微生物實(shí)驗(yàn)課件全部

1、實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和人體表面微生物的檢查人體表面微生物的檢查一、目的要求一、目的要求1 1證明實(shí)驗(yàn)室環(huán)境與體表存在微生物證明實(shí)驗(yàn)室環(huán)境與體表存在微生物2 2體會(huì)無(wú)菌操作的重要性體會(huì)無(wú)菌操作的重要性3 3比較來(lái)自不同場(chǎng)所與不同條件下細(xì)菌的比較來(lái)自不同場(chǎng)所與不同條件下細(xì)菌的數(shù)量和類型數(shù)量和類型4 4、觀察不同類群微生物的菌落特征、觀察不同類群微生物的菌落特征 二、基本原理二、基本原理 n取自不同來(lái)源的樣品接種于平板培養(yǎng)基上，在取自不同來(lái)源的樣品接種于平板培養(yǎng)基上，在3737下培養(yǎng)下培養(yǎng)1 12 2天，每一菌體即能通過(guò)繁殖形天，每一菌體即能通過(guò)繁殖形成一個(gè)可見(jiàn)的細(xì)胞群體的集落成一個(gè)

2、可見(jiàn)的細(xì)胞群體的集落菌落。菌落。n每一種細(xì)菌所形成的菌落都有其特點(diǎn)，如菌落每一種細(xì)菌所形成的菌落都有其特點(diǎn)，如菌落的大小，表面干燥或濕潤(rùn)、隆起或扁平、粗糙的大小，表面干燥或濕潤(rùn)、隆起或扁平、粗糙或光滑，邊緣整齊或不整齊，菌落透明或半透或光滑，邊緣整齊或不整齊，菌落透明或半透明或不透明，顏色以及質(zhì)地疏松或緊密等。明或不透明，顏色以及質(zhì)地疏松或緊密等。n因此，可通過(guò)平板培養(yǎng)來(lái)檢查環(huán)境中細(xì)菌的數(shù)因此，可通過(guò)平板培養(yǎng)來(lái)檢查環(huán)境中細(xì)菌的數(shù)量和類型。量和類型。三、實(shí)驗(yàn)器材三、實(shí)驗(yàn)器材n培養(yǎng)基培養(yǎng)基 肉膏蛋白胨瓊脂平板肉膏蛋白胨瓊脂平板n溶劑和試劑溶劑和試劑 無(wú)菌水無(wú)菌水n儀器和其他用具儀器和其他用具 滅菌

3、棉簽（裝在試管滅菌棉簽（裝在試管內(nèi)），接種環(huán)，試管架，酒精燈或煤氣內(nèi)），接種環(huán)，試管架，酒精燈或煤氣燈，記號(hào)筆（或蠟筆），廢物缸。燈，記號(hào)筆（或蠟筆），廢物缸。n2 2實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌檢查實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌檢查（1 1）空氣）空氣 將一個(gè)肉膏蛋白胨瓊脂平將一個(gè)肉膏蛋白胨瓊脂平板放在當(dāng)時(shí)做實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室，移去皿板放在當(dāng)時(shí)做實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室，移去皿蓋，使瓊脂培養(yǎng)基表面暴露在空氣中；蓋，使瓊脂培養(yǎng)基表面暴露在空氣中；將另一肉膏蛋白胨瓊脂平板放在無(wú)菌將另一肉膏蛋白胨瓊脂平板放在無(wú)菌室或無(wú)人走動(dòng)的其他實(shí)驗(yàn)室，移去皿室或無(wú)人走動(dòng)的其他實(shí)驗(yàn)室，移去皿蓋。一小時(shí)后蓋上兩個(gè)皿蓋。蓋。一小時(shí)后蓋上兩個(gè)皿蓋。n1 1 標(biāo)記標(biāo)記 首先將

4、器皿用記號(hào)筆做上記號(hào)，首先將器皿用記號(hào)筆做上記號(hào)，培養(yǎng)培養(yǎng)皿的記號(hào)一般寫在皿底上。皿的記號(hào)一般寫在皿底上。 用記號(hào)筆寫上班級(jí)、姓名、日期及樣用記號(hào)筆寫上班級(jí)、姓名、日期及樣品來(lái)源。字盡量小些，寫在皿底的一品來(lái)源。字盡量小些，寫在皿底的一邊。邊。（b b）取棉簽）取棉簽 左手拿含有棉簽的試管，在火左手拿含有棉簽的試管，在火焰旁用右手的手掌邊緣和小指、無(wú)名指夾持焰旁用右手的手掌邊緣和小指、無(wú)名指夾持棉塞（或試管帽），將其取出（棉塞（或試管帽），將其取出（圖圖-2-2），），將管口很快地通過(guò)煤氣燈（或酒精燈）的火將管口很快地通過(guò)煤氣燈（或酒精燈）的火焰，燒灼管口；輕輕地傾斜試管，用右手的焰，燒灼管口

5、；輕輕地傾斜試管，用右手的拇指和食指將棉簽小心地取出（拇指和食指將棉簽小心地取出（圖圖-2-2）。）。放回棉塞（或試管帽）（放回棉塞（或試管帽）（圖圖-2-2），并將空），并將空試管放在試管架上。試管放在試管架上。 （c c）弄濕棉簽）弄濕棉簽 左手取滅菌水試管，如上左手取滅菌水試管，如上法拔出棉塞（或試管帽）并燒灼管口，法拔出棉塞（或試管帽）并燒灼管口，將棉簽插入水中，再提出水面，在管壁將棉簽插入水中，再提出水面，在管壁上擠壓一下以除去過(guò)多的水分，小心將上擠壓一下以除去過(guò)多的水分，小心將棉簽取出，燒灼管口，放回棉塞（或試棉簽取出，燒灼管口，放回棉塞（或試管帽），并將滅菌水試管放在試管架上。管

6、帽），并將滅菌水試管放在試管架上。（d d）取樣）取樣 將濕棉簽在實(shí)驗(yàn)臺(tái)面或門旋鈕將濕棉簽在實(shí)驗(yàn)臺(tái)面或門旋鈕上擦拭約上擦拭約2 2平方厘米的范圍。平方厘米的范圍。 （e e）接種）接種 按圖按圖-2-2在火焰旁用左手拇指在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿開(kāi)啟成一縫。再將棉和食指或中指使平皿開(kāi)啟成一縫。再將棉簽伸入，在瓊脂表面頂端接種（滾動(dòng)一下）簽伸入，在瓊脂表面頂端接種（滾動(dòng)一下）（圖圖-2-2），立即閉合皿蓋。并按），立即閉合皿蓋。并按圖圖-2-2將原放棉簽的空試管拔出棉塞（或試管將原放棉簽的空試管拔出棉塞（或試管帽），燒灼管口，插入用過(guò)的棉簽，將試帽），燒灼管口，插入用過(guò)的棉簽，將試管放

7、回試管架。管放回試管架。 （f f）劃線）劃線 另取接種環(huán)在火焰上滅菌，如另取接種環(huán)在火焰上滅菌，如圖圖-4-4，先將環(huán)端燒熱（，先將環(huán)端燒熱（圖圖-4-4，1 1），），然后將接種環(huán)提起垂直放在火焰上（然后將接種環(huán)提起垂直放在火焰上（圖圖-4-4，2 2），以使火焰接觸金屬絲的范圍），以使火焰接觸金屬絲的范圍廣一些，待接種環(huán)燒紅，再將接種環(huán)斜放，廣一些，待接種環(huán)燒紅，再將接種環(huán)斜放，沿環(huán)向上，燒至可能碰到培養(yǎng)皿的部分，沿環(huán)向上，燒至可能碰到培養(yǎng)皿的部分，再移向環(huán)端，如此很快地來(lái)回通過(guò)火焰數(shù)再移向環(huán)端，如此很快地來(lái)回通過(guò)火焰數(shù)次（次（圖圖-4-4，3 3）。）。 左手拿起平板，同樣開(kāi)啟一縫，將

8、滅過(guò)左手拿起平板，同樣開(kāi)啟一縫，將滅過(guò)菌并冷卻了的接種環(huán)（可在瓊脂表面邊菌并冷卻了的接種環(huán)（可在瓊脂表面邊緣空白處試溫度，若發(fā)出濺潑聲，表示緣空白處試溫度，若發(fā)出濺潑聲，表示太燙），通過(guò)瓊脂頂端的接種區(qū)，向下太燙），通過(guò)瓊脂頂端的接種區(qū)，向下劃線，直到平板的一半處（劃線，直到平板的一半處（圖圖-3-3，C C）。）。注意：接種環(huán)與瓊脂表面的角度要小，注意：接種環(huán)與瓊脂表面的角度要小，移動(dòng)的壓力不能太大，否則會(huì)刺破瓊脂。移動(dòng)的壓力不能太大，否則會(huì)刺破瓊脂。 閉合皿蓋，左手將平板向左轉(zhuǎn)動(dòng)至空白處，右閉合皿蓋，左手將平板向左轉(zhuǎn)動(dòng)至空白處，右手拿的接種環(huán)再在火焰上燒灼，使冷。接種環(huán)手拿的接種環(huán)再在火焰

9、上燒灼，使冷。接種環(huán) 通過(guò)前面劃的線條再在瓊脂的另一半，按通過(guò)前面劃的線條再在瓊脂的另一半，按圖圖-3 3，D D從上向下來(lái)回劃線至從上向下來(lái)回劃線至1 12 2處。處。 燒灼接種環(huán)，轉(zhuǎn)動(dòng)平板，按燒灼接種環(huán)，轉(zhuǎn)動(dòng)平板，按圖圖-3-3，E E，劃，劃最后最后1 14 4，立刻蓋上皿蓋，燒灼接種環(huán)，放回，立刻蓋上皿蓋，燒灼接種環(huán)，放回原處。原處。 整個(gè)劃線操作均要求無(wú)菌操作，即靠近火整個(gè)劃線操作均要求無(wú)菌操作，即靠近火焰，而且動(dòng)作要快。焰，而且動(dòng)作要快。n 3 3人體細(xì)菌的檢查人體細(xì)菌的檢查（1 1）手指（洗手前與洗手后）手指（洗手前與洗手后） （a a）分別在兩個(gè)瓊脂平板上標(biāo)明洗手前與洗手）分別

10、在兩個(gè)瓊脂平板上標(biāo)明洗手前與洗手后（當(dāng)然，班級(jí)、姓名、日期各項(xiàng)在每次寫標(biāo)后（當(dāng)然，班級(jí)、姓名、日期各項(xiàng)在每次寫標(biāo)簽時(shí)是必不可少的）。簽時(shí)是必不可少的）。（b b）移去皿蓋，將未洗過(guò)的手指在瓊脂平板的）移去皿蓋，將未洗過(guò)的手指在瓊脂平板的表面，輕輕地來(lái)回劃線，蓋上皿蓋。表面，輕輕地來(lái)回劃線，蓋上皿蓋。（c c）用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中沖洗）用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中沖洗干凈，干燥后，在另一瓊脂平板表面來(lái)回移動(dòng)，干凈，干燥后，在另一瓊脂平板表面來(lái)回移動(dòng)，蓋上皿蓋。蓋上皿蓋。（2 2）頭發(fā)）頭發(fā) 在揭開(kāi)皿蓋的瓊脂平板的上在揭開(kāi)皿蓋的瓊脂平板的上方，用手將頭發(fā)用力搖動(dòng)數(shù)次，使細(xì)方，用手將

11、頭發(fā)用力搖動(dòng)數(shù)次，使細(xì)菌降落到瓊脂平板表面，然后蓋上皿菌降落到瓊脂平板表面，然后蓋上皿蓋。蓋。（3 3）咳嗽）咳嗽 將去蓋瓊脂平板放在離口約將去蓋瓊脂平板放在離口約6 68cm8cm處，對(duì)著瓊脂表面用力咳嗽，處，對(duì)著瓊脂表面用力咳嗽，然后蓋上皿蓋。然后蓋上皿蓋。（4 4）鼻腔）鼻腔（a a）按照實(shí)驗(yàn)臺(tái)檢查法的步驟（）按照實(shí)驗(yàn)臺(tái)檢查法的步驟（b b）和）和（c c），取出棉簽，并將其弄濕。），取出棉簽，并將其弄濕。（b b）用濕棉簽在鼻腔內(nèi)滾動(dòng)數(shù)次。）用濕棉簽在鼻腔內(nèi)滾動(dòng)數(shù)次。（c c）按實(shí)驗(yàn)臺(tái)檢查法的步驟（）按實(shí)驗(yàn)臺(tái)檢查法的步驟（e e）和（）和（f f），），接種與劃線，然后蓋上皿蓋。接種與

12、劃線，然后蓋上皿蓋。 4 將所有的瓊脂平板翻轉(zhuǎn)，使皿底在上，放將所有的瓊脂平板翻轉(zhuǎn)，使皿底在上，放 37培養(yǎng)箱，培養(yǎng)培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12天。天。n5 5結(jié)果記錄方法結(jié)果記錄方法（1 1）菌落計(jì)數(shù)在劃線的平板上，如果菌落很多）菌落計(jì)數(shù)在劃線的平板上，如果菌落很多而重疊，則數(shù)平板最后而重疊，則數(shù)平板最后1/41/4面積內(nèi)的菌落數(shù)。面積內(nèi)的菌落數(shù)。不是劃線的平板，也一分為四，數(shù)不是劃線的平板，也一分為四，數(shù)1/41/4面積的面積的菌落數(shù)。菌落數(shù)。（2 2）根據(jù)菌落大小、形狀、高度、干濕等特征）根據(jù)菌落大小、形狀、高度、干濕等特征觀察不同的菌落類型。但要注意，如果細(xì)菌觀察不同的菌落類型。但要注意，如果細(xì)菌

13、數(shù)量太多，會(huì)使很多菌落生長(zhǎng)在一起，或者數(shù)量太多，會(huì)使很多菌落生長(zhǎng)在一起，或者限制了菌落生長(zhǎng)而變得很小，因而外觀不典限制了菌落生長(zhǎng)而變得很小，因而外觀不典型，故觀察菌落的特點(diǎn)時(shí)，要選擇分離得很型，故觀察菌落的特點(diǎn)時(shí)，要選擇分離得很開(kāi)的單個(gè)菌落。開(kāi)的單個(gè)菌落。n菌落特征描寫方法如下：菌落特征描寫方法如下：（a a）大?。┐笮?大、中、小、針尖狀?？上葘⒄蟆⒅?、小、針尖狀?？上葘⒄麄€(gè)平板上的菌落粗略觀察一下，再?zèng)Q定大、中、個(gè)平板上的菌落粗略觀察一下，再?zèng)Q定大、中、小的標(biāo)準(zhǔn)，或由教師指出一個(gè)大小范圍。小的標(biāo)準(zhǔn)，或由教師指出一個(gè)大小范圍。（b b）顏色）顏色 黃色、金黃色、灰色、乳白色、黃色、金黃色、

14、灰色、乳白色、紅色、粉紅色等。紅色、粉紅色等。（c c）干濕情況）干濕情況 干燥、濕潤(rùn)、粘稠。干燥、濕潤(rùn)、粘稠。（d d）形態(tài)）形態(tài) 圓形、不規(guī)則等。圓形、不規(guī)則等。 （e e）高度扁平、隆起、凹下。）高度扁平、隆起、凹下。（f f）透明程度）透明程度 透明、半透明、不透明。透明、半透明、不透明。（g g）邊緣）邊緣 整齊、不整齊。整齊、不整齊。 五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告菌落觀察菌落觀察六、思考題六、思考題 (1)(1)列舉列舉2 23 3類微生物，說(shuō)明類微生物，說(shuō)明他們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)條件下（肉膏蛋他們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)條件下（肉膏蛋白胨瓊脂平板，白胨瓊脂平板，3737）不能生）不能生長(zhǎng)。長(zhǎng)。（2 2）比較各

15、種來(lái)源的樣品，哪）比較各種來(lái)源的樣品，哪一種樣品的平板菌落數(shù)與菌落一種樣品的平板菌落數(shù)與菌落類型最多？為什么？類型最多？為什么？（3 3）人多的實(shí)驗(yàn)室與無(wú)菌室）人多的實(shí)驗(yàn)室與無(wú)菌室（或無(wú)人走動(dòng)的實(shí)驗(yàn)室）相比，（或無(wú)人走動(dòng)的實(shí)驗(yàn)室）相比，平板上的菌落數(shù)與菌落類型有平板上的菌落數(shù)與菌落類型有什么區(qū)別？你能解釋一下造成什么區(qū)別？你能解釋一下造成這種區(qū)別的原因嗎？這種區(qū)別的原因嗎？（4 4）比較洗手前后）比較洗手前后的手指平板，菌落的手指平板，菌落數(shù)有無(wú)區(qū)別？談?wù)剶?shù)有無(wú)區(qū)別？談?wù)勀愕捏w會(huì)。你的體會(huì)。（5 5）通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，）通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，在防止培養(yǎng)物的污在防止培養(yǎng)物的污染與防止細(xì)菌的擴(kuò)染與防止細(xì)菌的擴(kuò)

16、散方面，你學(xué)到些散方面，你學(xué)到些什么？有什么體會(huì)？什么？有什么體會(huì)？你如何體會(huì)你如何體會(huì)“為什為什么既是我們的朋友么既是我們的朋友又是我們的敵人又是我們的敵人”。實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌形態(tài)觀察和染色實(shí)驗(yàn)細(xì)菌形態(tài)觀察和染色實(shí)驗(yàn)一、目的要求一、目的要求n學(xué)習(xí)微生物涂片、染色基本技術(shù)和無(wú)菌操學(xué)習(xí)微生物涂片、染色基本技術(shù)和無(wú)菌操作技術(shù)作技術(shù); ;n初步掌握革蘭氏染色法初步掌握革蘭氏染色法; ;n鞏固顯微鏡（油鏡）的使用方法鞏固顯微鏡（油鏡）的使用方法; ;n初步認(rèn)識(shí)細(xì)菌的形態(tài)特征。初步認(rèn)識(shí)細(xì)菌的形態(tài)特征。二、二、基本原理基本原理革蘭革蘭氏染氏染色程色程序序結(jié)結(jié)晶晶紫紫初初染染碘碘液液媒媒染染乙乙醇醇脫脫色

17、色番番紅紅復(fù)復(fù)染染最最終終結(jié)結(jié)果果原理原理革蘭革蘭氏陽(yáng)氏陽(yáng)性菌性菌(G+)藍(lán)藍(lán)紫紫色色藍(lán)藍(lán)紫紫色色藍(lán)藍(lán)紫紫色色藍(lán)藍(lán)紫紫色色藍(lán)藍(lán)紫紫色色細(xì)胞壁肽聚糖層呈網(wǎng)狀，壁厚、類細(xì)胞壁肽聚糖層呈網(wǎng)狀，壁厚、類脂含量低，乙醇脫色時(shí)細(xì)胞壁脫水、脂含量低，乙醇脫色時(shí)細(xì)胞壁脫水、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，結(jié)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，結(jié)晶紫晶紫碘的復(fù)合物仍保留在細(xì)胞內(nèi)碘的復(fù)合物仍保留在細(xì)胞內(nèi)革蘭革蘭氏陰氏陰性菌性菌(G-)藍(lán)藍(lán)紫紫色色藍(lán)藍(lán)紫紫色色無(wú)無(wú)色色紅紅色色紅紅色色細(xì)胞壁肽聚糖層薄、類脂含量高，細(xì)胞壁肽聚糖層薄、類脂含量高，乙醇脫色時(shí)類脂質(zhì)被乙醇溶解，細(xì)乙醇脫色時(shí)類脂質(zhì)被乙醇溶解，細(xì)胞壁透性增大，結(jié)晶紫胞壁透

18、性增大，結(jié)晶紫碘的復(fù)合碘的復(fù)合物較易洗脫出來(lái)物較易洗脫出來(lái)三、器材三、器材v菌種菌種 大腸桿菌大腸桿菌約約24h24h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌約約24h24h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌121224h24h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物。營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物。v染色劑染色劑 革蘭氏染色液。革蘭氏染色液。v儀器或者其他用具儀器或者其他用具 顯微鏡，酒精燈，載顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，雙層瓶（內(nèi)裝香柏油和二玻片，接種環(huán)，雙層瓶（內(nèi)裝香柏油和二甲苯），擦鏡紙，生理鹽水等甲苯），擦鏡紙，生理鹽水等 v涂片涂片 涂成薄膜涂成薄膜 干

19、燥干燥 自然干燥自然干燥 固定固定 通過(guò)火焰通過(guò)火焰2 23 3次次 結(jié)晶紫初染結(jié)晶紫初染 1-2min 1-2min 碘液媒染碘液媒染 1min 1min 乙醇脫色乙醇脫色 至流出的乙醇無(wú)紫色至流出的乙醇無(wú)紫色 番紅復(fù)染番紅復(fù)染 2min 2min 油鏡鏡檢觀察。油鏡鏡檢觀察。四、操作步驟四、操作步驟v混合涂片涂色混合涂片涂色 按上述方法，在同一載玻片上，按上述方法，在同一載玻片上，以以大腸桿菌和枯草芽孢桿菌大腸桿菌和枯草芽孢桿菌或或大腸桿菌和金黃色葡大腸桿菌和金黃色葡萄球菌萄球菌作混合涂片、染色、鏡檢進(jìn)行比較。作混合涂片、染色、鏡檢進(jìn)行比較?，F(xiàn)場(chǎng)演示現(xiàn)場(chǎng)演示 1 1 載玻片要潔凈無(wú)油跡；滴

20、生理鹽水和取菌載玻片要潔凈無(wú)油跡；滴生理鹽水和取菌不宜過(guò)多；涂片要涂抹均勻，不宜過(guò)厚；不宜過(guò)多；涂片要涂抹均勻，不宜過(guò)厚； 2 2 熱固定溫度不宜過(guò)高，否則會(huì)改變甚至破熱固定溫度不宜過(guò)高，否則會(huì)改變甚至破壞細(xì)胞形態(tài)；壞細(xì)胞形態(tài)； 3 3 染色時(shí)，每一步驟后都要立即水洗；染色時(shí)，每一步驟后都要立即水洗； 4 4 革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是革革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。脫色不足，陰性蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。脫色不足，陰性菌被誤染成陽(yáng)性菌，脫色過(guò)度，陽(yáng)性菌被誤菌被誤染成陽(yáng)性菌，脫色過(guò)度，陽(yáng)性菌被誤染成陰性菌，脫色時(shí)間一般染成陰性菌，脫色時(shí)間一般202030S3

21、0S。注意：注意：五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌(G+)大腸桿菌大腸桿菌(G-)枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌(G+) 六、思考題六、思考題v你認(rèn)為哪些環(huán)節(jié)會(huì)影響革蘭氏染色結(jié)果你認(rèn)為哪些環(huán)節(jié)會(huì)影響革蘭氏染色結(jié)果的正確性？其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么？的正確性？其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么？v現(xiàn)有一株細(xì)菌寬度明顯大于大腸桿菌的現(xiàn)有一株細(xì)菌寬度明顯大于大腸桿菌的粗壯桿菌，請(qǐng)你利用大腸桿菌鑒定其革粗壯桿菌，請(qǐng)你利用大腸桿菌鑒定其革蘭氏染色反應(yīng)結(jié)果及其正確性。蘭氏染色反應(yīng)結(jié)果及其正確性。v熱固定的目的是什么？熱固定的目的是什么？實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 細(xì)菌的特殊染色技術(shù)細(xì)菌的特殊染色技術(shù)一、目的要求一、目

22、的要求學(xué)習(xí)并掌握芽孢染色法。學(xué)習(xí)并掌握芽孢染色法。初步了解芽孢桿菌的形態(tài)特征。初步了解芽孢桿菌的形態(tài)特征。學(xué)習(xí)并掌握莢膜染色法。學(xué)習(xí)并掌握莢膜染色法。二、基本原理二、基本原理n用著色力強(qiáng)的染色劑孔雀綠，在加熱條用著色力強(qiáng)的染色劑孔雀綠，在加熱條件下染色，使染料不僅進(jìn)入菌體也可進(jìn)件下染色，使染料不僅進(jìn)入菌體也可進(jìn)入芽孢內(nèi)，入芽孢內(nèi)，進(jìn)入菌體的染料經(jīng)水洗后被進(jìn)入菌體的染料經(jīng)水洗后被脫色，而芽孢一經(jīng)著色難以被水洗脫，脫色，而芽孢一經(jīng)著色難以被水洗脫，再用對(duì)比度大的復(fù)染劑染色后，芽孢仍再用對(duì)比度大的復(fù)染劑染色后，芽孢仍保留初染劑的顏色，而菌體和芽孢囊被保留初染劑的顏色，而菌體和芽孢囊被染成復(fù)染劑的顏色

23、，使芽孢和菌體更易染成復(fù)染劑的顏色，使芽孢和菌體更易于區(qū)分。于區(qū)分。n莢膜是包圍在細(xì)菌胞外的一層粘液狀或莢膜是包圍在細(xì)菌胞外的一層粘液狀或膠質(zhì)狀物質(zhì)，其成分為多糖、糖蛋白或膠質(zhì)狀物質(zhì)，其成分為多糖、糖蛋白或多肽。由于多肽。由于莢膜與染料的親和力弱、不莢膜與染料的親和力弱、不易著色；而且可溶于水，易在用水沖洗易著色；而且可溶于水，易在用水沖洗時(shí)被除去。時(shí)被除去。所以通常用襯托染色法染色，所以通常用襯托染色法染色，使菌體和背景著色，而莢膜不著色，在使菌體和背景著色，而莢膜不著色，在菌體周圍形成一透明圈。由于莢膜含水菌體周圍形成一透明圈。由于莢膜含水量高，制片時(shí)通常不用熱固定，以免變量高，制片時(shí)通常

24、不用熱固定，以免變形影響觀察。形影響觀察。三、器材三、器材n菌種菌種 枯草芽孢桿菌約枯草芽孢桿菌約2d2d營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物；褐球固氮菌約面培養(yǎng)物；褐球固氮菌約2d2d無(wú)氮培養(yǎng)基無(wú)氮培養(yǎng)基瓊脂斜面培養(yǎng)物。瓊脂斜面培養(yǎng)物。 染色劑染色劑 5%5%孔雀綠水溶液，孔雀綠水溶液，0.5%0.5%番紅番紅水溶液，繪圖墨水。水溶液，繪圖墨水。 儀器和其他用具儀器和其他用具 小試管，滴管，燒小試管，滴管，燒杯，試管架，載玻片，蓋玻片，濾紙，杯，試管架，載玻片，蓋玻片，濾紙，木夾子，顯微鏡等。木夾子，顯微鏡等。四、操作步驟四、操作步驟(1) Schaeffer(1) SchaefferFultonF

25、ulton氏芽孢染色法氏芽孢染色法制片制片 常規(guī)涂片、干燥、固定。常規(guī)涂片、干燥、固定。染色染色 加數(shù)滴孔雀綠染液于涂片上，用木夾夾住加數(shù)滴孔雀綠染液于涂片上，用木夾夾住載玻片一端，在微火上載玻片一端，在微火上加熱至染料冒加熱至染料冒蒸汽并開(kāi)始計(jì)時(shí)，維持蒸汽并開(kāi)始計(jì)時(shí)，維持5min5min。n水洗水洗 待玻片冷卻后，用緩流自來(lái)水沖待玻片冷卻后，用緩流自來(lái)水沖 洗，直至流出的水無(wú)色為止。洗，直至流出的水無(wú)色為止。n復(fù)染復(fù)染 用番紅染液用番紅染液復(fù)染復(fù)染2min2min。n水洗水洗 用緩流水沖洗后，吸干。用緩流水沖洗后，吸干。n鏡檢鏡檢 油鏡觀察。油鏡觀察。芽孢呈綠色，芽孢囊芽孢呈綠色，芽孢囊 及

26、營(yíng)養(yǎng)體為紅色。及營(yíng)養(yǎng)體為紅色。（2 2）莢膜的濕墨水染色法）莢膜的濕墨水染色法n制備菌和墨水混合液制備菌和墨水混合液 加一滴墨水于潔凈加一滴墨水于潔凈 的載玻片上，然后挑取少量菌的載玻片上，然后挑取少量菌 體與其混合均勻。體與其混合均勻。加蓋玻片加蓋玻片 將一潔凈蓋玻片蓋在混合液將一潔凈蓋玻片蓋在混合液 上，然后在蓋玻片上放一張濾上，然后在蓋玻片上放一張濾 紙，輕輕按壓以吸去多余的混紙，輕輕按壓以吸去多余的混 合液。合液。n鏡檢鏡檢 用低倍鏡和高倍鏡觀察，用低倍鏡和高倍鏡觀察，背背 景灰色，菌體較暗，在菌體景灰色，菌體較暗，在菌體 周圍呈現(xiàn)明亮透明圈即為莢周圍呈現(xiàn)明亮透明圈即為莢 膜。膜。注意

27、：注意：n1 芽孢孔雀綠染色加熱過(guò)程中，要芽孢孔雀綠染色加熱過(guò)程中，要及時(shí)補(bǔ)充染液，切勿讓涂膜干涸。及時(shí)補(bǔ)充染液，切勿讓涂膜干涸。n2 2 芽孢染色水洗時(shí)，勿用瀑水對(duì)著芽孢染色水洗時(shí)，勿用瀑水對(duì)著菌膜沖洗，以免細(xì)菌被水沖掉。菌膜沖洗，以免細(xì)菌被水沖掉。n3 3 莢膜濕墨水染色時(shí)，加蓋玻片勿莢膜濕墨水染色時(shí)，加蓋玻片勿留氣泡，以免影響觀察。留氣泡，以免影響觀察。芽孢芽孢莢膜莢膜五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1 1 芽孢染色結(jié)果芽孢染色結(jié)果 繪圖表示枯草芽孢桿菌繪圖表示枯草芽孢桿菌的形態(tài)特征（注意芽孢的形狀、著生位的形態(tài)特征（注意芽孢的形狀、著生位置及芽孢囊的形狀特征）。置及芽孢囊的形狀特征）。2 2

28、莢膜染色結(jié)果莢膜染色結(jié)果 繪圖說(shuō)明你所觀察到的繪圖說(shuō)明你所觀察到的細(xì)菌的菌體和莢膜的形態(tài)。細(xì)菌的菌體和莢膜的形態(tài)。六、思考題六、思考題n用用SchaefferSchaefferFultonFulton氏染色法加熱染色時(shí)，氏染色法加熱染色時(shí)，若因一時(shí)疏忽玻片上的染液被烘干，此時(shí)能若因一時(shí)疏忽玻片上的染液被烘干，此時(shí)能否立即補(bǔ)加染液？為什么？否立即補(bǔ)加染液？為什么？n若涂片中觀察到的只是大量游離芽孢，很少若涂片中觀察到的只是大量游離芽孢，很少看到芽孢囊及營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞，你認(rèn)為這是什么看到芽孢囊及營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞，你認(rèn)為這是什么原因？原因？n通過(guò)莢膜染色法染色后，為什么被包在莢膜通過(guò)莢膜染色法染色后，為什么被

29、包在莢膜里面的菌體著色而莢膜不著色？里面的菌體著色而莢膜不著色？實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四 微生物菌落制片技術(shù)微生物菌落制片技術(shù)一、目的要求一、目的要求 1 1 學(xué)習(xí)并掌握放線菌形態(tài)的制片方法學(xué)習(xí)并掌握放線菌形態(tài)的制片方法 2 2學(xué)習(xí)并掌握霉菌的制片方法。學(xué)習(xí)并掌握霉菌的制片方法。二、基本原理二、基本原理 放線菌插片法：將放線菌接種在瓊脂平板上，插上放線菌插片法：將放線菌接種在瓊脂平板上，插上滅菌蓋玻片后培養(yǎng)，使放線菌菌絲沿著培養(yǎng)基表面滅菌蓋玻片后培養(yǎng)，使放線菌菌絲沿著培養(yǎng)基表面與蓋玻片的交接處生長(zhǎng)而附著在蓋玻片上。觀察時(shí)，與蓋玻片的交接處生長(zhǎng)而附著在蓋玻片上。觀察時(shí)，輕輕取出蓋玻片，置于載玻片上直接鏡檢。

30、這種方輕輕取出蓋玻片，置于載玻片上直接鏡檢。這種方法可觀察到放線菌自然生長(zhǎng)狀態(tài)下的特征，而且便法可觀察到放線菌自然生長(zhǎng)狀態(tài)下的特征，而且便于觀察不同生長(zhǎng)期的形態(tài)。于觀察不同生長(zhǎng)期的形態(tài)。v霉菌載玻片培養(yǎng)法：無(wú)菌操作將培養(yǎng)基瓊脂霉菌載玻片培養(yǎng)法：無(wú)菌操作將培養(yǎng)基瓊脂薄層置于載玻片上，接種后蓋上蓋玻片培養(yǎng)，薄層置于載玻片上，接種后蓋上蓋玻片培養(yǎng)，霉菌即在載玻片和蓋玻片之間的有限空間內(nèi)霉菌即在載玻片和蓋玻片之間的有限空間內(nèi)沿蓋玻片橫向生長(zhǎng)。培養(yǎng)一定時(shí)間后，將載沿蓋玻片橫向生長(zhǎng)。培養(yǎng)一定時(shí)間后，將載玻片上的培養(yǎng)物置顯微鏡下觀察。玻片上的培養(yǎng)物置顯微鏡下觀察。v這種方法既可以保持了霉菌自然生長(zhǎng)狀態(tài)，這種

31、方法既可以保持了霉菌自然生長(zhǎng)狀態(tài)，還便于觀察不同發(fā)育期的培養(yǎng)物。還便于觀察不同發(fā)育期的培養(yǎng)物。三、器材三、器材 v菌種菌種 鏈霉菌；曲霉，青霉，根霉鏈霉菌；曲霉，青霉，根霉v培養(yǎng)基培養(yǎng)基 馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基v儀器或其他用具儀器或其他用具 滅菌平皿、載玻片、蓋滅菌平皿、載玻片、蓋玻片、玻片、U U形玻棒，接種環(huán)，解剖刀，鑷子，形玻棒，接種環(huán)，解剖刀，鑷子，20%20%的甘油，顯微鏡等。的甘油，顯微鏡等。 四、操作步驟四、操作步驟 v 1.1.放線菌扦片法放線菌扦片法v 倒平板倒平板 取融化并冷至約取融化并冷至約5050 的高氏的高氏1 1 號(hào)號(hào) 瓊脂約瓊脂約20mL20mL 倒平板

32、，凝固待用；倒平板，凝固待用； 接接 種種 用接種環(huán)挑取菌種斜面培養(yǎng)物在瓊用接種環(huán)挑取菌種斜面培養(yǎng)物在瓊 脂平板上劃線接種。脂平板上劃線接種。 插插 片片 以無(wú)菌操作用鑷子將滅菌的蓋玻以無(wú)菌操作用鑷子將滅菌的蓋玻 片以大約片以大約4545 角插入瓊脂內(nèi)，插角插入瓊脂內(nèi)，插 片數(shù)量可根據(jù)需要而定。片數(shù)量可根據(jù)需要而定。 培養(yǎng)培養(yǎng) 將插片平板倒置，將插片平板倒置，2828 培養(yǎng)培養(yǎng)3 3 5d5d 。 鏡檢鏡檢 用鑷子小心拔出蓋玻片，擦去背面用鑷子小心拔出蓋玻片，擦去背面 培養(yǎng)物，將有菌的一面朝上放在載培養(yǎng)物，將有菌的一面朝上放在載玻玻 片上，直接鏡檢。片上，直接鏡檢。 注意注意1 1 劃線要細(xì)密

33、些劃線要細(xì)密些, ,以利插片；以利插片；2 2 插片要插在接種線上；插片要插在接種線上；3 3 觀察時(shí)觀察時(shí), ,宜用略暗光線；先用低倍鏡找到宜用略暗光線；先用低倍鏡找到適當(dāng)視野，再換高倍鏡觀察。適當(dāng)視野，再換高倍鏡觀察。 v2 2 霉菌載玻片培養(yǎng)法霉菌載玻片培養(yǎng)法 培養(yǎng)小室的滅菌培養(yǎng)小室的滅菌 瓊脂塊的制作瓊脂塊的制作 取已滅菌的馬鈴薯培養(yǎng)基取已滅菌的馬鈴薯培養(yǎng)基6 67mL7mL注入另一滅菌的平皿中，使之凝固成薄注入另一滅菌的平皿中，使之凝固成薄層。用解剖刀切成層。用解剖刀切成0.50.51cm1cm2 2的瓊脂塊，的瓊脂塊，并將其移至上述培養(yǎng)室中的載玻片上并將其移至上述培養(yǎng)室中的載玻片上

34、（每片放兩塊）。（每片放兩塊）。 接種接種 用尖細(xì)的接種針挑取少量的孢子接種于用尖細(xì)的接種針挑取少量的孢子接種于 瓊脂塊的邊緣上，無(wú)菌操作用鑷子將蓋瓊脂塊的邊緣上，無(wú)菌操作用鑷子將蓋 玻片覆蓋在瓊脂塊上。玻片覆蓋在瓊脂塊上。 培養(yǎng)培養(yǎng) 先在平皿的濾紙上加先在平皿的濾紙上加3 35ml5ml滅菌的滅菌的20%20% 甘油，然后蓋上皿蓋，甘油，然后蓋上皿蓋，2828培養(yǎng)。培養(yǎng)。 鏡檢鏡檢 根據(jù)需要可在不同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)取出載根據(jù)需要可在不同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)取出載 玻片置低倍鏡下觀察，必要時(shí)換高倍鏡。玻片置低倍鏡下觀察，必要時(shí)換高倍鏡。注意注意1 1 制作過(guò)程應(yīng)注意無(wú)菌操作；制作過(guò)程應(yīng)注意無(wú)菌操作；2 2

35、 接種量要少，盡可能將分散的孢子接種接種量要少，盡可能將分散的孢子接種在瓊脂塊邊緣上，否則培養(yǎng)后菌絲過(guò)于稠在瓊脂塊邊緣上，否則培養(yǎng)后菌絲過(guò)于稠密影響觀察；密影響觀察；3 3 觀察時(shí)觀察時(shí), ,宜用略暗光線；先用低倍鏡找到宜用略暗光線；先用低倍鏡找到適當(dāng)視野，再換高倍鏡觀察。適當(dāng)視野，再換高倍鏡觀察。 五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 v1 1 繪圖說(shuō)明你所觀察到的放線菌的主繪圖說(shuō)明你所觀察到的放線菌的主要形態(tài)特征。要形態(tài)特征。v2 2 繪制曲霉、青霉、根霉的個(gè)體形態(tài)繪制曲霉、青霉、根霉的個(gè)體形態(tài)圖，并注明各部位圖，并注明各部位名稱。名稱。v3 簡(jiǎn)述簡(jiǎn)述曲霉、青霉、根霉的菌落顏色及曲霉、青霉、根霉的菌落

36、顏色及特征。特征。六、思考題六、思考題v1 1 鏡檢時(shí)，你如何區(qū)分放線菌的基內(nèi)菌絲和氣鏡檢時(shí)，你如何區(qū)分放線菌的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲？生菌絲？v2 2 你主要根據(jù)哪些形態(tài)特征來(lái)區(qū)分上述三種霉你主要根據(jù)哪些形態(tài)特征來(lái)區(qū)分上述三種霉菌？菌？v3 3 根據(jù)載玻片培養(yǎng)觀察方法的基本原理，你認(rèn)根據(jù)載玻片培養(yǎng)觀察方法的基本原理，你認(rèn)為上述哪些過(guò)程中的哪些步驟可以根據(jù)具體情為上述哪些過(guò)程中的哪些步驟可以根據(jù)具體情況作一些改進(jìn)或可用其他的替代方法？況作一些改進(jìn)或可用其他的替代方法？實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四 霉菌、放線菌的霉菌、放線菌的形態(tài)觀察形態(tài)觀察一、目的要求一、目的要求 1 1 初步了解放線菌、霉菌的形態(tài)特征。初步了解

37、放線菌、霉菌的形態(tài)特征。2 2 觀察放線菌、霉菌菌落特征。觀察放線菌、霉菌菌落特征。3 3 了解三類常見(jiàn)霉菌的基本形態(tài)特征。了解三類常見(jiàn)霉菌的基本形態(tài)特征。 二、基本原理二、基本原理 n放線菌是指能形成分枝絲狀體或菌絲體的一類革放線菌是指能形成分枝絲狀體或菌絲體的一類革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，常見(jiàn)放線菌大多形成菌絲體，緊蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，常見(jiàn)放線菌大多形成菌絲體，緊貼培養(yǎng)基表面或深入培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)的叫貼培養(yǎng)基表面或深入培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)的叫基內(nèi)菌絲基內(nèi)菌絲（簡(jiǎn)稱（簡(jiǎn)稱“基絲基絲”，) ) ，基絲生長(zhǎng)到一定階段還能，基絲生長(zhǎng)到一定階段還能向空氣中生長(zhǎng)出向空氣中生長(zhǎng)出氣生菌絲氣生菌絲 簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱“氣絲氣絲”) ) ，并，

38、并進(jìn)一步分化產(chǎn)生進(jìn)一步分化產(chǎn)生孢子絲及孢子孢子絲及孢子。n在顯微鏡下直接觀察時(shí)，氣絲在上層、基絲在下在顯微鏡下直接觀察時(shí)，氣絲在上層、基絲在下層，層，氣絲色暗，基絲較透明。氣絲色暗，基絲較透明。孢子絲依種類的不孢子絲依種類的不同，有直、波曲、各種螺旋形或輪生。在油鏡下同，有直、波曲、各種螺旋形或輪生。在油鏡下觀察，放線菌的孢子有球形、橢圓、桿狀或柱觀察，放線菌的孢子有球形、橢圓、桿狀或柱狀狀n能否產(chǎn)生菌絲體及由菌絲體分化產(chǎn)生的各種形態(tài)能否產(chǎn)生菌絲體及由菌絲體分化產(chǎn)生的各種形態(tài)特征是放線菌分類鑒定的重要依據(jù)。特征是放線菌分類鑒定的重要依據(jù)。n霉菌是可產(chǎn)生復(fù)雜分枝的菌絲體，分為基內(nèi)菌絲霉菌是可產(chǎn)生

39、復(fù)雜分枝的菌絲體，分為基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長(zhǎng)到一定階段后分化產(chǎn)和氣生菌絲，氣生菌絲生長(zhǎng)到一定階段后分化產(chǎn)生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子。生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子。n 霉菌菌絲體（尤其是繁殖菌絲）其孢子的形態(tài)特霉菌菌絲體（尤其是繁殖菌絲）其孢子的形態(tài)特征是分類的重要依據(jù)。例如：征是分類的重要依據(jù)。例如：青霉的繁殖菌絲無(wú)青霉的繁殖菌絲無(wú)頂囊，經(jīng)多次分枝，產(chǎn)生幾輪對(duì)稱或不對(duì)稱的小頂囊，經(jīng)多次分枝，產(chǎn)生幾輪對(duì)稱或不對(duì)稱的小梗，小梗上著生成串的青色分生孢子，孢子囊形梗，小梗上著生成串的青色分生孢子，孢子囊形如如“掃帚掃帚”。而曲霉的分生孢子梗頂端膨大成頂而曲霉的分生孢子梗頂端膨大成頂囊，

40、成球形。囊，成球形。霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細(xì)菌霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細(xì)菌和放線菌粗得多（約和放線菌粗得多（約3 310um10um），常是細(xì)菌菌體寬），常是細(xì)菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因此，用低倍鏡即可觀察。度的幾倍至幾十倍，因此，用低倍鏡即可觀察。 三、器材 菌種菌種 鏈霉菌鏈霉菌 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 滅菌的高氏滅菌的高氏I I 號(hào)瓊脂號(hào)瓊脂 儀器或其他用具儀器或其他用具 經(jīng)滅菌的：平皿、玻璃紙、經(jīng)滅菌的：平皿、玻璃紙、蓋玻片、玻璃涂棒以及載玻片，接種環(huán)，接種蓋玻片、玻璃涂棒以及載玻片，接種環(huán)，接種鏟，鑷子，石炭酸復(fù)紅染液，顯微鏡等。鏟，鑷子，石炭酸復(fù)紅染液，顯微鏡等。 n 1 1、 菌種

41、：曲霉（菌種：曲霉（Aspergillus sp.Aspergillus sp.），青霉，），青霉，根霉（根霉（Rhizopus sp.Rhizopus sp.）和毛霉（）和毛霉（Mucor sp.Mucor sp.）培養(yǎng)培養(yǎng)2 25d5d的馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)物。的馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)物。 2 2、 溶液或試劑溶液或試劑 乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液。乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液。 3 3、 儀器或其它用具儀器或其它用具 無(wú)菌吸管、平皿、載玻無(wú)菌吸管、平皿、載玻片、蓋玻片、片、蓋玻片、U U形玻棒、解剖刀、鑷子、形玻棒、解剖刀、鑷子、50%50%乙乙醇、醇、20%20%的甘油以接種針、顯微鏡等。的甘油以接種針、

42、顯微鏡等。 四、操作步驟四、操作步驟 n1.1.插片法插片法（ 1 1 ）倒平板）倒平板 取融化并冷至大約取融化并冷至大約5050 的的 高高氏氏1 1 號(hào)瓊脂約號(hào)瓊脂約2020 mLmL倒平板，凝固待用。倒平板，凝固待用。（2 2）接種）接種 用接種環(huán)挑取菌種斜面培養(yǎng)物（孢用接種環(huán)挑取菌種斜面培養(yǎng)物（孢子）在瓊脂平板上劃線接種。劃線要密些子）在瓊脂平板上劃線接種。劃線要密些, ,以以利插片。利插片。n（3 3）插片）插片 以無(wú)菌操作用鑷子將滅菌的蓋玻片以無(wú)菌操作用鑷子將滅菌的蓋玻片以大約以大約4545 。角插入瓊脂內(nèi)（插在接種線上），角插入瓊脂內(nèi)（插在接種線上），插片數(shù)量可根據(jù)需要而定。插片

43、數(shù)量可根據(jù)需要而定。 ( ( 4 4 ）培養(yǎng)）培養(yǎng) 將插片平板倒置，將插片平板倒置，2828 培養(yǎng)，培培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)觀察的目的而定，通常養(yǎng)時(shí)間根據(jù)觀察的目的而定，通常3 35d5d 。 ( ( 5 5 ）鏡檢）鏡檢 用鑷子小心拔出蓋玻片，擦去背面用鑷子小心拔出蓋玻片，擦去背面培養(yǎng)物，然后將有菌的一面朝上放在載玻片上，培養(yǎng)物，然后將有菌的一面朝上放在載玻片上，直接鏡檢。直接鏡檢。 觀察時(shí)觀察時(shí), ,宜用略暗光線；先用低倍鏡找到適宜用略暗光線；先用低倍鏡找到適當(dāng)視野，再換高倍鏡觀察，如果用當(dāng)視野，再換高倍鏡觀察，如果用0.1%0.1%美藍(lán)對(duì)美藍(lán)對(duì)培養(yǎng)后的蓋玻片進(jìn)行染色后觀察，效果會(huì)更好。培養(yǎng)后

44、的蓋玻片進(jìn)行染色后觀察，效果會(huì)更好。n2 2、載玻片培養(yǎng)觀察法、載玻片培養(yǎng)觀察法（1 1）培養(yǎng)小室的滅菌）培養(yǎng)小室的滅菌 在平皿皿底鋪一張略小在平皿皿底鋪一張略小于皿底的圓濾片，再放一于皿底的圓濾片，再放一U U形玻棒，其上放一形玻棒，其上放一潔凈載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋、包扎后潔凈載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋、包扎后于于121121滅菌滅菌30min30min，烘干備用。，烘干備用。（2 2）瓊脂塊的制作）瓊脂塊的制作 取已滅菌的馬鈴薯（或察氏）取已滅菌的馬鈴薯（或察氏）瓊脂培養(yǎng)物瓊脂培養(yǎng)物6 67ml7ml注入另一滅菌的平皿中，使注入另一滅菌的平皿中，使之凝固成薄層。用解剖刀切成之凝固

45、成薄層。用解剖刀切成0.50.51cm1cm2 2的瓊脂的瓊脂塊，并將其移至上述培養(yǎng)室中的載玻片上（每塊，并將其移至上述培養(yǎng)室中的載玻片上（每片放兩塊）片放兩塊）制作過(guò)程應(yīng)注意無(wú)菌操作。制作過(guò)程應(yīng)注意無(wú)菌操作。n（3 3）接種）接種 用尖細(xì)的接種針挑取少量的孢子接種于用尖細(xì)的接種針挑取少量的孢子接種于瓊脂塊的邊緣，無(wú)菌操作用鑷子將蓋玻片覆蓋在瓊瓊脂塊的邊緣，無(wú)菌操作用鑷子將蓋玻片覆蓋在瓊脂塊上。接種量要少，盡可能將分散的孢子接種在脂塊上。接種量要少，盡可能將分散的孢子接種在瓊脂塊邊緣上，否則培養(yǎng)后菌絲過(guò)于稠密影響觀察。瓊脂塊邊緣上，否則培養(yǎng)后菌絲過(guò)于稠密影響觀察。 （4 4）培養(yǎng)）培養(yǎng) 先在平

46、皿的濾紙上加先在平皿的濾紙上加3 35ml5ml滅菌的滅菌的20%20%甘油（用于保持平皿內(nèi)的濕度），蓋上皿蓋，甘油（用于保持平皿內(nèi)的濕度），蓋上皿蓋，2828培養(yǎng)。培養(yǎng)。 （5 5）鏡檢）鏡檢 根據(jù)需要可以在不同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)取根據(jù)需要可以在不同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)取出載玻片置低倍鏡下觀察，必要時(shí)換高倍鏡。出載玻片置低倍鏡下觀察，必要時(shí)換高倍鏡。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 n1 1 結(jié)果結(jié)果 繪圖說(shuō)明你所觀察到的放線菌的主要形繪圖說(shuō)明你所觀察到的放線菌的主要形態(tài)特征。態(tài)特征。n2 2 繪圖示青霉、黑曲霉的分生孢子梗、分生孢子繪圖示青霉、黑曲霉的分生孢子梗、分生孢子實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (1) (1) 曲霉、

47、青霉、根霉的菌落顏色及特征。曲霉、青霉、根霉的菌落顏色及特征。 (2) (2) 繪制曲霉、青霉、根霉的個(gè)體形態(tài)圖，繪制曲霉、青霉、根霉的個(gè)體形態(tài)圖，并注明各部位名稱。并注明各部位名稱。六、思考題六、思考題（l l）試比較三種培養(yǎng)和觀察放線菌方法的優(yōu)）試比較三種培養(yǎng)和觀察放線菌方法的優(yōu)缺點(diǎn)。缺點(diǎn)。（2 2）玻璃紙培養(yǎng)和觀察法是否還可用于其他）玻璃紙培養(yǎng)和觀察法是否還可用于其他類群微生物的培養(yǎng)和觀察？為什么？類群微生物的培養(yǎng)和觀察？為什么？（3 3）鏡檢時(shí)，你如何區(qū)分放線菌的基內(nèi)菌絲）鏡檢時(shí)，你如何區(qū)分放線菌的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲？和氣生菌絲？ n（1 1）你主要根據(jù)哪些形態(tài)特征來(lái)區(qū)分上述）你主要根

48、據(jù)哪些形態(tài)特征來(lái)區(qū)分上述四種霉菌？四種霉菌？ （2 2）根據(jù)載玻片培養(yǎng)觀察方法的基本原）根據(jù)載玻片培養(yǎng)觀察方法的基本原理，你認(rèn)為上述哪些過(guò)程中的哪些步驟可理，你認(rèn)為上述哪些過(guò)程中的哪些步驟可以根據(jù)具體情況作一些改進(jìn)或可用其他的以根據(jù)具體情況作一些改進(jìn)或可用其他的替代方法？替代方法？ （3 3）你認(rèn)為在顯微鏡下，細(xì)菌、放線菌、）你認(rèn)為在顯微鏡下，細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌的主要區(qū)別是什么？酵母菌和霉菌的主要區(qū)別是什么？實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)六 微生物顯微微生物顯微鏡鏡直接計(jì)數(shù)法直接計(jì)數(shù)法一、目的要求一、目的要求1 1明確顯微鏡計(jì)數(shù)的原理。明確顯微鏡計(jì)數(shù)的原理。2 2學(xué)習(xí)使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方學(xué)習(xí)使

49、用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。法。二、基本原理二、基本原理l利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是一種利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。此法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、常用的微生物計(jì)數(shù)方法。此法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速?？焖?。l將經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的菌懸液（或孢子懸液）放在將經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的菌懸液（或孢子懸液）放在血球計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，血球計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是一在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是一定的（定的（0.1mm0.1mm3 3），所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀），所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來(lái)?yè)Q算成單位

50、體積內(nèi)的微生察到的微生物數(shù)目來(lái)?yè)Q算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。物總數(shù)目。l由于此法計(jì)得的是活菌體和死菌體的總和，故由于此法計(jì)得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計(jì)數(shù)法。又稱為總菌計(jì)數(shù)法。l血球計(jì)數(shù)板，通常是血球計(jì)數(shù)板，通常是一塊特制的載玻片，一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上半，每一邊的平臺(tái)上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)大方格，中間的大方大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室，微生格即為計(jì)數(shù)室，微生物的計(jì)數(shù)就在計(jì)數(shù)室物的計(jì)數(shù)就在計(jì)數(shù)室中進(jìn)行。中進(jìn)

51、行。l計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成方格分成1616個(gè)中方格，個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成而每個(gè)中方格又分成2525個(gè)小方格，共個(gè)小方格，共400400小格；小格；l另一種是一個(gè)大方格分另一種是一個(gè)大方格分成成2525個(gè)中方格，而每個(gè)個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成中方格又分成1616個(gè)小方個(gè)小方格，總共也是格，總共也是400400小格。小格。所以無(wú)論是哪種規(guī)格的所以無(wú)論是哪種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格數(shù)都是相同中的小方格數(shù)都是相同的。的。 每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為1mm1mm，則每一大方格的面積為

52、則每一大方格的面積為1mm1mm2 2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為玻片之間的高度為0.1mm0.1mm，所以計(jì)數(shù)室的容積為所以計(jì)數(shù)室的容積為0.1mm0.1mm3 3。其計(jì)算方法如下：其計(jì)算方法如下： 1 116162525計(jì)數(shù)板計(jì)算公式計(jì)數(shù)板計(jì)算公式 細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)/ml=(100/ml=(100小格內(nèi)的細(xì)小格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)胞數(shù)/ 100)/ 100)40040010001000稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) 2 225251616計(jì)數(shù)板計(jì)算公式計(jì)數(shù)板計(jì)算公式 細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)/ml=(80/ml=(80小格內(nèi)的細(xì)小格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)胞數(shù)/ 80)/ 80)4004001000100

53、0稀稀釋倍數(shù)釋倍數(shù)三、器材三、器材l菌種：酵母菌懸液菌種：酵母菌懸液l儀器或其他用具：血球計(jì)數(shù)板，顯微鏡，儀器或其他用具：血球計(jì)數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無(wú)菌毛細(xì)管等。蓋玻片，無(wú)菌毛細(xì)管等。四、操作步驟四、操作步驟l1 1菌懸液制備菌懸液制備 以無(wú)菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度以無(wú)菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙?。適當(dāng)?shù)木鷳乙骸2 2鏡檢計(jì)數(shù)室鏡檢計(jì)數(shù)室 在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)。l3 3加樣品加樣品 將清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無(wú)菌將清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻

54、片，再用無(wú)菌的細(xì)口滴管將稀釋的酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一的細(xì)口滴管將稀釋的酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴（不宜過(guò)多），使菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作小滴（不宜過(guò)多），使菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自行進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。用自行進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。取樣時(shí)先要搖勻菌液體；加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣取樣時(shí)先要搖勻菌液體；加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。靜置泡產(chǎn)生。靜置5 51010分鐘即可計(jì)數(shù)。分鐘即可計(jì)數(shù)。l4 4顯微鏡計(jì)數(shù)顯微鏡計(jì)數(shù) 將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍

55、鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)數(shù)。在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有內(nèi)約有5 51010個(gè)菌體為宜。個(gè)菌體為宜。 若選用若選用25251616規(guī)格的計(jì)數(shù)板則每個(gè)計(jì)數(shù)室選規(guī)格的計(jì)數(shù)板則每個(gè)計(jì)數(shù)室選5 5個(gè)個(gè)中方格，可選中方格，可選4 4個(gè)角和中央的中格（即個(gè)角和中央的中格（即8080個(gè)小格），個(gè)小格），若選用若選用16162525規(guī)格的計(jì)數(shù)板，則數(shù)四個(gè)角：左上、規(guī)格的計(jì)數(shù)板，則數(shù)四個(gè)角：左上、右上、左下、右下的四個(gè)中方格，（即右上、左下、右下的四個(gè)中方格，（即100100小格）小格）

56、中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。 位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。 如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)即作兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的值來(lái)計(jì)算樣品的含菌量。室中計(jì)得的值來(lái)計(jì)算樣品的含菌量。顯微鏡及顯微鏡下的微生物顯微鏡及顯微鏡下的微生物l5 5清洗血球計(jì)數(shù)板清洗血球計(jì)數(shù)板 使用完畢后，將血球計(jì)數(shù)板在水籠頭上用水使用完畢后，將血球計(jì)數(shù)板在水籠頭上用水柱沖洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或柱沖洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用

57、吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其化沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)留菌體或其化沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。洗滌至干凈為止。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告各中格中菌數(shù)AB菌數(shù)/ml二室平均數(shù)12345第一室第二室六、思考題六、思考題 （1 1）為什么用兩種不同規(guī)格的計(jì)數(shù)板測(cè)同一樣）為什么用兩種不同規(guī)格的計(jì)數(shù)板測(cè)同一樣品時(shí)，其結(jié)果一樣？品時(shí)，其結(jié)果一樣？ （2 2）根據(jù)你的體會(huì)，說(shuō)明用血細(xì)胞技術(shù)的誤差）根據(jù)你的體會(huì)，說(shuō)明用血細(xì)胞技術(shù)的誤差 主要來(lái)自哪些方面？應(yīng)如何盡量減少誤差、力主要來(lái)自哪些方面？應(yīng)如何盡量減少誤差、力求準(zhǔn)確？求準(zhǔn)確？

58、（3 3）某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存）某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)活率，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)1 12 2種可行的檢測(cè)方法。種可行的檢測(cè)方法。一、目的和要求一、目的和要求 n1 1觀察酵母菌的出芽繁殖方式，學(xué)習(xí)區(qū)觀察酵母菌的出芽繁殖方式，學(xué)習(xí)區(qū)分酵母菌死活細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法。分酵母菌死活細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法。n2 2掌握酵母菌的一般形態(tài)特征及其與細(xì)掌握酵母菌的一般形態(tài)特征及其與細(xì)菌的區(qū)別。菌的區(qū)別。 實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)七 酵母菌細(xì)胞酵母菌細(xì)胞的形態(tài)觀察、死活細(xì)胞的形態(tài)觀察、死活細(xì)胞的鑒別的鑒別二、基本原理二、基本原理 n1 1形態(tài)觀察：酵母菌是不運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞真形態(tài)觀察：酵母菌是不運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞真核微

59、生物，通常比常見(jiàn)細(xì)胞大幾倍甚至十核微生物，通常比常見(jiàn)細(xì)胞大幾倍甚至十幾倍。大多數(shù)酵母菌以出芽方式進(jìn)行無(wú)性幾倍。大多數(shù)酵母菌以出芽方式進(jìn)行無(wú)性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通過(guò)接繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通過(guò)接合產(chǎn)生子囊孢子。合產(chǎn)生子囊孢子。n2 2死活鑒定：美藍(lán)是一種無(wú)毒性的染料，死活鑒定：美藍(lán)是一種無(wú)毒性的染料，它的氧化型呈藍(lán)色，還原型呈無(wú)色。用美它的氧化型呈藍(lán)色，還原型呈無(wú)色。用美藍(lán)對(duì)酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，藍(lán)對(duì)酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，由于細(xì)胞由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o(wú)色能力，能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型

60、變?yōu)闊o(wú)色的還原型。的還原型。因此，具有還原能力的酵母活因此，具有還原能力的酵母活細(xì)胞是無(wú)色的，而死細(xì)胞或代謝作用微弱細(xì)胞是無(wú)色的，而死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞則成藍(lán)色或淡藍(lán)色。的衰老細(xì)胞則成藍(lán)色或淡藍(lán)色。三、器材三、器材 n1 1、染液：呂氏堿性美藍(lán)染液、染液：呂氏堿性美藍(lán)染液n2 2、菌種：釀酒酵母的斜面培養(yǎng)物、菌種：釀酒酵母的斜面培養(yǎng)物n3 3、儀器和其他用具：、儀器和其他用具： 顯微鏡、載玻片、顯微鏡、載玻片、蓋玻片等蓋玻片等四、操作步驟四、操作步驟 n1 1、美藍(lán)浸片的觀察：、美藍(lán)浸片的觀察：1 1）在載玻片中央加一滴）在載玻片中央加一滴0.1%0.1%呂氏堿性美藍(lán)染呂氏堿性美藍(lán)染