蛋白質(zhì)氨基酸測(cè)定

1、蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定1 概述2 凱氏定氮法3 蛋白質(zhì)的快速測(cè)定法4 氨基酸總量的測(cè)定5 氨基酸的分離與測(cè)定主主 要要 內(nèi)內(nèi) 容容1 概述概述（1）蛋白質(zhì)的生理功用及在食品中的作用）蛋白質(zhì)的生理功用及在食品中的作用（2）食品中的蛋白質(zhì)含量）食品中的蛋白質(zhì)含量（3）蛋白質(zhì)系數(shù)）蛋白質(zhì)系數(shù)（4）蛋白質(zhì)水解）蛋白質(zhì)水解（5）蛋白質(zhì)測(cè)定方法）蛋白質(zhì)測(cè)定方法 蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的重要成分，是生物體發(fā)育及修補(bǔ)組織的原料，一切有生命的活體都含有不同類型的蛋白質(zhì)。 人體的酸堿平衡、水平衡的維持； 遺傳信息的傳遞； 物質(zhì)的代謝及運(yùn)轉(zhuǎn)都與蛋白質(zhì)有關(guān)。 人及動(dòng)物只能從食品

2、得到蛋白質(zhì)及其分解產(chǎn)物，來(lái)構(gòu)成自身的蛋白質(zhì)，是人體重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 食品的重要營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)。(2) 食品中的蛋白質(zhì)含量食品中的蛋白質(zhì)含量 在各種不同的食品中蛋白質(zhì)的含量各不相同，一般說(shuō)來(lái)動(dòng)物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品， 測(cè)定食品中蛋白質(zhì)的含量，對(duì)于評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、合理開(kāi)發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過(guò)程控制均具有極重要的意義。（3）蛋白質(zhì)系數(shù)）蛋白質(zhì)系數(shù) 蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物，分子量很大，大部分高達(dá)數(shù)萬(wàn)數(shù)百萬(wàn)，。由20種氨基酸通過(guò)酰胺鍵以一定的方式結(jié)合起來(lái)，并具有一定的空間結(jié)構(gòu)，所含的主要化學(xué)元素為C、H、O、N,在某些蛋白質(zhì)中還含有微量的P、Cu、

3、Fe、I等元素，但含氮?jiǎng)t是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。 不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量也不同，一般蛋白質(zhì)含氮量為16%，即一 份氮素相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。 不同種類食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米，蕎麥，青豆，雞蛋等為6.25，花生為5.46，大米為5.95，大豆及其制品為5.71，小麥粉為5.70，牛乳及其制品為6.38。 （4）蛋白質(zhì)水解）蛋白質(zhì)水解 在構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸中，亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸等8種氨基酸在人體內(nèi)不能合成，必須依靠食品提供，故被稱為必需氨基酸，他們

4、對(duì)人體有極其重要的生理作用。 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)胨胨肽肽氨基酸氨基酸（5）蛋白質(zhì)測(cè)定方法）蛋白質(zhì)測(cè)定方法 測(cè)定蛋白質(zhì)的方法可分為兩大類： 一類是利用蛋白質(zhì)的共性，即含氮量 、肽鍵和折射率測(cè)定蛋白質(zhì)含量 ； 另一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸性和堿性基團(tuán)以及芳香基團(tuán)等測(cè)定蛋白質(zhì)含量。 蛋白質(zhì)的測(cè)定，目前多采用將蛋白質(zhì)消化，測(cè)定其含氮量，再換算為蛋白質(zhì)含量的凱氏定氮法。不同食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同。 凱氏定氮法是測(cè)定總有機(jī)氮量較為準(zhǔn)確、操作較為簡(jiǎn)單的方法之一，可用于所有動(dòng)、植物食品的分析及各種加工食品的分析，可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，故國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較為普遍，是個(gè)經(jīng)典分析方法，至今仍 被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。2

5、凱氏定氮法：常量法、微量法及經(jīng)改進(jìn)后的改良凱氏定氮法。 微量凱氏定氮法樣品質(zhì)量及試劑用量較少，且有一套微量凱氏定氮器。 目前通用以硫酸銅作催化劑的常量、半微量、微量凱氏定氮法。 在凱氏法改良中主要的問(wèn)題是，氮化合物中氮的完全氨化問(wèn)題及縮短時(shí)間、簡(jiǎn)化操作的問(wèn)題，即分解試樣所用的催化劑。 常量改良凱氏定氮法在催化劑中增加了二氧化鈦。(1) 原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。有機(jī)物脫水后被炭化為碳、氫

6、、氮。，將有機(jī)物炭化后的碳化為二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫 2H2SO4 C 2SO2 2H2O CO2 二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。 蒸餾蒸餾在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣，反應(yīng)方程式如下： ：加熱蒸餾所放出的氨，可用硼酸溶液進(jìn)行吸收，待吸收完全后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性（k5.810-10），用酸滴定不影響指示劑的變色反應(yīng)，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反應(yīng)方程式如下：a(2) (2) 適用范圍適用范圍 此法可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定(3)(3)儀儀器器500ml

7、凱氏燒瓶；定氮蒸餾裝置(4)(4)試劑試劑硫酸銅 ； 硫酸鉀； 硫酸； 40gL硼酸溶液； 混合指示劑； 400gL氫氧化鈉；0.1molL鹽酸 標(biāo)準(zhǔn)溶液2.3 樣品的分解條件樣品的分解條件（1）K2SO4或Na2SO4 ：提高溶液的沸點(diǎn)（2）催化劑 CuSO4 氧化汞和汞 良好的催化劑，但劇毒； 硒粉（3）氧化劑 過(guò)氧化氫硫酸鉀 加入硫酸鉀可以提高溶液的沸點(diǎn)而加快有機(jī)物的分解，它與硫酸鉀作用生成硫酸氫鉀可提高反應(yīng)溫度一般純硫酸的沸點(diǎn)在340攝氏度左右，而添加硫酸鉀后，可使溫度提高到4000C以上，原因主要在于隨著消化過(guò)程中硫酸不斷地被分解 ，水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大 ，故沸點(diǎn)升高，其反

8、應(yīng)式如下： K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過(guò)高，又會(huì)引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失： （NH4）2SO4=NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O除硫酸鉀外也可加入硫酸鈉，氯化鉀等鹽類來(lái)提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。硫酸銅 CuSO4 催化劑 2CuSO4=CuSO4+SO2+O2 C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2+O2 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2 此反應(yīng)不斷進(jìn)行，待有機(jī)物被消化完后，不再有硫酸亞銅（褐色）生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)

9、綠色。 可以指示消化終點(diǎn)的到達(dá) 下一步蒸餾時(shí)作為堿性反應(yīng)的指示劑。(5) 操作步驟操作步驟樣品消化：樣品消化：準(zhǔn)確稱取均勻的固體樣品0.53g,或半固體樣品25g,或吸取溶液樣品1525ml。小心移入干燥的凱氏燒瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入0.51g硫酸銅、10g硫酸鉀及25ml濃硫酸，小心搖勻后，于瓶口置一小漏斗，瓶頸45角傾斜置電爐上，在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱消化。先以小火緩慢加熱，待內(nèi)容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力消化至溶液呈藍(lán)綠色。取下漏斗，繼續(xù)加熱0.5h，冷卻至室溫。 蒸餾蒸餾、吸收吸收冷凝管下端浸入接受瓶液面之下（瓶?jī)?nèi)預(yù)先裝有50ml 40gL硼酸溶液及混合指示劑56滴）。 滴定：將接

10、受瓶?jī)?nèi)的硼酸液用0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點(diǎn)。同時(shí)做一試劑空白（除不加樣品，從消化開(kāi)始操作完全相同）。式中W蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%； c鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L； V1空白滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，mL； V2試劑滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，mL； m樣品質(zhì)量，g； 0.014氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol； F蛋白質(zhì)系數(shù)。100014. 0)(12mFVVcW(6) 結(jié)果計(jì)算2.2 微量凱氏定氮法微量凱氏定氮法 微量凱氏定氮法的原理與操作方法，與微量凱氏定氮法的原理與操作方法，與常量法基本相同，所不同的是樣品質(zhì)量及試常量法基本相同，所不同的是樣品質(zhì)量及試劑用量較少，且有一套適于微量測(cè)定的定型劑用量較

11、少，且有一套適于微量測(cè)定的定型儀器儀器微量凱氏定氮器。微量凱氏定氮器。100ml凱氏燒瓶。凱氏燒瓶。微量凱氏定氮器。微量凱氏定氮器。 20g/L硼酸溶液。 400g/L氫氧化鈉。 1g/L甲基紅乙醇溶液與1g/L溴甲酚綠乙醇溶液，臨用時(shí)按1：5混合。 0.01000mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 其他試劑同常量法。 ：樣品消化步驟同常量法。將消化完全的消化液冷卻后，完全轉(zhuǎn)入100容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。 蒸餾 按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)裝水至2/3容積處，加指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈，加入數(shù)粒玻璃珠，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水。在加入10ml 40g/L硼酸及2滴混合

12、指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。由進(jìn)樣漏斗進(jìn)入反應(yīng)室，以少量水沖洗進(jìn)樣漏斗，并流入反應(yīng)室。再?gòu)倪M(jìn)樣口加入10ml使呈強(qiáng)堿性，用少量蒸餾 水洗漏斗數(shù)次，蓋塞 ，進(jìn)行水蒸氣 蒸餾。冷凝管下端 預(yù)先插入盛有10mL4%（或2%）蒸餾至吸收液中所加的混合指示劑變?yōu)榫G色開(kāi)始記時(shí)，繼續(xù)蒸餾10min后，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管尖端后停止蒸餾。 滴定 取下接受瓶，以0.01000mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色為終點(diǎn)。(5) 結(jié)果計(jì)算結(jié)果計(jì)算 式中W蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%； V0滴定空白蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL； V1滴定樣品蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL； V2蒸餾時(shí)

13、吸取樣品稀釋液體積，mL； C鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L； 0.014氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol； F蛋白質(zhì)系數(shù)； m樣品質(zhì)量，g。%100100014. 0)(201VmFcVVW（1）所用試劑應(yīng)用配制。（2）消化過(guò)程應(yīng)注意凱氏燒瓶，利用冷凝酸液將附在瓶壁上的炭粒沖下，以促進(jìn)消化完全。（3）若樣品含脂肪或糖較多時(shí)，應(yīng)注意發(fā)生的大量少量辛醇或液體石蠟，或硅消泡劑，防止其溢出瓶外，并注意適當(dāng)控制熱源強(qiáng)度。（4）若樣品消化液不易澄清透明，可將凱氏燒瓶冷卻，加入300g/L23ml后再加熱。2.4 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)（5）若取樣量較大，如干試樣超過(guò)5g，可按每克試樣5ml的比例增加硫酸用量。（6）

14、消化時(shí)間一般約4小時(shí)左右即可，消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起氨的損失。一般消化至透明后，繼續(xù)消化30min即可，但當(dāng)含有特別難以氨化的氮化合物的樣品，如含賴氨酸或組氨酸時(shí)，消化時(shí)間需適當(dāng)延長(zhǎng)，因?yàn)檫@兩種氨基酸中的氮在短時(shí)間內(nèi)不易消化完全，往往導(dǎo)致總氮量偏低。有機(jī)物如分解完全，分解液呈藍(lán)色或淺綠色。但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色。（7）蒸餾過(guò)程應(yīng)注意接頭處無(wú)現(xiàn)象，蒸餾完畢，先將蒸餾出口離開(kāi)液面，繼續(xù)蒸餾1min，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶?jī)?nèi)，再將吸收瓶移開(kāi)，最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸。（8）不應(yīng)超過(guò)40C，否則氨吸收減弱，造成損失，可置于冷水浴中。（9）混合指示劑在堿性溶液中呈，

15、在中性溶液中呈，在酸性溶液中呈。 半微量凱氏定氮半微量凱氏定氮測(cè)定蛋白質(zhì)的其它方法測(cè)定蛋白質(zhì)的其它方法v雙縮脲法雙縮脲法 雙縮脲 蛋白質(zhì)的肽鍵與雙縮脲結(jié)構(gòu)類似，可形成紫紅色絡(luò)合物，比色測(cè)定（560nm）CuSO4NaOH紫紅色絡(luò)合物紫紅色絡(luò)合物v紫外吸收法紫外吸收法 利用氨基酸殘基中某些基團(tuán)的紫外吸收特性 1、A280 芳香環(huán)殘基產(chǎn)生特征吸收， 38mg/ml內(nèi)， A280 正比于蛋白質(zhì)濃度 生化分析，快速v2、A280/A260v 校正核酸的干擾作用校正核酸的干擾作用v3、A215-A225（適用于蛋白質(zhì)稀溶液）（適用于蛋白質(zhì)稀溶液） A215-A225與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，與蛋白質(zhì)濃度呈

16、線性關(guān)系，（20100mg/l）v4、肽鍵紫外吸收法、肽鍵紫外吸收法 A238與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系 （50500mg/l）福林福林-酚法酚法 （1）在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白）在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)質(zhì)銅絡(luò)合物。（銅絡(luò)合物。（雙縮脲反應(yīng)）雙縮脲反應(yīng)） （2）此絡(luò)合物（）此絡(luò)合物（酪氨酸酪氨酸/色氨酸）色氨酸）將試劑磷鉬將試劑磷鉬酸酸磷鎢酸（磷鎢酸（FolIn試劑）還原，混合物深藍(lán)色試劑）還原，混合物深藍(lán)色（磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物），顏色深淺與蛋白質(zhì)（磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物），顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。含量成正比。 A750 靈敏度高（靈敏度高（ 0

17、50mg/l） 干擾較大（酚、檸檬酸）干擾較大（酚、檸檬酸）考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)法v考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合vA620 靈敏度高，干擾小 0100mg/l染料結(jié)合法染料結(jié)合法v蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)氨基黑氨基黑/酸性橙酸性橙12（定量結(jié)合）（定量結(jié)合） 測(cè)定剩余染料量測(cè)定剩余染料量v樣品的溶解性不好時(shí)也可適用樣品的溶解性不好時(shí)也可適用水楊酸比色法水楊酸比色法v消化消化銨鹽銨鹽水楊酸鈉水楊酸鈉/次氯酸鈉（藍(lán)色）次氯酸鈉（藍(lán)色）vA660紅外光譜法紅外光譜法v蛋白質(zhì)在某些紅外波段具有特征吸收蛋白質(zhì)在某些紅外波段具有特征吸收 吸收強(qiáng)度正比于成分濃度v蛋白質(zhì)序列測(cè)定蛋白質(zhì)序列測(cè)定 末

18、端測(cè)定vN-末端末端丹磺?；ǖせ酋；?末端NH2-DNS水解DNS-氨基酸提取分析vC-末端末端羧肽酶法（從羧肽酶法（從C段順序降解氨基段順序降解氨基酸）酸）4 4 氨基酸態(tài)氮的測(cè)定氨基酸態(tài)氮的測(cè)定(1) 甲醛滴定法原理甲醛滴定法原理氨基酸具有酸性氨基酸具有酸性的的-COOH基和堿性的基和堿性的-NH2基。它們相互作基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，-NH2基與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。基與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)滴定這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)滴定-COOH基，并用間接的基，并用間接的方

19、法測(cè)定氨基酸的總量。反應(yīng)式如下：方法測(cè)定氨基酸的總量。反應(yīng)式如下：RCHH3N CCOR CCOHOHNH2+HCHORCCOOHHN CH2+NaOHRCHCOOHNH CH2OH或R CH COOHN(CH2OH)2或RCH COONaNCH2或 R CHNHCOOHCHO4.2 電位滴定法電位滴定法(1)原理原理 根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計(jì)的玻璃電極及甘性，使羧基顯示出酸性，將酸度計(jì)的玻璃電極及甘汞電極同時(shí)插入被測(cè)液中構(gòu)成電池，用氫氧化鈉標(biāo)汞電極同時(shí)插入被測(cè)液中構(gòu)成電池，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，依據(jù)酸度計(jì)指示的準(zhǔn)溶液滴定，依據(jù)酸度計(jì)指示的pH值判斷和控制滴值判斷和控制滴定終點(diǎn)。定終點(diǎn)。(