細胞培養(yǎng)工藝介紹

1、提綱提綱l為什么要培養(yǎng)細胞為什么要培養(yǎng)細胞l培養(yǎng)什么樣的細胞培養(yǎng)什么樣的細胞l如何培養(yǎng)細胞及培養(yǎng)過程的如何培養(yǎng)細胞及培養(yǎng)過程的注意事項注意事項為什么要培養(yǎng)細胞為什么要培養(yǎng)細胞生命科學的基本研究方法生命科學的基本研究方法l科學研究需要科學研究需要細胞是生物體的最小單位細胞是生物體的最小單位l工業(yè)生產的需要工業(yè)生產的需要細胞培養(yǎng)可以獲得我們需細胞培養(yǎng)可以獲得我們需要的藥物、原料等要的藥物、原料等單克隆抗體單克隆抗體 l市場快速增長市場快速增長l08年銷售達年銷售達167億美元億美元l已有近已有近20個產品個產品l超過超過150個在臨床試驗階段個在臨床試驗階段l主要是主要是CHO表達的，超過表達的，

2、超過50現狀現狀l高需求量：數千公斤高需求量：數千公斤l國外水平：國外水平：1-10g/Ll國內水平：國內水平：1g/L培養(yǎng)何種細胞培養(yǎng)何種細胞l表達我們目的蛋白的細胞表達我們目的蛋白的細胞處理過處理過CHO細胞細胞基本概念基本概念lDNA染色體染色體遺傳物質遺傳物質l基因基因DNA片斷片斷l(xiāng)轉錄：轉錄：DNARNAl翻譯：翻譯：RNA蛋白質蛋白質構建表達特定產物的細胞株構建表達特定產物的細胞株l將特定產物的基因引入細胞中將特定產物的基因引入細胞中l(wèi)長期穩(wěn)定表達長期穩(wěn)定表達l挑選克隆挑選克隆CHO陽性克隆陽性克隆將外源基因到入細胞內將外源基因到入細胞內l可選的細胞可選的細胞l構建的表達載體構建

3、的表達載體l轉染的方法轉染的方法l克隆的挑選克隆的挑選l表達產物的檢測表達產物的檢測常用的表達細胞常用的表達細胞lCHOlNSOlSP2/0lHybridoma常用的表達體系常用的表達體系lGS表達系統lDHFR表達系統表達載體的作用表達載體的作用讓細胞產生抗性讓細胞產生抗性同時表達目的蛋白同時表達目的蛋白谷氨酰胺合成酶基因表達載體（谷氨酰胺合成酶基因表達載體（GS）l谷氨酰胺是細胞生命必需物質谷氨酰胺是細胞生命必需物質l部分細胞不能合成谷氨酰胺，或合成不部分細胞不能合成谷氨酰胺，或合成不足足l載體中含有谷氨酰胺合成酶的基因載體中含有谷氨酰胺合成酶的基因l在不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基中，只有整合在不

4、含谷氨酰胺的培養(yǎng)基中，只有整合了谷氨酰胺合成酶基因的細胞存活了谷氨酰胺合成酶基因的細胞存活l加入篩選劑加入篩選劑MSX，增加其表達量，增加其表達量二氫葉酸還原酶表達系統（二氫葉酸還原酶表達系統（DHFR）lDHFR是合成是合成dATP和和dGTP的關鍵酶的關鍵酶 l常用常用DHFR-的的CHO細胞不能合成四氫葉酸細胞不能合成四氫葉酸 l含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和嘌呤的培養(yǎng)基含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和嘌呤的培養(yǎng)基l在氨甲酰喋呤（在氨甲酰喋呤（methotrexate,MTX）存在下，）存在下，增加外源基因的拷貝數，提高蛋白的表達水平，增加外源基因的拷貝數，提高蛋白的表達水平，使外源基因高效表達使外源

5、基因高效表達 轉染方法轉染方法l脂質體：融合細胞膜脂質體：融合細胞膜l磷酸鈣：形成沉淀，細胞內吞磷酸鈣：形成沉淀，細胞內吞l電穿孔：膜上打孔，自由出入電穿孔：膜上打孔，自由出入為什么要挑選克隆為什么要挑選克隆l穩(wěn)定的種子穩(wěn)定的種子l高效的種子高效的種子l經過驗證的種子經過驗證的種子克隆就是從一個細胞增克隆就是從一個細胞增殖形成的細胞群殖形成的細胞群細胞篩選方法獲得單克隆細胞篩選方法獲得單克隆l貼壁培養(yǎng)的克隆形成貼壁培養(yǎng)的克隆形成克隆環(huán)克隆環(huán)ClonePix FLCell Xpressl有限稀釋法單克隆形成有限稀釋法單克隆形成l流式細胞術篩選細胞流式細胞術篩選細胞Re-clonesubclone

6、檢測手段檢測手段ldot-blotlELISAlSDS-PAGElWesternlFlow Cytometry Analysisdot-blotl上清l酶連抗體（1步或2步）l顯色劑酶聯免疫吸附試驗（ELISA）l夾心法夾心法l包被抗體包被抗體l加上清加上清l酶聯抗體酶聯抗體l顯色顯色l讀數讀數SDS-PAGEl分子量與泳動距離分子量與泳動距離lSDS帶電，與蛋白結合帶電，與蛋白結合l染色：溴酚藍、銀染等染色：溴酚藍、銀染等l定性及定量檢測定性及定量檢測Westernl基于電泳基于電泳l轉膜轉膜l抗體及酶（同抗體及酶（同ELISA）l染色或發(fā)光染色或發(fā)光Flow Cytometry Analy

7、sisl抗體與細胞結合抗體與細胞結合l熒光物質連接抗體熒光物質連接抗體l激光誘發(fā)熒光激光誘發(fā)熒光l可檢測上清或細胞可檢測上清或細胞高表達克隆的確定高表達克隆的確定l構建表達載體構建表達載體l轉染細胞轉染細胞l單克隆單克隆l上述篩選上述篩選l重復克隆及篩選重復克隆及篩選l保留保留35個克隆個克隆如何培養(yǎng)細胞如何培養(yǎng)細胞無血清、懸浮培養(yǎng)無血清、懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)細胞的方法培養(yǎng)細胞的方法l含血清培養(yǎng)含血清培養(yǎng)l無血清培養(yǎng)無血清培養(yǎng)價格便宜價格便宜品質穩(wěn)定品質穩(wěn)定生物污染少生物污染少減輕下游純化負擔減輕下游純化負擔貼壁變懸浮貼壁變懸浮貼壁貼壁 懸浮懸浮平面平面 立體立體血清替代血清替代l氨基酸氨基酸l維生素

8、維生素l生長因子生長因子l微量元素微量元素l脂類成分脂類成分無血清培養(yǎng)基的分類無血清培養(yǎng)基的分類l無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基l無蛋白培養(yǎng)基無蛋白培養(yǎng)基l化學成分限定型培養(yǎng)基化學成分限定型培養(yǎng)基l無血清、無蛋白、化學成分限定型培養(yǎng)基無血清、無蛋白、化學成分限定型培養(yǎng)基無動物源性成分無動物源性成分優(yōu)化培養(yǎng)優(yōu)化培養(yǎng)如何優(yōu)化？l細胞株的選擇細胞株的選擇l培養(yǎng)條件優(yōu)化培養(yǎng)條件優(yōu)化l工藝調整工藝調整為什么要優(yōu)化？為什么要優(yōu)化？細胞株的選擇細胞株的選擇細胞株的選擇細胞株的選擇培養(yǎng)條件優(yōu)化培養(yǎng)條件優(yōu)化l主要是培養(yǎng)基的優(yōu)化主要是培養(yǎng)基的優(yōu)化l培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的成分l培養(yǎng)基的使用方法培養(yǎng)基的使用方法優(yōu)化考察指標優(yōu)

9、化考察指標生長狀態(tài)生長狀態(tài)優(yōu)化考察指標優(yōu)化考察指標生長曲線 表達水平優(yōu)化效果優(yōu)化效果工藝控制工藝控制l細胞狀態(tài)的觀察細胞狀態(tài)的觀察l工藝參數的設定工藝參數的設定l液體補充的控制液體補充的控制發(fā)酵模式發(fā)酵模式l批次培養(yǎng)批次培養(yǎng)l補料批次培養(yǎng)補料批次培養(yǎng)l連續(xù)灌注培養(yǎng)連續(xù)灌注培養(yǎng)培養(yǎng)放大培養(yǎng)放大l方瓶l搖瓶l小罐l大罐l優(yōu)化空間優(yōu)化空間培養(yǎng)控制培養(yǎng)控制l攪拌l通氣l營養(yǎng)補充培養(yǎng)監(jiān)控培養(yǎng)監(jiān)控lpO2l溫度溫度l生化參數生化參數l營養(yǎng)消耗營養(yǎng)消耗l表達監(jiān)控表達監(jiān)控AU% Composition-0.0100.0000.0100.0200.0300.0400.0500.0600.0700.0800.0900.1000.1100.1200.1300.1400.1500.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.0080.0090.00100.00Minutes21.0022.0023.0024.0025.0026.0027.0028.0029.0030.0031.0032.0033.0034.0035.0036.0037