570水浴中水化10-20min ，取出脂質(zhì)體于燒杯中，余下操作同“1 1空白脂質(zhì)體的制備空白脂質(zhì)體的制備” 。 （2）主動(dòng)載藥 準(zhǔn)確量取空白脂質(zhì)體2.0ml、藥液(3mgm1) 1.0m1、NaHCO3溶液0.5m1，在振搖下依次加入10ml西林瓶中，混勻，蓋上塞，70水浴中保溫20min（定時(shí)搖動(dòng)），隨后立即用冷水降溫，即得。 【注意事項(xiàng)】 (1) “主動(dòng)載藥”過(guò)程中，加藥順序一定不能顛倒，加三種液體時(shí)，隨加隨搖，確

12、?；旌暇鶆?，保證體系中各部位的梯度一致。 (2)水浴保溫時(shí)，應(yīng)注意隨時(shí)輕搖，只需保證體系均勻即可，無(wú)需劇烈振搖。 (3)用冷水冷卻過(guò)程中，應(yīng)輕搖。 【質(zhì)量檢查】觀察粒子形態(tài)，最大粒徑與最多粒徑，藥物的包封率。 【附注】 （1）檸檬酸緩沖液 稱取檸檬酸10.5g和檸檬酸鈉7g置于1000ml量瓶中，加水溶解并稀釋至1000ml，混勻，即得。 （2）NaHCO3溶液 稱取NaHCO3 50g，置于1000ml量瓶中，加水溶解并稀釋至1000m1，混勻，即得。4 4鹽酸小檗堿脂質(zhì)體包封率的測(cè)定鹽酸小檗堿脂質(zhì)體包封率的測(cè)定 （1）陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離柱的制備 取已處理好的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂適量，裝于底部已墊

13、有少量玻璃棉（或多孔墊片）的5ml注射器筒中（總量約4ml刻度處），加入PBS水化過(guò)的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，自然滴盡PBS，即得。 （2）柱分離度的考察 鹽酸小檗堿與空白脂質(zhì)體混合液的制備：精密量取3mgm1鹽酸小檗堿溶液0.1ml，置小試管中，加入0.2ml空白脂質(zhì)體，混勻，即得。 對(duì)照品溶液的制備：取中制得的混合液0.1ml置10ml量瓶中，加入95乙醇6ml，振搖使之溶解，再加PBS至刻度，搖勻，過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液4.0ml于10ml量瓶中，加PBS至刻度，搖勻，即得。 樣品溶液的制備：取中制得的混合液0.1m1至分離柱頂部，待柱頂部的液體消失后，放置5min，仔細(xì)加入PBS(注意不能

14、將柱頂部離子交換樹(shù)脂沖散)，進(jìn)行洗脫(約需2-3ml PBS)，同時(shí)收集洗脫液于10m1量瓶中，加入95乙醇6ml，振搖使之溶解，再加PBS至刻度，搖勻，過(guò)濾，棄取初濾液，取續(xù)濾液為樣品溶液。 空白溶劑的配制：取乙醇(95) 30ml，置50m1量瓶中，加PBS至刻度，搖勻，即得。 吸收度的測(cè)定：以空白溶劑為對(duì)照，在345nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定樣品溶液與對(duì)照品溶液的吸收度，計(jì)算柱分離度。分離度要求大于0.95。 柱分離度 = 1A樣/（A對(duì)2.5） 式中，A樣樣品溶液的吸收度；A對(duì)對(duì)照品溶液的吸收度；2.5對(duì)照品溶液的稀釋倍數(shù)。 注意：在進(jìn)行柱分離度實(shí)驗(yàn)前，需要用空白脂質(zhì)體對(duì)分離小柱進(jìn)行飽和，具體操作如下：量取0.2ml空白脂質(zhì)體，置于分離小柱頂部，待柱頂部的液體消失后，仔細(xì)用5mlPBS進(jìn)行洗脫，待液體滴盡即可。 （3）包封率的測(cè)定 精密量取鹽酸小檗堿脂質(zhì)體0.lml兩份，一份置10ml量瓶中，按柱分離度考察項(xiàng)下進(jìn)行操作，另一份置于分離柱頂部，按 “柱分離度考察”項(xiàng)下進(jìn)行操作，所得溶液于345nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，按下式計(jì)算包封率。 包封率()=（ Al /At ）100 式中，Al通過(guò)分離柱后收集脂質(zhì)體中鹽酸小檗堿的吸收度；At鹽酸小檗堿脂質(zhì)體中總的藥物吸收度， At = A樣2.5 ，2.5為稀釋倍數(shù)。脂質(zhì)體檢