第3章 基因操作的基本技術(shù)綜述

1、第第3 3章章 基因操作的基本技術(shù)基因操作的基本技術(shù)主要內(nèi)容主要內(nèi)容1.1.凝膠電泳凝膠電泳2.2.核酸印記核酸印記3.PCR3.PCR1. 1. 凝膠電泳凝膠電泳1.1 1.1 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳原理：原理： 不同大小、不同形狀和不同構(gòu)象的不同大小、不同形狀和不同構(gòu)象的DNADNA分子在相同的電分子在相同的電泳條件下（如凝膠濃度、電流、電壓、緩沖液等），有不同的泳條件下（如凝膠濃度、電流、電壓、緩沖液等），有不同的遷移率，所以可通過(guò)電泳使其分離。凝膠中的遷移率，所以可通過(guò)電泳使其分離。凝膠中的DNADNA可與熒光染可與熒光染料溴化乙錠（料溴化乙錠（EBEB）結(jié)合，在紫外燈下可看到熒

2、光條帶，籍此可）結(jié)合，在紫外燈下可看到熒光條帶，籍此可分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。核酸的分離與檢測(cè)技術(shù)核酸的分離與檢測(cè)技術(shù)一般過(guò)程：一般過(guò)程：u配膠配膠(緩沖液緩沖液+瓊脂糖）瓊脂糖）u制膠制膠(加入加入EB，0.5g/ml ）u梳子的選擇梳子的選擇u上樣（上樣（loading buffer)uMarker 的作用的作用u運(yùn)動(dòng)方向運(yùn)動(dòng)方向u電泳電泳u分析（低至分析（低至 5ng )u質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA通常具有三種不同的構(gòu)象：通常具有三種不同的構(gòu)象：共價(jià)閉合環(huán)狀、線型、開(kāi)環(huán)型。共價(jià)閉合環(huán)狀、線型、開(kāi)環(huán)型。u電泳時(shí)，一般共價(jià)閉合環(huán)狀的遷移電泳時(shí)，一般共價(jià)閉合環(huán)狀的遷移速度最快，其次為線狀分子，開(kāi)

3、環(huán)速度最快，其次為線狀分子，開(kāi)環(huán)型分子最慢型分子最慢凝膠成像系統(tǒng)凝膠成像系統(tǒng)（1）緩沖液的作用及種類）緩沖液的作用及種類u維持正負(fù)極維持正負(fù)極pH穩(wěn)定：電泳時(shí)正負(fù)極發(fā)生電解反應(yīng)，正極是氧穩(wěn)定：電泳時(shí)正負(fù)極發(fā)生電解反應(yīng)，正極是氧化反應(yīng)（化反應(yīng)（4OH-4e-=2H2O+O2)，負(fù)極是還原反應(yīng)（，負(fù)極是還原反應(yīng)（4H+4e-=2H2)，長(zhǎng)時(shí)間的電泳將使正極變酸，負(fù)極變堿；，長(zhǎng)時(shí)間的電泳將使正極變酸，負(fù)極變堿；u使溶液具有一定的導(dǎo)電性，以利于使溶液具有一定的導(dǎo)電性，以利于DNA分子的遷移；分子的遷移；u電泳緩沖液的電泳緩沖液的EDTA螯合螯合Mg2+ 等離子，失活等離子，失活DNA酶，還可酶，還可防

4、止防止Mg2+離子與核酸生成沉淀。離子與核酸生成沉淀。nTAETAE：超螺旋超螺旋DNADNA電泳時(shí)更符合實(shí)際分子質(zhì)量（電泳時(shí)更符合實(shí)際分子質(zhì)量（TBETBE中大于實(shí)際分子質(zhì)量），中大于實(shí)際分子質(zhì)量），且雙鏈線狀且雙鏈線狀DNADNA在其中的遷移率較其他兩種緩沖液快約在其中的遷移率較其他兩種緩沖液快約10%10%，分離大于，分離大于13kb13kb片段效果更好；回收片段效果更好；回收DNADNA片段時(shí)也選用片段時(shí)也選用TAETAE；但緩沖容量小，不宜長(zhǎng)；但緩沖容量小，不宜長(zhǎng)時(shí)間電泳。時(shí)間電泳。nTBE:TBE:緩沖能力強(qiáng)，適于長(zhǎng)時(shí)間電泳；分離小于緩沖能力強(qiáng)，適于長(zhǎng)時(shí)間電泳；分離小于1kb1kb

5、的片段時(shí)效果更好；用的片段時(shí)效果更好；用于瓊脂糖凝膠時(shí)易造成高電滲作用，并與瓊脂糖相互作用生成非共價(jià)結(jié)于瓊脂糖凝膠時(shí)易造成高電滲作用，并與瓊脂糖相互作用生成非共價(jià)結(jié)合的四羥基硼酸鹽復(fù)合物而使合的四羥基硼酸鹽復(fù)合物而使DNADNA片段的回收率降低，不宜在回收電泳中片段的回收率降低，不宜在回收電泳中使用。使用。nTPETPE：緩沖能力較強(qiáng)，但由于磷酸鹽易在乙醇沉淀過(guò)程中析出，所以也不緩沖能力較強(qiáng)，但由于磷酸鹽易在乙醇沉淀過(guò)程中析出，所以也不宜在回收宜在回收DNADNA片段的電泳中使用。片段的電泳中使用。 （Tris/Acetate/EDTA） （Tris/Borate/EDTA） （Tris/Ph

6、osphrate/EDTA） （2 2）影響）影響DANDAN片段瓊脂糖電泳的因素：片段瓊脂糖電泳的因素：lDNADNA分子的大?。壕€性分子的大小：線性DNADNA的遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)值成的遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)值成反比。反比。l瓊脂糖濃度：分離大小不同的瓊脂糖濃度：分離大小不同的DNADNA片段需要選擇合適的瓊脂片段需要選擇合適的瓊脂糖凝膠濃度。糖凝膠濃度。lDNADNA分子的形態(tài)：在同一濃度的瓊脂糖凝膠中，超螺旋分子的形態(tài)：在同一濃度的瓊脂糖凝膠中，超螺旋DNADNA分子遷移率比線性分子遷移率比線性DNADNA分子快，線性分子快，線性DNADNA分子比開(kāi)環(huán)分子比開(kāi)環(huán)DNADNA分子分子

7、快?？?。l電流強(qiáng)度：每厘米凝膠電壓不超過(guò)電流強(qiáng)度：每厘米凝膠電壓不超過(guò)5V5V，若電壓過(guò)高分辨率，若電壓過(guò)高分辨率會(huì)降低，只有在低電壓時(shí)，線性會(huì)降低，只有在低電壓時(shí)，線性DNADNA分子的電泳遷移率與所分子的電泳遷移率與所用電壓成正比用電壓成正比。500bp500bp以下：聚丙烯酰胺凝膠電泳以下：聚丙烯酰胺凝膠電泳20Kb20Kb以上：脈沖電場(chǎng)凝膠電泳以上：脈沖電場(chǎng)凝膠電泳（3 3）脈沖電場(chǎng)凝膠電泳）脈沖電場(chǎng)凝膠電泳 在單一電場(chǎng)瓊脂糖凝膠中，在單一電場(chǎng)瓊脂糖凝膠中，DNADNA分子的有效直徑超過(guò)凝膠分子的有效直徑超過(guò)凝膠孔徑時(shí)，在電場(chǎng)作用下，迫使孔徑時(shí)，在電場(chǎng)作用下，迫使DNADNA變形變形擠

8、過(guò)篩孔，而沿著泳動(dòng)擠過(guò)篩孔，而沿著泳動(dòng)方向伸直，因而分子大小對(duì)遷移率影響程度較小。而在成一定方向伸直，因而分子大小對(duì)遷移率影響程度較小。而在成一定角度的雙電場(chǎng)中，電場(chǎng)方向的改變會(huì)使角度的雙電場(chǎng)中，電場(chǎng)方向的改變會(huì)使DNADNA分子重新變形后才分子重新變形后才能在新方向上通過(guò)凝膠篩孔，能在新方向上通過(guò)凝膠篩孔，DNADNA分子的分子的變形與改向變形與改向與其分子與其分子大小相關(guān)程度更高，在交替變換電場(chǎng)方向、電場(chǎng)強(qiáng)度的條件下大小相關(guān)程度更高，在交替變換電場(chǎng)方向、電場(chǎng)強(qiáng)度的條件下可以分離大分子量可以分離大分子量DNADNA分子（分子（10M).10M).1.2 1.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝

9、膠電泳(PAGE)(PAGE)u由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺在酰胺在催化作用催化作用下形成的三維網(wǎng)狀結(jié)下形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有分子篩效應(yīng)，構(gòu)凝膠，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有分子篩效應(yīng)，可以分離大小不同的可以分離大小不同的DNADNA分子分子 。u分辨率高，僅差分辨率高，僅差1bp1bp的的DNADNA分子也能清分子也能清晰地分開(kāi)（孔徑比瓊脂糖凝膠?。Ｎ胤珠_(kāi)（孔徑比瓊脂糖凝膠?。?。u可用于分離單鏈核酸分子：如可用于分離單鏈核酸分子：如RNARNA、引、引物等物等u裝載的樣品量大，回收的裝載的樣品量大，回收的DNADNA純度高純度高 聚合過(guò)程需要有自由基

10、催化完成聚合過(guò)程需要有自由基催化完成, , 過(guò)硫酸銨（過(guò)硫酸銨（APAP）為催化劑，四甲基乙二胺）為催化劑，四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）為加速劑）為加速劑 主要內(nèi)容主要內(nèi)容1.1.凝膠電泳凝膠電泳2.2.核酸印記核酸印記3.PCR3.PCR2. 核酸印跡核酸印跡 2.1 Southern Blotting原理：原理： 待測(cè)的待測(cè)的DNADNA分子分子切割切割后，通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行后，通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行分離分離，繼而，繼而將其將其變性變性，并按其在凝膠中的位置，并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，尼龍膜上，固定固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的后再與同位

11、素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNADNA或或RNARNA探針進(jìn)行探針進(jìn)行雜交雜交反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過(guò)堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針則二者通過(guò)堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌洗滌后用自后用自顯影顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而顯示出待檢的片段及或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而顯示出待檢的片段及其相對(duì)大小。其相對(duì)大小。 用途：用途：n 檢測(cè)樣品中是否含有目的檢測(cè)樣品中是否含有目的DNADNAn 了解目的了解目的DNADNA的大小、方便基因的獲取的大小、方便基因的獲取n 檢測(cè)基因拷貝數(shù)檢測(cè)基因拷貝數(shù) 1975年，英國(guó)愛(ài)丁堡大學(xué)的年，

12、英國(guó)愛(ài)丁堡大學(xué)的Southern EM首創(chuàng)了首創(chuàng)了DNA分子雜交分子雜交方法，稱之為方法，稱之為Southern印跡轉(zhuǎn)移印跡轉(zhuǎn)移 實(shí)驗(yàn)流程：實(shí)驗(yàn)流程：Southern BlottingSouthern Blotting應(yīng)用舉例：基因及其旁側(cè)序列的酶切位點(diǎn)檢測(cè)應(yīng)用舉例：基因及其旁側(cè)序列的酶切位點(diǎn)檢測(cè) 3kb2kb1kb1kbEEEE2.2 Northern Blotting 原理：在變性條件下將待檢的原理：在變性條件下將待檢的RNARNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同繼而按照同Southern BlottingSouthern Blotting相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探

13、針相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測(cè)。進(jìn)行雜交檢測(cè)。 用途：檢測(cè)樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（用途：檢測(cè)樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNAmRNA）及其含）及其含量。量。 與與SouthernSouthern雜交的不同雜交的不同 靶核酸：靶核酸：RNARNA SouthernSouthern是先電泳后變性，而是先電泳后變性，而NorthernNorthern是電泳前變性；是電泳前變性； SouthernSouthern是堿變性，而是堿變性，而NorthernNorthern采用甲醛、乙二醛、二甲采用甲醛、乙二醛、二甲基亞砜等變性，因?yàn)椴捎脡A變性會(huì)導(dǎo)致基亞砜等變性，因?yàn)椴捎脡A變性會(huì)導(dǎo)致R

14、NARNA水解水解 1977年年, Stark GR建立了建立了RNA分子雜交技術(shù)，被稱為分子雜交技術(shù)，被稱為Northern印跡轉(zhuǎn)移印跡轉(zhuǎn)移 2.3 Western Blotting 原理：在變性條件下將待檢的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行原理：在變性條件下將待檢的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGESDS-PAGE凝凝膠電泳，繼而按照同膠電泳，繼而按照同Southern BlottingSouthern Blotting相同的原理進(jìn)行相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，然后利用探針進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相轉(zhuǎn)膜，然后利用探針進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為探針（一抗）進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，應(yīng)抗體作為探針

15、（一抗）進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過(guò)融合部分的抗體進(jìn)行檢測(cè)?？赏ㄟ^(guò)融合部分的抗體進(jìn)行檢測(cè)。 用途：檢測(cè)復(fù)雜生物樣品中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平或含量。用途：檢測(cè)復(fù)雜生物樣品中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平或含量。 樣品變性處理樣品變性處理：uSDSSDS：破壞氫鍵、結(jié)合蛋白：破壞氫鍵、結(jié)合蛋白u(yù)-巰基乙醇：破壞二硫鍵巰基乙醇：破壞二硫鍵u高溫處理：使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)高溫處理：使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)使整個(gè)蛋白充分結(jié)合使整個(gè)蛋白充分結(jié)合SDSSDS，帶上負(fù)電荷。，帶上負(fù)電荷。 SDS-PAGESDS-PAGE凝膠電泳凝膠電泳u濃縮膠：濃縮膠：pH6.8, pH6.8

16、, 濃度濃度3 3，交聯(lián)度低、孔徑大、利于所有交聯(lián)度低、孔徑大、利于所有蛋白質(zhì)在分離膠前集中成一條蛋白質(zhì)在分離膠前集中成一條很細(xì)的區(qū)帶很細(xì)的區(qū)帶u分離膠：分離膠： pH8.8pH8.8按照分子量按照分子量大小分開(kāi)蛋白質(zhì)大小分開(kāi)蛋白質(zhì)分離膠的選擇分離膠的選擇SDS-PAGESDS-PAGE垂直電泳系統(tǒng)垂直電泳系統(tǒng)印跡印跡u固相材料：固相材料：NC NC 膜、膜、DBMDBM、DDTDDT、尼龍膜、尼龍膜、PVDF PVDF （聚偏二氟（聚偏二氟乙烯）乙烯） 等。等。PVDFPVDF具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性有更好的化學(xué)兼容性u(píng)方法：

17、毛細(xì)管印跡法方法：毛細(xì)管印跡法( (效率較低，僅轉(zhuǎn)移效率較低，僅轉(zhuǎn)移10102020蛋白，較蛋白，較慢）和電泳印跡法（快速高效）慢）和電泳印跡法（快速高效）封閉封閉 用用BSABSA或脫脂奶等將膜上未結(jié)合蛋白質(zhì)的位點(diǎn)封閉，以免或脫脂奶等將膜上未結(jié)合蛋白質(zhì)的位點(diǎn)封閉，以免這些位點(diǎn)和后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的抗體結(jié)合而干擾分析這些位點(diǎn)和后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的抗體結(jié)合而干擾分析。探針雜交探針雜交u用待測(cè)蛋白質(zhì)的抗血清（一抗）處理膜上的印跡，印跡中只用待測(cè)蛋白質(zhì)的抗血清（一抗）處理膜上的印跡，印跡中只有待測(cè)蛋白質(zhì)與一抗結(jié)合，而其它蛋白質(zhì)不與一抗結(jié)合。有待測(cè)蛋白質(zhì)與一抗結(jié)合，而其它蛋白質(zhì)不與一抗結(jié)合。u清洗去除未結(jié)合的一抗后，

18、進(jìn)一步用適當(dāng)標(biāo)記的二抗處理，清洗去除未結(jié)合的一抗后，進(jìn)一步用適當(dāng)標(biāo)記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，可以指二抗是指一抗的抗體，帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，可以指示一抗的位置，即待測(cè)蛋白質(zhì)的條帶位置。示一抗的位置，即待測(cè)蛋白質(zhì)的條帶位置。u除了使用抗體或蛋白作為檢測(cè)探針外，也可用其它探針如放除了使用抗體或蛋白作為檢測(cè)探針外，也可用其它探針如放射性標(biāo)記的射性標(biāo)記的DNADNA，可以檢測(cè)印跡中的，可以檢測(cè)印跡中的DNA DNA 結(jié)合蛋白。結(jié)合蛋白。n 二抗標(biāo)記方法二抗標(biāo)記方法u 酶聯(lián)（標(biāo)）法：如堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二酶聯(lián)（標(biāo)）法：如堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二

19、抗，抗， 這些酶可以催化某種顯色反應(yīng)。這些酶可以催化某種顯色反應(yīng)。u 熒光素標(biāo)記法：主要有異硫氰酸熒光素?zé)晒馑貥?biāo)記法：主要有異硫氰酸熒光素(FITC)(FITC)或羅達(dá)明或羅達(dá)明 (Lissamine rhodamine B200)(Lissamine rhodamine B200)。u 同位素標(biāo)記法：同位素標(biāo)記法：125I Iu 高密度金屬標(biāo)記：金標(biāo)記高密度金屬標(biāo)記：金標(biāo)記u二抗針對(duì)某一特定物種（如小鼠）的所有抗體均具有特異二抗針對(duì)某一特定物種（如小鼠）的所有抗體均具有特異性，因而使用標(biāo)記的二抗可以免去對(duì)每一個(gè)一抗進(jìn)行標(biāo)記，性，因而使用標(biāo)記的二抗可以免去對(duì)每一個(gè)一抗進(jìn)行標(biāo)記，大大節(jié)省了時(shí)間和

20、費(fèi)用；此外，一個(gè)一抗分子可以同時(shí)結(jié)大大節(jié)省了時(shí)間和費(fèi)用；此外，一個(gè)一抗分子可以同時(shí)結(jié)合幾個(gè)二抗分子，從而使信號(hào)大大增強(qiáng)，提高了實(shí)驗(yàn)靈敏合幾個(gè)二抗分子，從而使信號(hào)大大增強(qiáng)，提高了實(shí)驗(yàn)靈敏度。度。 斑點(diǎn)雜交（斑點(diǎn)雜交（DotDot blotblot）u將核酸樣品變性后直接點(diǎn)樣于濾膜上，烤干或紫外線照射以將核酸樣品變性后直接點(diǎn)樣于濾膜上，烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，然后與探針進(jìn)行雜交的方法稱斑點(diǎn)雜交或狹縫雜固定標(biāo)本，然后與探針進(jìn)行雜交的方法稱斑點(diǎn)雜交或狹縫雜交。斑點(diǎn)印跡為斑點(diǎn)狀，狹縫印跡為線狀。交。斑點(diǎn)印跡為斑點(diǎn)狀，狹縫印跡為線狀。u斑點(diǎn)雜交耗時(shí)短，可做半定量分析，一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多斑點(diǎn)雜交耗時(shí)短

21、，可做半定量分析，一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。多用于病原體基因，如微生物的基因，但也可用于個(gè)樣品。多用于病原體基因，如微生物的基因，但也可用于檢查人類基因組中的檢查人類基因組中的DNADNA序列。序列。原位雜交（原位雜交（inin situsitu hybridizationhybridization）u將噬菌斑或菌落從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將噬菌斑或菌落從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNADNA。將。將DNADNA烘干固定于膜上與烘干固定于膜上與32P32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)，并與標(biāo)記的探針雜交，放

22、射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)，并與平板上的菌落對(duì)位。平板上的菌落對(duì)位。u可以用于篩選大量標(biāo)本，因?yàn)樗辜?xì)胞或噬菌體直接在膜上可以用于篩選大量標(biāo)本，因?yàn)樗辜?xì)胞或噬菌體直接在膜上溶解，所以溶解，所以DNADNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P32P標(biāo)記的探針雜交，但它不適用于非放射性標(biāo)記探針，因標(biāo)記的探針雜交，但它不適用于非放射性標(biāo)記探針，因?yàn)闉镈NADNA純度不夠，會(huì)產(chǎn)生高本底。純度不夠，會(huì)產(chǎn)生高本底。 2.4 2.4 其他印跡雜交技術(shù)其他印跡雜交技術(shù)原位雜交篩選原位雜交篩選對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找

23、出陽(yáng)性菌落找出陽(yáng)性菌落,多多用于從基因文庫(kù)中篩選目標(biāo)基因。用于從基因文庫(kù)中篩選目標(biāo)基因。組織原位雜交篩選組織原位雜交篩選 細(xì)胞或組織經(jīng)處理后不裂解，而是通透性增加使探針進(jìn)細(xì)胞或組織經(jīng)處理后不裂解，而是通透性增加使探針進(jìn)入細(xì)胞或組織內(nèi)部，確定目的核酸分子在細(xì)胞內(nèi)的位置入細(xì)胞或組織內(nèi)部，確定目的核酸分子在細(xì)胞內(nèi)的位置主要內(nèi)容主要內(nèi)容1.1.凝膠電泳凝膠電泳 瓊脂糖，瓊脂糖，PAGEPAGE，脈沖場(chǎng)，脈沖場(chǎng)2.2.核酸印記核酸印記 Southern, Northern,Western BlottingSouthern, Northern,Western Blotting 原位雜交原位雜交3.PCR3

24、.PCR3. PCR (Polymerase Chain Reaction)3.1 基本原理基本原理PCRPCR由變性由變性-退火退火-延伸三個(gè)延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：u模板模板DNADNA的變性：模板的變性：模板DNADNA經(jīng)經(jīng)加熱至加熱至9494左右一定時(shí)間后，左右一定時(shí)間后，使模板使模板DNADNA雙鏈解鏈成單鏈，雙鏈解鏈成單鏈，以便它與引物互補(bǔ)結(jié)合，為下以便它與引物互補(bǔ)結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；u模板模板DNADNA與引物的退火：模板與引物的退火：模板DNADNA變性后，溫度降至變性后，溫度降至5555左左右，引物與模板右，引物與模板DNADNA單鏈的互

25、單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；變性變性退火退火延伸延伸u引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板-引引物結(jié)合物在物結(jié)合物在DNADNA聚合酶的作用聚合酶的作用下，以下，以dNTPdNTP為反應(yīng)原料，靶為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配合成序列為模板，按堿基配合成一條新的與模板一條新的與模板DNA DNA 鏈互補(bǔ)鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。的半保留復(fù)制鏈。u重復(fù)循環(huán)變性重復(fù)循環(huán)變性-退火退火-延伸延伸三過(guò)程，就可獲得更多的三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈半保留復(fù)制鏈”，而且這，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需模板。每完成一個(gè)循環(huán)需 2 24

26、 4分鐘，分鐘，2 23 3小時(shí)就能將小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。萬(wàn)倍。3.2 反應(yīng)體系反應(yīng)體系反應(yīng)體系包括引物、模板、反應(yīng)體系包括引物、模板、dNTP、DNA聚合酶、緩沖液聚合酶、緩沖液引物引物：和模板配對(duì)的序列一般長(zhǎng)：和模板配對(duì)的序列一般長(zhǎng)20bp左右，在引物的左右，在引物的5端可加端可加上上RBS、啟動(dòng)子、或限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列。而、啟動(dòng)子、或限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列。而3端必須嚴(yán)格端必須嚴(yán)格配對(duì)。濃度一般為配對(duì)。濃度一般為0.5 M，濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)征。，濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)征。模板模板：模板可以是：模板可以是DNA片段、質(zhì)粒、染色體，甚至可

27、以直接在片段、質(zhì)粒、染色體，甚至可以直接在反應(yīng)體系中加入細(xì)胞來(lái)提供模板。粗制的模板加入量不宜過(guò)多，反應(yīng)體系中加入細(xì)胞來(lái)提供模板。粗制的模板加入量不宜過(guò)多，以避免雜質(zhì)（核酸酶、蛋白酶等）對(duì)反應(yīng)的抑制作用。以避免雜質(zhì)（核酸酶、蛋白酶等）對(duì)反應(yīng)的抑制作用。dNTP：一般加入量為：一般加入量為200 M，過(guò)高濃度會(huì)提高錯(cuò)配幾率。，過(guò)高濃度會(huì)提高錯(cuò)配幾率。DNA聚合酶聚合酶：根據(jù)不同酶產(chǎn)品，按推薦量添加。：根據(jù)不同酶產(chǎn)品，按推薦量添加。緩沖液：緩沖液：主要成分為主要成分為50mM KCl，10mM Tris-HCl和和1.5 Mm MgCl2 Taq DNA聚合酶的濃度：聚合酶的濃度： 1.02.5 U

28、/100 l反應(yīng)液反應(yīng)液dNTP的濃度：的濃度： 20200 mol/L。Mg2+濃度：濃度： 0.52.5 mmol/L。引物的濃度：引物的濃度： 0.10.5 mol/L 3.3 PCR引物的設(shè)計(jì)原則引物的設(shè)計(jì)原則 u 引物應(yīng)用核酸序列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具引物應(yīng)用核酸序列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性有特異性引物與非特異性擴(kuò)增序列的同源性不應(yīng)超過(guò)引物與非特異性擴(kuò)增序列的同源性不應(yīng)超過(guò)70%，避免有連續(xù)避免有連續(xù)8個(gè)以上堿基同源個(gè)以上堿基同源。 u 產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。u 引物長(zhǎng)度一般在引物長(zhǎng)度一般在1530堿基之間。堿基之間。u G+C含量在含量在40%60%之間。之間。u

29、堿基要隨機(jī)分布。堿基要隨機(jī)分布。u 引物自身、引物之間不能有連續(xù)引物自身、引物之間不能有連續(xù)4個(gè)個(gè)以上堿基的互補(bǔ)以上堿基的互補(bǔ)u 引物引物5端可以修飾。端可以修飾。u 引物引物3端不可修飾，也不能形成任何端不可修飾，也不能形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)。二級(jí)結(jié)構(gòu)。u 簡(jiǎn)并引物：簡(jiǎn)并引物：3端要避開(kāi)密碼子的第端要避開(kāi)密碼子的第3位。位。53產(chǎn)物（1） 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR (ReverseTranscription PCR)u 經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶的作用把經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶的作用把RNARNA反轉(zhuǎn)錄成反轉(zhuǎn)錄成cDNAcDNA后再通過(guò)后再通過(guò)PCRPCR擴(kuò)增。擴(kuò)增。u 應(yīng)用于應(yīng)用于RNARNA的構(gòu)造解析、的構(gòu)造解析、cDNAc

30、DNA的克隆及的克隆及RNARNA水平上的表達(dá)解析水平上的表達(dá)解析等多種領(lǐng)域。等多種領(lǐng)域。 3.4 主要的主要的PCR應(yīng)用技術(shù)應(yīng)用技術(shù) 一步法一步法RT-PCR(2) 重疊延伸重疊延伸PCR SOEPCR(gene splicing by overlap extension 重疊延伸重疊延伸PCRPCR 技術(shù)是一種通過(guò)寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分技術(shù)是一種通過(guò)寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板互相搭橋、互為模板, ,通過(guò)多次通過(guò)多次PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增, ,從而獲得目的從而獲得目的DNA DNA 基因片段的方法基因片段的方法. .u 相連引物間的重疊區(qū)域以相連引物間的重疊區(qū)域以1515

31、20 20 個(gè)堿基為宜個(gè)堿基為宜u不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理，不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理，操作非常簡(jiǎn)便操作非常簡(jiǎn)便u 可用于體外進(jìn)行可用于體外進(jìn)行定點(diǎn)突變定點(diǎn)突變或或DNADNA片段連接片段連接, , 可用于大片段可用于大片段基因的人工合成基因的人工合成, , 也可在兩片段間也可在兩片段間插入短序列插入短序列。u 成功率高成功率高. .省去了常規(guī)亞克隆的煩瑣工作省去了常規(guī)亞克隆的煩瑣工作. .重疊延伸重疊延伸PCRPCR原理原理A1 A2 B1 B2 33555533A1 B2 A1 B2 (3)(3)反向反向PCRPCR反向反向PCRPCR是用于擴(kuò)增、克隆已知是用于擴(kuò)增、克隆已知DNAD

32、NA區(qū)段上下游旁側(cè)區(qū)段的區(qū)段上下游旁側(cè)區(qū)段的PCRPCR方法，可以用于確定未知的旁側(cè)方法，可以用于確定未知的旁側(cè)DNADNA序列。序列。原理圖：原理圖：如果已知序列為轉(zhuǎn)座子，可以高通量的進(jìn)行基因型如果已知序列為轉(zhuǎn)座子，可以高通量的進(jìn)行基因型- -表型關(guān)系的鑒定和研究表型關(guān)系的鑒定和研究（4）多重）多重PCR 多重多重PCR(multiplex PCR)，又稱多重引物，又稱多重引物PCR或復(fù)合或復(fù)合PCR，它是在同一它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對(duì)以上反應(yīng)體系里加上二對(duì)以上引物引物，同時(shí)擴(kuò)增出，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過(guò)反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)

33、試劑和操作過(guò)程與一般程與一般PCR相同相同多重多重PCR的主要用于多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)或鑒定的主要用于多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)或鑒定, 或者或者病原微生物、某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。病原微生物、某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。 在同一在同一PCR反應(yīng)管中同時(shí)加上多種病原微生物的特異性引物，反應(yīng)管中同時(shí)加上多種病原微生物的特異性引物，進(jìn)行進(jìn)行PCR擴(kuò)增擴(kuò)增.可用于同時(shí)檢測(cè)多種病原體或鑒定出是那一型可用于同時(shí)檢測(cè)多種病原體或鑒定出是那一型病原體感染病原體感染 在疾病診斷方面可以節(jié)省大量時(shí)間和病人在疾病診斷方面可以節(jié)省大量時(shí)間和病人DNA樣品樣品（5）不對(duì)稱）不對(duì)稱PCR（asymmetric

34、 PCR）不對(duì)稱不對(duì)稱PCRPCR：用不等量的引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)生大量單鏈：用不等量的引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)生大量單鏈DNADNA的的PCRPCR方法方法, ,用于用于DNADNA測(cè)序測(cè)序和和探針制備探針制備 兩條引物的比例兩條引物的比例50:1100:1， 先產(chǎn)生雙鏈先產(chǎn)生雙鏈DNA，量少的引物耗完后開(kāi)始產(chǎn)，量少的引物耗完后開(kāi)始產(chǎn)生單鏈生單鏈DNA，PCR結(jié)束后通過(guò)電泳分離單、雙鏈結(jié)束后通過(guò)電泳分離單、雙鏈DNA，回收單鏈，回收單鏈DNA（6）嵌套）嵌套PCR（nested primer PCR）嵌套嵌套PCR：是指用兩對(duì)引物擴(kuò)增是指用兩對(duì)引物擴(kuò)增一個(gè)目標(biāo)片段的一個(gè)目標(biāo)片段的PCR，第一對(duì)引，第一對(duì)引物序列

35、在第二對(duì)引物序列的外側(cè)物序列在第二對(duì)引物序列的外側(cè)（外引物和內(nèi)引物）。（外引物和內(nèi)引物）。如果內(nèi)側(cè)引物的特異性比較差，如果內(nèi)側(cè)引物的特異性比較差，使用該引物不能使靶序列得到有使用該引物不能使靶序列得到有效擴(kuò)增。這時(shí)可以先用特異性好效擴(kuò)增。這時(shí)可以先用特異性好的外側(cè)引物進(jìn)行的外側(cè)引物進(jìn)行PCR，然后將其，然后將其擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，用內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，用內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行第二次進(jìn)行第二次PCR。反之，如果外側(cè)引物特異性較差，反之，如果外側(cè)引物特異性較差，通過(guò)內(nèi)側(cè)引物再次通過(guò)內(nèi)側(cè)引物再次PCR也能提高也能提高特異性（兩對(duì)引物均可擴(kuò)增同一特異性（兩對(duì)引物均可擴(kuò)增同一條非特異性條帶的可能性很?。l非特

36、異性條帶的可能性很?。┌肭短装肭短譖CR：三條引物，其中一：三條引物，其中一條同時(shí)充當(dāng)外引物和內(nèi)引物。條同時(shí)充當(dāng)外引物和內(nèi)引物。（7）熱啟動(dòng)）熱啟動(dòng)PCR（hot start PCR）熱啟動(dòng)熱啟動(dòng)PCR: 溫度溫度 超過(guò)超過(guò)70才能進(jìn)行才能進(jìn)行DNA聚合反應(yīng)的聚合反應(yīng)的PCR。一般一般Taq DNA聚合酶在低溫條件下也有活性，如果引物特異性差，當(dāng)聚合酶在低溫條件下也有活性，如果引物特異性差，當(dāng)PCR反應(yīng)體系配置完成之后，如果模板中有部分單鏈，有可能部分引物反應(yīng)體系配置完成之后，如果模板中有部分單鏈，有可能部分引物在錯(cuò)誤位點(diǎn)結(jié)合進(jìn)行非特異性擴(kuò)增。在錯(cuò)誤位點(diǎn)結(jié)合進(jìn)行非特異性擴(kuò)增。l 模板預(yù)熱法（模

37、板預(yù)熱法（70 后加入引物和酶等物質(zhì)）后加入引物和酶等物質(zhì)）l 蠟防護(hù)層法蠟防護(hù)層法l 改進(jìn)的耐熱改進(jìn)的耐熱DNA聚合酶（聚合酶（94 高溫處理后才具有活性）高溫處理后才具有活性）（8）免疫）免疫PCR（immuno PCR）免疫免疫PCR：是是1992年年Sano建立的一種檢測(cè)微量抗原的高靈敏度技術(shù)。該建立的一種檢測(cè)微量抗原的高靈敏度技術(shù)。該技術(shù)把抗原抗體反應(yīng)的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高敏感性有機(jī)結(jié)合起技術(shù)把抗原抗體反應(yīng)的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高敏感性有機(jī)結(jié)合起來(lái)，利用抗原抗體反應(yīng)的特異性和來(lái)，利用抗原抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴(kuò)增反應(yīng)的極高靈敏性而建立的擴(kuò)增反應(yīng)的極高靈敏性而建立的一種微量

38、抗原檢測(cè)技術(shù)。其本質(zhì)是一種以一種微量抗原檢測(cè)技術(shù)。其本質(zhì)是一種以PCR擴(kuò)增一段擴(kuò)增一段DNA報(bào)告分子報(bào)告分子代代替酶反應(yīng)來(lái)放大抗原抗體結(jié)合率的一種改良型替酶反應(yīng)來(lái)放大抗原抗體結(jié)合率的一種改良型ELISA。 抗原抗原親和素親和素標(biāo)記的抗體標(biāo)記的抗體+DNA報(bào)告分子報(bào)告分子生物素生物素PCR 檢測(cè)檢測(cè)降落降落PCR ：是一種設(shè)計(jì)多循環(huán)以使相連循環(huán)的退火溫度越來(lái)越低：是一種設(shè)計(jì)多循環(huán)以使相連循環(huán)的退火溫度越來(lái)越低,從而達(dá)從而達(dá)到最佳擴(kuò)增條件的到最佳擴(kuò)增條件的PCR方法。方法。 反應(yīng)過(guò)程中起始退火溫度高于反應(yīng)過(guò)程中起始退火溫度高于Tm 值值,隨著循環(huán)的進(jìn)行隨著循環(huán)的進(jìn)行,退火溫度逐漸降退火溫度逐漸降低

39、到低到Tm 值值,從而確保第一個(gè)引物從而確保第一個(gè)引物- 模板雜交事件發(fā)生在最互補(bǔ)的反應(yīng)物之模板雜交事件發(fā)生在最互補(bǔ)的反應(yīng)物之間間,退火溫度最終低于退火溫度最終低于Tm 值。值。 退火溫度的范圍可跨越退火溫度的范圍可跨越15 ,從高于從高于Tm 5 至低于至低于Tm 10 左右左右,條件允條件允許的話許的話,退火溫度可以退火溫度可以1 2 遞降。盡管退火溫度最終會(huì)降低到非特異遞降。盡管退火溫度最終會(huì)降低到非特異性雜交的性雜交的Tm 值值,但此時(shí)目的擴(kuò)增產(chǎn)物已開(kāi)始幾何擴(kuò)增但此時(shí)目的擴(kuò)增產(chǎn)物已開(kāi)始幾何擴(kuò)增,在剩余循環(huán)中將超過(guò)在剩余循環(huán)中將超過(guò)任何非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增量。任何非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增量。 降

40、落降落PCR 是一種潛在的一步法找到最佳退火溫度的方法是一種潛在的一步法找到最佳退火溫度的方法,大大提高了工大大提高了工作效率，保證特異性條帶被優(yōu)先擴(kuò)增出來(lái)。作效率，保證特異性條帶被優(yōu)先擴(kuò)增出來(lái)。 （9）降落）降落PCR（touch down PCR）(10) (10) 實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCR(RealPCR(Real time PCR) time PCR)原理原理u通過(guò)對(duì)通過(guò)對(duì) PCR PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。u在實(shí)時(shí)熒光定量在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR PC

41、R 反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著質(zhì)，隨著 PCR PCR 反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)的進(jìn)行， PCR PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖?；O(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。 定量點(diǎn)的選擇定量點(diǎn)的選擇終點(diǎn)定量誤差大終點(diǎn)定量誤差大起點(diǎn)定量信號(hào)過(guò)低，易受背景信起點(diǎn)定量信號(hào)過(guò)低，易受背景信號(hào)干擾號(hào)干擾9696個(gè)相同樣品的擴(kuò)增個(gè)相同樣品的擴(kuò)增基線期基線期平臺(tái)期平臺(tái)期 基線代表背景信號(hào)，一般前基線代表背景信號(hào)，一般前3 31515循環(huán)所產(chǎn)生的信號(hào)循環(huán)所產(chǎn)生的信號(hào)被背景掩蓋，這些循環(huán)的熒光信號(hào)可用基線信號(hào)表示。被背景掩蓋，這些循環(huán)的熒光信號(hào)可用基線信號(hào)表示。 一般選定基線信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的一般選定基線信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的1010倍作為熒光信號(hào)的閾倍作為熒光信號(hào)的閾值，熒光信號(hào)到達(dá)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)為值，熒光信號(hào)到達(dá)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)為C CT T值，該值和初值，該值和初始始DNADNA模板數(shù)目的對(duì)數(shù)成反比。模板數(shù)目的對(duì)數(shù)成反比。CTR RB B: :背景熒光信號(hào)背景熒光信號(hào)R RS S: :單位分