親和色譜應(yīng)用于天然活性成分篩選的研究進(jìn)展

1、親和色譜應(yīng)用于天然活性成分篩選的研究進(jìn)展摘要親和色譜法(affiNtychromatography)是一種利用固定相的結(jié)合特性來(lái)分離分子的色譜方法。利用化合物和固定相表面之間的莫種特異性親和力，將目標(biāo)化合物從大量無(wú)親和活性的化合物中分離由來(lái)。該方法可同時(shí)進(jìn)行色譜分離和活性篩選，作為一種高通量篩選方法廣泛應(yīng)用于各種活性藥物的篩選。該文主要針對(duì)親和色譜的發(fā)展歷史、篩選技術(shù)類型及其在天然活性成分篩選中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。并就其應(yīng)用前景進(jìn)行討論，以期更好地發(fā)揮親和色譜在藥物篩選中的應(yīng)用。關(guān)鍵詞親和色譜；篩選;天然藥物；細(xì)胞膜色譜；脂筏色譜Progressesinscreeningactivecompou

2、ndsfromherbalmedicinebyaffinitychromatographyFENGYing-shu<sup>/1</sup>,TONGShan-shan<sup>/1</sup>,XUXi-ming<sup>/1</sup>,YUJiang-nan1,2*(1.DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing21000

3、9,China;2. CollegeofPharmacy,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China)AbstractAffinitychromatographyisachromatographicmethodforseparatingmoleculesusingthebindingcharacteristicsofthestationaryphasewithpotentialdrugmolecules.Thismethodcanbeperformedasahighthroughputscreeningmethodandachromatographicsep

4、arationmethodtoscreenavarietyofactivedrugs.Thispapersummarizesthehistoryofaffinitychromatography,screeningtechnologyofaffinitychromatography,andapplicationofaffinitychromatographyinscreeningbio-activecompoundsinherbalmedicines，andthendiscussesitsapplicationprospectsinordertobroadenapplicationsofthea

5、ffinitychromatographyindrugscreening.Keywordsaffinitychromatography;screening;herbalmedicines;cellmembranechromatography;lipidraftstationaryphasechromatographydoi:10.4268/cjcmm20150609中藥種類眾多，配伍復(fù)雜，而有效成分是其發(fā)揮治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，從天然藥物中尋找活性成分一直是中藥研究的重要方向之一。然而，應(yīng)用傳統(tǒng)的天然藥物分離提取方法，即先對(duì)其成分進(jìn)行分離，再結(jié)合藥理藥效試驗(yàn)篩選其中特定的有效成分的方法篩選中藥活

6、性成分，周期長(zhǎng)，且命中率相對(duì)較低。將化合物分離鑒定手段與高通量藥物篩選技術(shù)相結(jié)合，可以直接對(duì)天然藥物的提取組分進(jìn)行分離并在線活性檢測(cè)，不僅可以節(jié)約成本，提高天然藥物活性篩選速度，同時(shí)也在一定程度上闡述作用機(jī)制，以保證研究目標(biāo)的準(zhǔn)確性。親和色譜法（affinitychromatography）是一種利用固定相的結(jié)合特性來(lái)分離分子的色譜方法<sup>1</sup>。在親和色譜中，將能與潛在藥物（配體）特異結(jié)合的物質(zhì)（配基）固定于色譜填料上，制備色譜柱，混合物經(jīng)過(guò)色譜柱時(shí)，能與固定相產(chǎn)生特異結(jié)合的物質(zhì)將在色譜柱上發(fā)生保留行為，從而實(shí)現(xiàn)混合物間以

7、親和性為基礎(chǔ)的分離。中藥提取物可不經(jīng)過(guò)分離步驟，直接在相應(yīng)的親和色譜上完成篩選工作。并且藥物在親和色譜模型上的的保留特性（保留時(shí)間或容量因子）與藥物的活性顯著相關(guān)。本文主要針對(duì)親和色譜的發(fā)展歷史、篩選技術(shù)類型及其在天然活性成分篩選中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。1親和色譜的發(fā)展歷史親和色譜的發(fā)展經(jīng)歷了上百年的歷史<sup>2</sup>,現(xiàn)已成為一個(gè)較為成熟的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于天然生物活性物質(zhì)的分離和純化，以及篩選和鑒定。早在1910年，德國(guó)藥理學(xué)家Starkenstein將蔗糖酶抗體吸附在高嶺土上，研究了抗體和抗原的相互作用，為親和色譜的萌芽。192

8、4年，俄羅斯學(xué)者Engelhar出提由了“固定化配體原理”，作為分離生物活性物質(zhì)的方法，為親和色譜分離方法的根本。隨后的60年間，人們相繼使用親和色譜技術(shù)，分離純化淀粉酶、抗體等，在此期間，纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖、苯乙烯樹(shù)脂等基體材料以及各種配基的固定化方法的由現(xiàn)，親和色譜技術(shù)飛速發(fā)展。1968年，美國(guó)藥理學(xué)家Cuatrecases和Wilchek擴(kuò)展了親和配位體的范圍，包括酶、抗原、抗體、激素、維生素、外源凝集素、糖蛋白、膜蛋白、病毒、細(xì)胞等，確立生物特效親和色譜方法。1970年,Cuatrecases提由了“空間間隔臂”概念和方法，成功解決了配位體的立體可接受性問(wèn)題。1972年，德國(guó)學(xué)

9、者Wulff提由分子印跡色譜方法，進(jìn)一步擴(kuò)展了親和色譜的應(yīng)用，使得親和色譜開(kāi)始用于藥物篩選研究。隨后的30年間，共價(jià)色譜方法，染料配位色譜方法，電荷轉(zhuǎn)移色譜方法，定位金屬例子親和色譜方法、包合配合物色譜方法相繼提由。1978年瑞典學(xué)者Ohlson提由以大孔微粒硅膠作為載體的高效液相親和色譜方法，使得親和色譜的發(fā)展跨入了一個(gè)新的時(shí)代。上述關(guān)于親和色譜技術(shù)的發(fā)展雖然并非直接用于天然藥物的篩選，但是其對(duì)現(xiàn)代藥物篩選技術(shù)的建立、發(fā)展和應(yīng)用奠定了十分重要的理論基礎(chǔ)與技術(shù)支撐。經(jīng)過(guò)幾十年親和色譜相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，隨著HPLC色譜柱制備技術(shù)以及各種在線聯(lián)用技術(shù)的廣泛應(yīng)用，以及更多親和配基的基礎(chǔ)研究的深入，近十

10、多年來(lái)逐步衍生由了眾多基于不同配基的親和色譜技術(shù)，并在天然藥物的篩選領(lǐng)域發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用。根據(jù)配基的種類和篩選模型的不同，常用的親和色譜篩選技術(shù)包括：以受體、酶、蛋白或DNA為配基的親和色譜篩選技術(shù)、細(xì)胞膜色譜篩選技術(shù)、脂筏色譜篩選技術(shù)、分子印跡技術(shù)等。各種親和色譜技術(shù)在藥物篩選、模式建立、分離機(jī)制等方面的特色不盡相同，其在天然藥物發(fā)現(xiàn)和鑒定等領(lǐng)域的應(yīng)用不斷拓展，為天然活性成分的發(fā)現(xiàn)與臨床藥物開(kāi)發(fā)提供了極具優(yōu)勢(shì)的篩選技術(shù)平臺(tái)。2親和色譜法篩選技術(shù)親和色譜法將能與潛在藥物（配體）特異結(jié)合的物質(zhì)（配基）固定于色譜填料上制備色譜柱，混合物根據(jù)色譜保留行為的不同而實(shí)現(xiàn)分離。同時(shí)，親和色譜與紫外，

11、MS,NMR等多種檢測(cè)器聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)在線篩選并鑒定中藥活性成分。隨著人們對(duì)親和色譜認(rèn)識(shí)的加深以及應(yīng)用的推廣，多種配基的親和色譜以及不同類型的親和色譜模型陸續(xù)被人們應(yīng)用于中藥活性成分的篩選。2.1 受體為親和配基的色譜篩選近年來(lái)，隨著藥物作用靶點(diǎn)的逐步揭示，以受體為目標(biāo)篩選中藥中的活性成分為中藥篩選的基本思路。王序等<sup>3</sup>在20世紀(jì)80年代，以11個(gè)受體為指標(biāo)，篩選了150種常用中藥的400余種提取物，得到了5000余種生物活性測(cè)定結(jié)果。為了解中醫(yī)用藥的機(jī)制提供了一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，傳統(tǒng)篩選方法僅根據(jù)混合物判斷作用結(jié)果，無(wú)法

12、確定具體作用物質(zhì)，且工作量巨大，耗費(fèi)人力物力可觀。將受體作為親和色譜的固定相，建立親和色譜篩選模型，天然藥物提取物中能與受體發(fā)生特異結(jié)合的成分在色譜柱中發(fā)生保留，與無(wú)色譜保留行為的物質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)活性篩選和色譜分離同時(shí)進(jìn)行，快速、有效的發(fā)現(xiàn)天然藥物中的活性物質(zhì)。目前用于天然藥物篩選的受體為配基的親和色譜模型有腎上腺素受體親和色譜模型，煙堿受體親和色譜模型等。由于受體對(duì)配體選擇性識(shí)別作用較強(qiáng)，以受體為配基的親和色譜在天然藥物活性成分篩選中具有較強(qiáng)的選擇性且作用機(jī)制明確。Wang等<sup>4</sup>將豬重組B2-腎上腺素受體(B2

13、-AR)通過(guò)共價(jià)鍵固定在大孔硅膠表面，制成02-AR親和色譜柱，使用親和色譜方法與四極飛行時(shí)間質(zhì)譜(Q-TOF-MS)聯(lián)用，從中藥制劑活血膠囊提取物中篩選由有效成分阿魏酸，羥基紅花黃色素A(HSYA)和柚皮昔。提取物中具有舒血管作用的B2-AR拮抗劑能與固定相中上的B2-AR發(fā)生特異性結(jié)合而產(chǎn)生色譜保留，與Q-TOF-MS聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)活性化合物的在線分離和鑒定。然而，受體的制備及固定化工藝較為復(fù)雜，受體的蛋白質(zhì)特性導(dǎo)致了親和色譜使用壽命較短。在受體固定化過(guò)程中，受體蛋白覆蓋不完全會(huì)導(dǎo)致配體與固定相上殘留基團(tuán)發(fā)生非特異性結(jié)合而導(dǎo)致其保留特性發(fā)生變化。鄭曉暉等<sup>5

14、</sup>用甘氨酸乙酯對(duì)硅膠表面殘留的未反應(yīng)的咪嚏基進(jìn)行封尾而消除非特異性吸附，并在流動(dòng)相中加入Tris,EDTA和NaCl等試劑，用于消除配體與固定相上殘留氨基和硅羥基之間的靜電作用。這樣不僅能最大程度地保持受體的活性和選擇性，又減小了固定相表面非特異性功能團(tuán)的影響。所制備的色譜柱可使用1周的時(shí)間。合適的固定化受體的發(fā)現(xiàn)決定著親和色譜藥物篩選模型的應(yīng)用。ECalleri等<sup>6</sup>研究了固定化丫型過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR丫）的色譜特性。實(shí)驗(yàn)將PPARy以共價(jià)鍵固定在氨丙基二氧化硅粒

15、子表面，作為色譜固定相，同時(shí)，將PPAR丫結(jié)合在毛細(xì)管柱表面建立PPAR丫毛細(xì)管親和色譜以研究不同固定化條件下的親和色譜特性，以已知配體驗(yàn)證固定化后的PPARy親和色譜的結(jié)合特性。結(jié)果表明，建立的2種親和色譜模型均具有良好的配體保留活性。PPARy在脂肪細(xì)胞，肌肉，和巨噬細(xì)胞上起著重要的生物學(xué)作用，與2型糖尿病，血脂異常，動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病有直接的關(guān)系，研究其固定化后的色譜保留特性，為其用于天然藥物篩選奠定基礎(chǔ)。止匕外，親和色譜也可用于親和配基的尋找。人參皂昔Rg1是傳統(tǒng)中藥人參的主要有效成分之一，藥理活性廣泛，具有廣泛的益智、抗衰老、增強(qiáng)免疫、神經(jīng)保護(hù)等藥理活性，但作用機(jī)制尚未有效闡明

16、。劉倩等<sup>7</sup>通過(guò)將參皂昔Rg1與環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠6B(epoxyactivatedSe-pharoseTM6B,EAS6B)偶聯(lián)，制備以人參皂昔Rg1為配基的親和介質(zhì)，篩選得到1個(gè)Rg1的結(jié)合蛋白，為制備類似結(jié)構(gòu)的天然化合物的親和色譜介質(zhì)提供參考依據(jù)。也為其他各種類中藥的篩選提供思路。2.2 酶為親和配基的色譜篩選酶(enzyme)是生物體新陳代謝過(guò)程的催化劑，參與各項(xiàng)體內(nèi)反應(yīng)的發(fā)生。酶的催化效率極高，并具有高度的專一性。尋找靶向酶的抑制劑或激動(dòng)劑成為藥物篩選的一個(gè)新的方向。固定化酶技術(shù)的由現(xiàn)與發(fā)展解決了酶對(duì)環(huán)境敏感

17、，無(wú)法重復(fù)利用等問(wèn)題，使酶用于篩選中藥活性成分成為可能。固定化酶技術(shù)使酶通過(guò)吸附、共價(jià)鍵結(jié)合、交聯(lián)、包埋等方法定位于載體的一定空間，既保持酶固有的催化活性，又可連續(xù)地重復(fù)使用。以固定化酶為技術(shù)基礎(chǔ)的親和色譜被廣泛用于各種酶抑制劑的篩選，如：。-糖昔酶<sup>8-9</sup>、酪氨酸酶<sup>10</sup><sup>11</sup><sup>12</sup>&

18、lt;sup>13</sup>、胰蛋白酶、膽堿酯酶、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶等，為各種病理模型如糖尿病、黑斑病、腫瘤、高血壓以及神經(jīng)退行性疾病等提供治療依據(jù)。隨著酶與疾病關(guān)系的深入研究，以酶為配基的親和色譜將在藥物發(fā)現(xiàn)中起到更大的作用。將固定化酶技術(shù)與色譜技術(shù)以及MS聯(lián)用，在篩選天然藥物活性成分方面有著廣泛的應(yīng)用。黃燕等&比sup>13&比/sup>將ACE固定在殼聚糖微球載體上，制備ACE親和色譜柱。結(jié)合高效液相快速篩選復(fù)雜體系中的ACE抑制劑。應(yīng)用賴諾普利等5種已上市的ACEI對(duì)篩選模型進(jìn)行驗(yàn)證，反映方法具有高度

19、選擇性。將此模型應(yīng)用于中藥地龍及山楂篩選，得到5個(gè)具有抑制ACE酶活性的有效成分，且具有重現(xiàn)性。YunfangLi<sup>8</sup>等將a-淀粉酶包覆在磁性納米粒子表面，作為色譜柱固定相，建立親和色譜系統(tǒng)，與MS聯(lián)用，從天然藥物大葉藤黃中篩選a-淀粉酶抑制劑。篩選由的3種雙黃酮類化合物，進(jìn)一步結(jié)合UV,MS和NMR譜而確定了結(jié)構(gòu)。將酶作為固定相，與色譜技術(shù)聯(lián)用，在天然藥物活性成分篩選方面具有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)。游離酶經(jīng)固定化后保存時(shí)間大大增加，對(duì)酸、堿、熱以及有機(jī)溶劑的耐受增加，為不同溶解性質(zhì)以及提取方式的天然藥物的篩選提供了可能，擴(kuò)大了

20、篩選范圍。以酶為配基的親和色譜篩選系統(tǒng)具有靈敏，高效，特異性強(qiáng)，可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為天然藥物高通量篩選不可或缺的重要工具。然而，以酶為親和配基的色譜篩選系統(tǒng)存在一定的問(wèn)題，酶的固定化過(guò)程不改變酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)，卻可能改變酶的空間結(jié)構(gòu)，而導(dǎo)致酶活性的部分喪失或改變，故篩選機(jī)理還有待深入研究。2.3 血漿蛋白為親和配基的色譜篩選藥物進(jìn)入體內(nèi)后,與血漿蛋白的結(jié)合是一個(gè)重要的過(guò)程，決定著藥物在體內(nèi)的活性和命運(yùn)。血漿蛋白結(jié)合率(plasmaproteinbinding,PPB)連同溶解性，親脂性，酸堿性等因素，影響著藥物的吸收、分布、代謝和排泄(ADME)。只有游離藥物可穿過(guò)細(xì)胞膜，在體內(nèi)分布而引起藥

21、物的反應(yīng)。隨著游離藥物在體內(nèi)的消除，蛋白結(jié)合藥物釋放由游離藥物，作為藥物儲(chǔ)存器維持游離藥物濃度，延長(zhǎng)藥物作用的持續(xù)時(shí)間。血漿蛋白結(jié)合增加了藥代動(dòng)力學(xué)半衰期，但它限制了藥物的組織分布。因此，血漿蛋白結(jié)合的研究及其在親和色譜中的應(yīng)用對(duì)天然活性成分的篩選具有重要意義。基于血漿蛋白結(jié)合的親和色譜技術(shù)在中藥活性成分的研究中有較多的應(yīng)用。王芳煥等<sup>14</sup>以大孔硅膠為基質(zhì)，用琰基咪嚏法合成了人血清白蛋白(HSA)色譜填料，用于鐵棒錘中活性成分的篩選。該實(shí)驗(yàn)選擇pH為7.4的磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，流速0.8mL?min-1,在鐵棒錘中提

22、取的總生物堿HSA色譜圖中由現(xiàn)2個(gè)明顯保留，由于配體與蛋白的結(jié)合反應(yīng)較快，而解離較慢，造成峰形拖尾。進(jìn)一步以反相色譜分離，聯(lián)用MS檢測(cè)器，鑒定由了脫乙酰去氧烏頭堿、苯甲酰脫氧烏頭堿、烏頭原堿、16-O-去甲基烏頭次堿4種成分。HSA親和色譜系統(tǒng)一般選用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，加入少量乙睛可以提高流動(dòng)相的洗脫能力。與藥物結(jié)合的血漿蛋白主要為HAS,HSA作為固定相廣泛應(yīng)用于藥物-蛋白研究中。而乜1-酸性糖蛋白（AGP）與藥物的結(jié)合也不容忽視，特別是對(duì)于堿性藥物，AGP為主要結(jié)合蛋白<sup>15</sup>。KarineVuig

23、nier等<sup>16</sup>使用HSA和AGP親和色譜柱，與MS檢測(cè)器聯(lián)用，研究親和色譜對(duì)藥物蛋白結(jié)合能力。比較實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道使用平衡透析法等方法所得結(jié)果的相關(guān)性，結(jié)果表明，使用HSA柱得到的蛋白結(jié)合能力結(jié)果與文獻(xiàn)的相關(guān)性較高，而AGP柱相關(guān)性較弱，而AGP柱的結(jié)果卻是HSA的補(bǔ)充。KarineVuignier還建立了高通量的藥物-蛋白結(jié)合篩選方法，每個(gè)樣品篩選時(shí)間小于3min。使用一個(gè)流動(dòng)相梯度適用于所有樣品的分析，蛋白結(jié)合率相似的藥物將在相同的時(shí)間段洗脫由來(lái)，以此將藥物按照與蛋白結(jié)合程度的強(qiáng)、中、弱分類。2.4 以DN

24、A為親和配基的色譜篩選遺傳信息載體脫氧核糖核酸（DNA）控制著細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，在生命過(guò)程中起著非常重要的作用。DNA是許多藥物的主要作用靶點(diǎn)，小分子與DNA結(jié)合的方式主要包括：嵌插作用、溝槽結(jié)合、靜電結(jié)合等非共價(jià)結(jié)合；共價(jià)結(jié)合；長(zhǎng)距組裝；剪切作用等<sup>17</sup>。其中，溝槽結(jié)合和嵌插作用不改變DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，且具有選擇性，而成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。近年來(lái)人們對(duì)藥物活性小分子與DNA相互作用模式理解的加深，為以DNA為親和配基篩選藥物提供了可能。Su等<sup>18</sup&g

25、t;使用小牛胸腺DNA(ct-DNA),通過(guò)DNA分子一端的磷酸基團(tuán)與氨丙基硅膠上的氨基形成磷氨鍵，合成了DNA親和色譜柱固定相，以紫外檢測(cè)器檢測(cè)，用于分離黃連、黃柏和苦參中的活性成分。在流動(dòng)相的選擇上，由于Mg2+可以和DNA分子的磷酸基結(jié)合從而起到穩(wěn)定DNA雙鏈的作用，與活性藥物競(jìng)爭(zhēng)DNA上的親和位點(diǎn)，故Mg2+的增加降低DNA親和物質(zhì)在色譜柱上的保留。乙睛用量的增加也能起到加快洗脫的作用。為了提高復(fù)雜樣品在DNA柱上的分離效果，使用了逐漸增加Mg2+和乙睛濃度的流動(dòng)相對(duì)黃連等提取物進(jìn)行了梯度分離。然而，由于含鹽流動(dòng)相的限制，此模型難以和質(zhì)譜聯(lián)用，Su等建立親和色譜/ODS柱二維色譜，且在

26、第一維富集除鹽后進(jìn)行后續(xù)分離，與質(zhì)譜聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜體系樣品的高效分離、篩選、活性成分鑒定一體化過(guò)程。2.5 細(xì)胞膜色譜篩選現(xiàn)代藥理研究表明，藥物吸收需經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜的擴(kuò)散或轉(zhuǎn)運(yùn)，并與細(xì)胞膜上特異性受體或酶結(jié)合而發(fā)揮藥效。因此，化合物的活性與細(xì)胞膜的通透性和藥物與細(xì)胞膜的親和性密切相關(guān)。賀浪沖教授于1996年提由了細(xì)胞膜色譜法(cellmembranechromatography,CMC)的概念，將生物活性的細(xì)胞膜固定在特定載體表面作為固定相，用液相色譜的方法研究藥物與細(xì)胞膜及膜受體的相互作用，動(dòng)態(tài)模擬藥物在體內(nèi)的作用過(guò)程。現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜上存在多種受體，單個(gè)細(xì)胞的受體密度可達(dá)10&am

27、p;lt;sup>/1</sup>10<sup>/1</sup>數(shù)量級(jí)。不同種類以及人體不同部位的細(xì)胞膜上存在著不同的受體、離子通道、酶等效應(yīng)靶點(diǎn)，使用不同部位的細(xì)胞膜用于不同藥理活性的藥物篩選，更貼近天然藥物多成分，多靶點(diǎn)的作用概念。細(xì)胞膜色譜法作為一種新的藥物篩選工具，被廣泛用于天然藥物的篩選及其與受體親和力的研究。對(duì)于細(xì)胞膜色譜法對(duì)于中藥活性成分的篩選，方藝霖等<sup>19</sup>在綜述中總結(jié)了幾種主要的細(xì)胞膜色譜模型：血管細(xì)胞膜

28、、心肌細(xì)胞膜、胰島B細(xì)胞膜、紅細(xì)胞膜，以篩選治療心血管疾病、糖尿病等藥物的活性成分。近年來(lái)，細(xì)胞膜固定相種類的增多使得細(xì)胞膜色譜的篩選有了更廣泛的應(yīng)用。如鼠腹腔巨噬細(xì)胞CMC模型<sup>20</sup>,人牙周膜細(xì)胞膜<sup>21</sup>,腫瘤細(xì)胞膜<sup>22</sup>等的由現(xiàn)，使得更多藥理活性的藥物得以篩選。CMC模型可不經(jīng)提取分離步驟而直接實(shí)現(xiàn)在復(fù)雜的體系中篩選生活性成分，簡(jiǎn)單，快速，有效。藥物作用靶點(diǎn)眾多，C

29、MC模型最大限度地保持了細(xì)胞膜的完整性和膜受體的活性。實(shí)現(xiàn)以不同藥理活性為指標(biāo)，選擇不同部位以及種類的細(xì)胞膜，用以多靶點(diǎn)篩選，提高篩選命中率。該方法具有命中率高、快速、經(jīng)濟(jì)、可反復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)。然而，CMC模型仍存在一些問(wèn)題需要解決。細(xì)胞膜為生物組織，相對(duì)于一般色譜，膜受體密度較小，柱效較低，載樣量較小，且生物膜的特殊性質(zhì)導(dǎo)致流動(dòng)相為緩沖鹽，與質(zhì)譜系統(tǒng)不匹配而導(dǎo)致在線鑒定的困難。為解決此問(wèn)題，王嗣岑等<sup>23</sup>結(jié)合柱切換技術(shù)，設(shè)計(jì)了二維液相色譜。以高表達(dá)EGFR細(xì)胞膜色譜柱為第一維，以反向色譜柱為第二維，與MS檢測(cè)器聯(lián)用，篩

30、選獨(dú)活中的活性成分。在第一維的細(xì)胞膜色譜中，中藥提取液中與細(xì)胞膜特異性結(jié)合的物質(zhì)發(fā)生保留，并通過(guò)一根反相C18預(yù)柱進(jìn)行富集，富集完成后，切換至第二維的反向色譜柱進(jìn)行二維分離，并以MS檢測(cè)器進(jìn)行分析，直接獲得活性成分的結(jié)構(gòu)信息。一、二維色譜分別以水、甲醇-水為流動(dòng)相，在保證胞膜色譜活性的同時(shí)兼顧了與MS檢測(cè)器的匹配，實(shí)現(xiàn)高效分離、篩選、鑒定一體化。應(yīng)用此二維色譜技術(shù)，亦有學(xué)者成功建立HepG2細(xì)胞膜、牙周韌帶細(xì)胞膜、A431細(xì)胞膜色譜模型，從川柏、苦參、黃苓、紅毛七、烏頭等天然藥物中分離由了抗腫瘤、骨再生活性的有效成分<sup>21-25</sup&am

31、p;gt;。將細(xì)胞膜色譜柱與反向柱結(jié)合，實(shí)現(xiàn)多種活性化合物的在線分離鑒定，為細(xì)胞膜色譜在天然藥物活性成分篩選中的應(yīng)用擴(kuò)展了思路。細(xì)胞膜為生物活性成分，在使用過(guò)程中，細(xì)胞膜蛋白的丟失導(dǎo)致細(xì)胞膜色譜柱保留能力變差，重復(fù)性得不到保證，且使用壽命較低。為解決此問(wèn)題，XuanDing等<sup>26</sup>考察細(xì)胞膜色譜柱的制備過(guò)程，優(yōu)化了細(xì)胞數(shù)量，剪切時(shí)間，裝載流速等參數(shù)，并加入4%PFA,使得細(xì)胞膜色譜柱的重現(xiàn)性和使用壽命大幅提高。2.6 脂筏色譜篩選脂筏(lipidraft)是細(xì)胞膜雙層結(jié)構(gòu)內(nèi)含有特殊脂質(zhì)和特殊蛋白質(zhì)的微區(qū)域。脂筏和細(xì)胞的

32、許多功能，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)和脂類的轉(zhuǎn)運(yùn)等都相關(guān)。研究表明，脂筏對(duì)影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及凋亡信號(hào)通路等多種因素均具有調(diào)節(jié)作用，因而成為近年來(lái)腫瘤治療研究中的新熱點(diǎn)<sup>27</sup>。相比于細(xì)胞膜色譜，脂筏色譜增強(qiáng)了篩選的特異性，且使用壽命大大延長(zhǎng)。童珊珊等<sup>28</sup>構(gòu)建抗腫瘤藥物的脂筏色譜在線篩選模型(lipidraftstationaryphasechromatography,LRC)。將從U251細(xì)胞中提取的脂筏固定于硅膠載體上，制備T

33、rkA(酪氨酸蛋白激酶受體)脂筏色譜柱，用于中藥活性成分的篩選。富含TrkA的脂筏色譜柱具有顯著的特異性：固定相能與以酪氨酸激酶受體為靶點(diǎn)的藥物特異性結(jié)合產(chǎn)生保留。TrkA-脂筏色譜柱保存時(shí)間為1個(gè)月，使用壽命遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于細(xì)胞膜色譜柱。TrkA-脂筏固定相色譜系統(tǒng)具備快速、有效、穩(wěn)定、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可用于篩選天然藥物中以酪氨酸激酶受體為靶點(diǎn)的先導(dǎo)化合物。用已建立的TrkA-脂筏固定相色譜系統(tǒng)篩選中藥五倍子中抗腫瘤活性成分，得到的具有抗腫瘤活性的部位顯示由良好的抑制U251腫瘤細(xì)胞的毒性。除了參與腫瘤的發(fā)生，脂筏和多種疾病的產(chǎn)生密切相關(guān)。脂筏通過(guò)募集相關(guān)的蛋白和酶，致使AB的生成和清除失衡而導(dǎo)致阿

34、爾茨海默病（AD）的發(fā)生<sup>29</sup>脂筏參與介導(dǎo)核突觸蛋白-a的異常積累，參與路易小體的形成過(guò)程，與帕金森?。≒D）的發(fā)生密切相關(guān)<sup>30</sup>脂筏中的一些特定蛋白參與完成胰島素分泌的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，與糖尿病的發(fā)生有直接關(guān)系<sup>31</sup>脂筏中的小窩蛋白-3參與心肌發(fā)育和能量代謝，和心血管疾病的產(chǎn)生有關(guān)，小窩蛋白-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮促動(dòng)脈粥樣硬化作用。另外，脂筏與一些肺部疾病、肝臟疾病甚至眼部

35、疾病都有密切關(guān)系?，F(xiàn)代藥理學(xué)對(duì)于脂筏的不斷研究，為構(gòu)建其他特異性受體脂筏模型及篩選其他活性成分提供了基礎(chǔ)。2.7 分子印跡技術(shù)分子印跡技術(shù)（molecularimprintingtechnology,MIT）是合成對(duì)模板分子具有特定識(shí)別能力的聚合物的新型仿生技術(shù)。以鎖匙作用原理，以目標(biāo)分子為模板，以共價(jià)法或非共價(jià)法制備具有高度親和性的聚合物材料（MIP）,MIP存在于模板分子空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)，官能團(tuán)相互作用（氫鍵，離子或范德華力等）的聚合物孔穴，對(duì)模板分子具有較強(qiáng)的親和性及識(shí)別能力。用于識(shí)別與模板分子構(gòu)型相同或相似的物質(zhì)。分子印跡技術(shù)通過(guò)選取特定的活性成分為模板，用于已知成分或其類似物的富集分離、

36、鑒定和篩選。天然藥物成分復(fù)雜，活性物質(zhì)含量很低，傳統(tǒng)分離方法無(wú)法有效將其分離，造成篩選鑒定的困難。以活性成分類似物作為模板，制備MIP,與質(zhì)譜聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)中藥活性成分的快速富集分離和鑒定。謝建春等<sup>32</sup>以駱駝蓬種籽中抗腫瘤活性化合物哈爾明及哈馬靈的結(jié)構(gòu)類似物哈爾滿作為模板，用非共價(jià)鍵法制備MIPo與大氣壓電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（ESI-TOF）聯(lián)用，直接分離鑒定了中藥駱駝蓬種籽甲醇粗提物中所含的哈爾明及哈馬靈2種抗腫瘤活性成分。奧些化合物雖具良好的生物活性，卻因?yàn)槎拘暂^高或生物利用度低等因素而無(wú)法成藥，或是因?yàn)閮r(jià)格昂貴而限制其

37、使用。分子印跡技術(shù)可以此類化合物為模板，從天然藥物中篩選結(jié)構(gòu)類似的替代藥物，從而獲得高效、低毒、高生物利用度的藥物。Huang等<sup>33</sup>以沒(méi)食子酸丙酯為模板，從中藥丹參粗提物中篩選抗血小板凝聚活性物質(zhì)原兒茶酸。袁小紅等<sup>34</sup>制備柯里拉京分子印跡聚合物，從中藥葉下珠中篩選柯里拉京及其結(jié)構(gòu)類似物。肖淑娟等&比sup>35</sup>從花生殼中分離抗腫瘤活性成分木犀草素。相比于生物親和色譜，MIP穩(wěn)定性

38、大大提高，聚合物性質(zhì)穩(wěn)定，耐酸、堿，耐高溫、高壓等。MIP與高效液相具有更好的兼容性：流動(dòng)相不用局限于生物相親性的緩沖鹽，與紫外、MS等檢測(cè)器匹配程度增加，MIP耐壓可以承受較高的流速，大大縮短了分離時(shí)間。然而，分子印跡技術(shù)還存在一些問(wèn)題，MIP對(duì)于目標(biāo)分子的識(shí)別主要基于化合物構(gòu)型，結(jié)構(gòu)特異性較高，在高效富集結(jié)構(gòu)類似物的同時(shí)，與藥理活性的相關(guān)性存在欠缺。目前可供使用的模板分子較少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足中草藥體系實(shí)際應(yīng)用的需要。且水等極性溶劑對(duì)非共價(jià)鍵MIP產(chǎn)生干擾，常用篩選溶劑為甲醇-醋酸（9：1）,而傳統(tǒng)天然藥物以水提為主，如何能在水溶液中進(jìn)行應(yīng)用仍是個(gè)難題。2.8 其他親和配基隨著對(duì)于天然藥物作用

39、原理及特點(diǎn)的深入研究，除了上述親和色譜篩選模型，更多親和色譜模型將被用于天然藥物活性成分的篩選，如核酸適配體親和色譜<sup>36</sup>、免疫親和色譜<sup>37</sup>、金屬離子親和色譜等等。并且隨著人們對(duì)天然藥物認(rèn)識(shí)的加深，天然藥物不僅僅局限于植物等草藥，而傳統(tǒng)中藥甲蟲(chóng)類藥物，蟲(chóng)草，以及海洋藥物也逐漸被研究者重視。由于此類藥物含有豐富的蛋白、多糖類結(jié)構(gòu)而使親和色譜技術(shù)在此類藥物活性成分篩選上體現(xiàn)由更大的優(yōu)勢(shì)。3結(jié)論親和色譜法是一種高通量的藥物活性分子篩選方法，其憑借快

40、速，穩(wěn)定，準(zhǔn)確，可靠等優(yōu)點(diǎn)成為一種重要的藥物篩選手段。親和色譜和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)在線分離，篩選，鑒定一體化。親和色譜篩選方法利用藥物和作用靶點(diǎn)的親和作用篩選活性分子，為天然藥物活性篩選提供了新的途徑。親和色譜篩選技術(shù)的發(fā)展依賴于對(duì)藥物作用靶點(diǎn)的基礎(chǔ)研究，并為探求藥物作用機(jī)理提供思路。隨著疾病發(fā)病機(jī)理的深入研究，更多藥物作用靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)，更多與天然藥物發(fā)現(xiàn)有關(guān)的新型篩選模型不斷由現(xiàn)，勢(shì)必為親和色譜技術(shù)在天然藥物篩選中的應(yīng)用提供更多策略與思路。參考文獻(xiàn)1ClonisYD.Affinitychromatographymaturesasbioinformaticandcombinato

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