桿狀病毒表達系統(tǒng) 桿狀病毒滴度測定 全攻略

1、桿狀病毒表達系統(tǒng)桿狀病毒表達系統(tǒng)疫苗實驗體液免疫與細胞免疫的檢測疫苗實驗體液免疫與細胞免疫的檢測&桿桿狀狀病病毒毒表表達達系系統(tǒng)統(tǒng)昆蟲細胞的培養(yǎng)重組pFastBac質粒的構建重組Bacmid的產(chǎn)生與鑒定獲得重組桿狀病毒蛋白表達&病毒擴大OverviewBac-to-Bac Baculovirus Expression System能快速并有能快速并有效的獲得重組桿狀病毒，其重組是基于供體質粒表達盒效的獲得重組桿狀病毒，其重組是基于供體質粒表達盒與桿狀病毒穿梭載體與桿狀病毒穿梭載體Bacmid間發(fā)生位點特異性轉座。間發(fā)生位點特異性轉座。供體質粒供體質粒pFastBacpFastB

2、ac：靶基因位于桿狀病毒特異啟動子下游：靶基因位于桿狀病毒特異啟動子下游DH10BacDH10Bac：桿狀病毒穿梭載體：桿狀病毒穿梭載體Bacmid + Bacmid + 輔助質粒輔助質粒Bac-to-Bac 表達系統(tǒng)的組成和工作原理Bac-to-Bac 表達系統(tǒng)的組成和工作原理Expermiantal outlineInsect Cell Lines：Sf9 or Sf21 cells主要用于轉染，空斑實驗和滴度測定主要用于轉染，空斑實驗和滴度測定High Five cells or Mimic Sf9 cells轉染效率低，主要用于蛋白表達轉染效率低，主要用于蛋白表達 Graces Ins

3、ect Medium with L-glutamine and supplemented with（pH 6.5）：）： 3330 mg/L lactalbumin hydrolysate3330 mg/L yeastolate350 mg/L NaHCO310% heat-inactivated fetal bovine serum昆蟲細胞的培養(yǎng)昆蟲細胞的培養(yǎng)Atmosphere：air, 100% pipetting across the monolayer scraping cell scrapers hitting the flask against the palm of your

4、handTemperature：27.028.0 Subculturing：Preservation：90% serum, 10% DMSO嚴格程序降溫，嚴格程序降溫，-80 過夜后轉移液氮保存。過夜后轉移液氮保存。昆蟲細胞的培養(yǎng)重組pFastBac質粒的構建選擇合適的載體選擇合適的載體 重組Bacmid的產(chǎn)生重組Bacmid的鑒定PCR法法: pUC/M13 Forward and Reverse primer 或者或者pUC/M13 Forward or Reverse primer and a primer that hybridizes within your insertBacmid

5、 DNA 135kb獲得重組桿狀病毒轉染Sf9 cells1. 小提好的小提好的Bacmid DNA，置置4 不超過不超過1周周2. 轉染試劑：轉染試劑：Cellfectin Reagent3. 轉染后細胞的形態(tài)變化轉染后細胞的形態(tài)變化細胞細胞變大變大增殖明顯變慢增殖明顯變慢或不增殖或不增殖裂解裂解脫落脫落融合融合(VSV/G)或或4. 收毒，短期內收毒，短期內4 避光保存，長期保存分裝后置避光保存，長期保存分裝后置-80 病毒擴增&蛋白表達 擴增病毒：接毒量為擴增病毒：接毒量為 0.050.1 MOI一般情況下，一般情況下，P1代毒滴度大概為代毒滴度大概為1106 1107 PFU/

6、ml， P2 代毒滴度代毒滴度11071108 PFU/ml比如：比如：P1代毒滴度為代毒滴度為5106 PFU/ml，T75細胞瓶的細胞量細胞瓶的細胞量 2107cells，那么，那么蛋白表達：接毒量為蛋白表達：接毒量為 15 MOI桿狀病毒滴度測定兩種病毒滴度測定方法的比較：兩種病毒滴度測定方法的比較：空斑實驗法測定滴度依賴于病毒在感染細胞中的復制以及感染空斑實驗法測定滴度依賴于病毒在感染細胞中的復制以及感染周邊細胞形成局灶型病變；而免疫染色法只需要病毒感染靶細周邊細胞形成局灶型病變；而免疫染色法只需要病毒感染靶細胞并表達病毒所編碼的蛋白。因此，免疫染色法胞并表達病毒所編碼的蛋白。因此，免

7、疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）測定病毒滴度需要的時間比空斑法測定病毒滴度需要的時間比空斑法（PFU/ml）更短。更短。BacPAK Rapid Titer Kit 本測定方法，以針對桿狀病毒囊膜蛋白本測定方法，以針對桿狀病毒囊膜蛋白gp64的的單克隆抗體標記被病毒感染的細胞，然后以單克隆抗體標記被病毒感染的細胞，然后以HRP-標標記的二抗與感染細胞進行染色。通過底物顯色，在記的二抗與感染細胞進行染色。通過底物顯色，在光學顯微鏡下計數(shù)感染斑點的數(shù)量，經(jīng)過稀釋倍數(shù)光學顯微鏡下計數(shù)感染斑點的數(shù)量，經(jīng)過稀釋倍數(shù)的換算，即可得出病毒的滴度（的換算，即可得

8、出病毒的滴度（IFU/ml）。）。注意事項：注意事項： 細胞鋪板細胞鋪板5 106 cells/well，細胞計數(shù)要準，臺盼藍染，細胞計數(shù)要準，臺盼藍染 色，保證細胞活力色，保證細胞活力 95%。2. 病毒稀釋要準，不同濃度之間換槍頭，是確保不同稀釋病毒稀釋要準，不同濃度之間換槍頭，是確保不同稀釋 度孔斑點成度孔斑點成10倍關系的關鍵。倍關系的關鍵。3. 整個過程中，輕輕洗板，避免細胞脫落過多。整個過程中，輕輕洗板，避免細胞脫落過多。4. 實驗完畢實驗完畢3 h后數(shù)斑，效果更佳。后數(shù)斑，效果更佳。5. 結果判定：結果判定：疫疫苗苗免免疫疫動動物物后后免免疫疫效效力力評評價價體液免疫檢測ELIS

9、A抗體中和抗體細胞免疫檢測細胞因子mRNA水平檢測qPCR細胞因子蛋白質水平檢測ELISA淋巴增殖實驗MTT法ELISA抗體 制備良好的抗原包被制備良好的抗原包被ELISA板板純化的蛋白或病毒純化的蛋白或病毒3. 設置空白孔（不加血清），統(tǒng)計結果時，所有實驗組的設置空白孔（不加血清），統(tǒng)計結果時，所有實驗組的 OD值先減掉背景值，再計算比值和滴度。值先減掉背景值，再計算比值和滴度。（1）蛋白質與酶標板的結合主要是靠疏水作用的物理吸附，而包被液）蛋白質與酶標板的結合主要是靠疏水作用的物理吸附，而包被液的的PH大于蛋白的大于蛋白的PI，有利于蛋白質疏水鍵的適當暴露。，有利于蛋白質疏水鍵的適當暴露。

10、（2）酶標板聚苯乙烯表面暴露的主要是）酶標板聚苯乙烯表面暴露的主要是CH鍵，包被液鍵，包被液PH大于蛋白大于蛋白PI，使蛋白質帶上負電荷，有利于蛋白質與酶標板的牢固結合，提，使蛋白質帶上負電荷，有利于蛋白質與酶標板的牢固結合，提高包被效率。高包被效率。每次包被板子條件一致，每次包被板子條件一致， 4 16-18h。2. 血清樣品不溶血，防止干擾結果。血清樣品不溶血，防止干擾結果。方陣滴度確定最佳抗原包被濃度。方陣滴度確定最佳抗原包被濃度。微量中和實驗技術中和抗體中和實驗原理分 類固定病毒固定病毒稀釋血清法稀釋血清法固定血清固定血清稀釋病毒法（用的很少）稀釋病毒法（用的很少）用 途疾病診斷疾病診

11、斷病毒分離株的鑒定病毒分離株的鑒定不同病毒株的抗原關系研究不同病毒株的抗原關系研究疫苗免疫原性的評疫苗免疫原性的評免疫血清的質量評價免疫血清的質量評價測定實驗動物血清中是否存在抗體測定實驗動物血清中是否存在抗體材 料 病毒病毒（1）凍存的病毒不能重復使用）凍存的病毒不能重復使用（2）進行中和實驗前，需先進行病毒滴定（）進行中和實驗前，需先進行病毒滴定（TCID50）的滴定）的滴定進行病毒定量進行病毒定量2. 血清樣品血清樣品（1）血清樣品分裝凍存于）血清樣品分裝凍存于-20 ，一般不要反復凍融，一般不要反復凍融3次以上。次以上。（2）血清樣品不溶血，不長期凍存，以減少對細胞的毒性。）血清樣品不

12、溶血，不長期凍存，以減少對細胞的毒性。（3）需要有陽性和陰性對照血清，實驗前需）需要有陽性和陰性對照血清，實驗前需56滅活滅活30分鐘分鐘。3. 細胞和細胞培養(yǎng)試劑細胞和細胞培養(yǎng)試劑（1）對數(shù)生長期細胞）對數(shù)生長期細胞（2）DMEM/血清血清/胰酶胰酶/抗生素抗生素固定病毒固定病毒稀釋血清法稀釋血清法 將不同稀釋度的血清與固定量的病將不同稀釋度的血清與固定量的?。?00TCID50、EID50或LD50）混合，適當?shù)臈l件下感作一定時間以后，混合，適當?shù)臈l件下感作一定時間以后，再將血清再將血清-病毒混合物接種于敏感細胞、雞胚或實驗動物，病毒混合物接種于敏感細胞、雞胚或實驗動物，測定被檢血清阻止組

13、織培養(yǎng)細胞、雞胚或實驗動物發(fā)生測定被檢血清阻止組織培養(yǎng)細胞、雞胚或實驗動物發(fā)生病毒感染的能力及其效價。以能保護病毒感染的能力及其效價。以能保護50%組織培養(yǎng)細胞、組織培養(yǎng)細胞、雞胚或實驗動物不發(fā)生病變、感染或死亡的血清最高稀雞胚或實驗動物不發(fā)生病變、感染或死亡的血清最高稀釋倍數(shù)，作為該血清的釋倍數(shù)，作為該血清的50%中和效價中和效價(PD50)。將將9696孔細胞培養(yǎng)板放入孔細胞培養(yǎng)板放入37 5% CO37 5% CO2 2培養(yǎng)箱中作用培養(yǎng)箱中作用45 min60 min45 min60 min。感作完成后每孔加入感作完成后每孔加入100 100 l l細胞懸液，繼續(xù)置細胞懸液，繼續(xù)置37

14、37 5% CO5% CO2 2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察并記錄結果，一般要培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察并記錄結果，一般要觀察觀察4-54-5天。天。 結果計算，按結果計算，按Reed-MuenchReed-Muench兩氏法或兩氏法或KarberKarber法進行。法進行。距離比例距離比例=(高于高于50%的保護率的保護率-50% )/(高于高于50%的保護率的保護率-低于低于50%的保護率的保護率) =(66.7-50)/(66.7-16.7) =0.33 PD50=-1.299PD50=-1.299的反對數(shù)的反對數(shù)=0.05=1/20=0.05=1/20即即1:201:20稀釋的待檢血清可保護稀釋的待

15、檢血清可保護50%50%的組織培養(yǎng)細胞不出現(xiàn)的組織培養(yǎng)細胞不出現(xiàn)CPECPE中和效價中和效價(PD50)的計算：的計算：lgPD50=高于高于50%保護率的血清稀釋度的對數(shù)保護率的血清稀釋度的對數(shù) +距離比例距離比例稀釋度對數(shù)的差稀釋度對數(shù)的差 =-1.2+0.33(-0.3) =-1.299固定血清固定血清稀釋病毒法稀釋病毒法 在固定量的血清中，加入等量不同稀釋度的病毒，用對在固定量的血清中，加入等量不同稀釋度的病毒，用對照非免疫血清（對照組）和待檢血清同時進行測定，計算每照非免疫血清（對照組）和待檢血清同時進行測定，計算每一組的一組的TCID50、EID50或或LD50，然后計算中和指數(shù)。

16、，然后計算中和指數(shù)。注意事項：注意事項： 待檢血清需待檢血清需56滅活滅活30分鐘。分鐘。 需重復測定抗體時，血清應分裝后凍存，以免反復凍融。需重復測定抗體時，血清應分裝后凍存，以免反復凍融。 細胞應處于對數(shù)生長期，嚴禁細胞過度生長或老化，細細胞應處于對數(shù)生長期，嚴禁細胞過度生長或老化，細胞胞 活力活力 95%。 4. 牛血清有中和病毒感染力的作用，實驗過程中切勿將細牛血清有中和病毒感染力的作用，實驗過程中切勿將細胞胞 培養(yǎng)液與病毒稀釋液混淆使用。培養(yǎng)液與病毒稀釋液混淆使用。 5. 病毒與抗血清混合，常規(guī)采用病毒與抗血清混合，常規(guī)采用37作用作用1小時。但針對小時。但針對不不 同耐熱性的病毒，

17、孵育溫度和時間應有所增減。同耐熱性的病毒，孵育溫度和時間應有所增減。 6. 每份血清做每份血清做3個生物學重復。個生物學重復。細胞免疫的檢測首先要完成淋巴的分離和體外刺激包括脾淋巴細胞/外周血單核細胞的分離 脾細胞的分離： 2.將脾臟轉入勻漿器中，加少量將脾臟轉入勻漿器中，加少量不完全不完全1640，輕輕研磨。，輕輕研磨。1.處死的小鼠經(jīng)消毒后，放置于泡沫板處死的小鼠經(jīng)消毒后，放置于泡沫板右側臥右側臥固定，剪開左固定，剪開左側背腹交界處皮膚，分三套鑷子側背腹交界處皮膚，分三套鑷子/ /剪刀無菌取脾臟剪刀無菌取脾臟3.靜置，吸上清液入靜置，吸上清液入15 ml離心管中，離心管中，1000rpm1

18、0 min。4.棄上清，加入棄上清，加入5 ml的的8.3g/l NH4Cl，靜止，靜止5 min (去除紅細去除紅細胞胞)，1000 rpm 10 min。5.棄上清，用不完全棄上清，用不完全RPMI-1640洗滌，洗滌，1000 rpm 10 min。6. 細胞計數(shù)，細胞計數(shù)，臺盼藍染色臺盼藍染色，要求細胞活性應在，要求細胞活性應在95%以上。以上。7.調整濃度為調整濃度為4106 cells/ml。外周血單核細胞的分離 ： 細胞因子的定量PCR檢測： （1）于）于24孔板中加入適量的相關刺激原（孔板中加入適量的相關刺激原（based on in vitro dose-response s

19、tudies），然后將濃度為），然后將濃度為4106 cells/ml的細的細胞懸液加至各孔內，每孔胞懸液加至各孔內，每孔1 ml。（2）置）置37 ，5 % CO2溫箱中培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)20 h，提取細胞總，提取細胞總RNA并并測定測定 RNA濃度和純度。濃度和純度。（3）?。┤?.5 g RNA進行逆轉錄（進行逆轉錄（TOYOBO反轉錄試劑）。反轉錄試劑）。（4）定量）定量PCR：Primer-Forward（IFN-/IL-4/-actin）1 l（10 M）Primer-Reverse（IFN-/IL-4/-actin）1 l（10 M）2SYBR Green Real-time PCR Master M