液相增加柱效提高靈敏度的小訣竅

1、1液相增加柱效、提高靈敏度的小訣竅 資料收集：資料收集：2生化生化 多肽多肽- 5988-6316EN升溫對(duì)于反相升溫對(duì)于反相 HPLC分離強(qiáng)疏水肽的影響分離強(qiáng)疏水肽的影響 (B27)Polypeptide流動(dòng)相流動(dòng)相: A: 含含0.05%三氟乙酸的水三氟乙酸的水B: 含含0.05%三氟乙酸的乙腈三氟乙酸的乙腈2% B / min進(jìn)樣量進(jìn)樣量: 100L (50g的的6M脲脲/5%乙酸乙酸)UV: 210 nm流速流速: 1 mL/min室溫室溫液相色譜柱液相色譜柱: ZORBAX StableBond-C18色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5m室溫室溫300C400C50

2、0C600C700C提高柱溫，可增加柱提高柱溫，可增加柱效（提高靈敏度）效（提高靈敏度）3環(huán)保環(huán)保樣品樣品: 除草劑除草劑流動(dòng)相流動(dòng)相: 52/48 0.1 M乙酸乙酸鈉鈉/甲醇甲醇, pH 6流速流速: 0.45 mL/min溫度溫度: 40, 90檢測(cè)檢測(cè): UV除草劑除草劑: 柱溫的影響柱溫的影響Herbicides: Effect of Column Temperature1. 西瑪津西瑪津2. 敵草隆敵草隆3. 撲滅津撲滅津4. 撲滅凈撲滅凈5. 異丙甲草胺異丙甲草胺1. Simazine2. Diuron3. Propazine4. Prometryn5. etolachlor液相

3、色譜柱液相色譜柱: Zorbax StableBond-C18色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 4.6 x 150 mm, 5m4090提高柱溫，可增加柱提高柱溫，可增加柱效（提高靈敏度）效（提高靈敏度）4生物制藥生物制藥液相色譜柱液相色譜柱: Zorbax 300 StableBond-C3色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 4.6 x 150 mm, 5m 肽類肽類/蛋白質(zhì)蛋白質(zhì): 升溫對(duì)分離的影響升溫對(duì)分離的影響Peptides/Proteins: Effect of Elevated Temperature樣品樣品: 多肽多肽 流動(dòng)相流動(dòng)相: A = 5: 95, 乙腈乙腈 : 水水, 0.10%三氟乙酸三

4、氟乙酸 (V/V%)B = 95: 5, 乙腈乙腈 : 水水, 0.085%三氟乙酸三氟乙酸 (V/V%)梯度梯度: 在在 20 min內(nèi)內(nèi) 15-53%, 后運(yùn)行時(shí)間后運(yùn)行時(shí)間 12 min流速流速: l.0 mL/min 溫度溫度: 室溫室溫 -60檢測(cè)檢測(cè): UV 215 nm1. 亮氨酸腦啡呔亮氨酸腦啡呔 2. 血管緊張素血管緊張素II 3. 核糖核酸酶核糖核酸酶A 4. 牛胰島素牛胰島素 5. 細(xì)胞色素細(xì)胞色素C 6. 溶菌酶溶菌酶 7. 肌紅蛋白肌紅蛋白 8. 碳酸酐酶碳酸酐酶1.Leucine Enkephalin2. Angiotensin II3. Rnase A4. Ins

5、ulin(BOV)5. Cytochrome C6. Lysozyme7. Myoglobin8. Carbonic anhydrase提高柱溫，提高柱溫，可增加柱效可增加柱效（提高靈敏度）（提高靈敏度）5生物制藥生物制藥液相色譜柱液相色譜柱: Zorbax StableBond-C8色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 150 mm, 5m減小毛細(xì)管內(nèi)徑來(lái)提高減小毛細(xì)管內(nèi)徑來(lái)提高低濃度樣品的檢測(cè)靈敏度低濃度樣品的檢測(cè)靈敏度Reducing Capillary ID to Improve Sensitivityfor Concentration-Limited Samples流動(dòng)相流動(dòng)相: 60%乙腈乙腈/

6、40%水水流速流速: 內(nèi)徑內(nèi)徑 0.3 mm-4 uL/min內(nèi)徑內(nèi)徑 0.5 mm-10 uL/min內(nèi)徑內(nèi)徑 1.0 mm-50 uL/min內(nèi)徑內(nèi)徑 4.6 mm-1.0 uL/min溫度溫度: 室溫室溫檢測(cè)器檢測(cè)器: UV 254 nm樣品樣品: 200 ng聯(lián)二苯聯(lián)二苯 (100 nl) 減小柱徑，可增減小柱徑，可增加柱效（提高靈加柱效（提高靈敏度）敏度）6色譜柱技術(shù)色譜柱技術(shù) 5988-6454EN使用小體積色譜柱對(duì)于檢測(cè)器使用小體積色譜柱對(duì)于檢測(cè)器響應(yīng)時(shí)間的重要性響應(yīng)時(shí)間的重要性 (TE32)液相色譜柱液相色譜柱: ZORBAX StableBond-C18色譜柱尺寸色譜柱尺寸:

7、 4.6 x 15 mm 3.5m流動(dòng)相流動(dòng)相: 乙腈乙腈: 1%甲酸甲酸=32: 68UV: 254 nm流速流速: 1.0 mL / min. 30C進(jìn)樣量進(jìn)樣量: 5 L響應(yīng)時(shí)間響應(yīng)時(shí)間: 4.0秒秒響應(yīng)時(shí)間響應(yīng)時(shí)間: 2.0秒秒響應(yīng)時(shí)間響應(yīng)時(shí)間: 1.0秒秒響應(yīng)時(shí)間響應(yīng)時(shí)間: 0.5秒秒響應(yīng)時(shí)間響應(yīng)時(shí)間: 0.1秒秒1.尿嘧啶尿嘧啶2.乙酰水楊酸乙酰水楊酸3.N-乙酰苯胺乙酰苯胺1.Uracil2.Acetylsalicylic acid3.Acetanilide縮短檢測(cè)器響應(yīng)時(shí)間縮短檢測(cè)器響應(yīng)時(shí)間，可增加柱效，可增加柱效 （提高靈敏度）提高靈敏度）7色譜柱技術(shù)色譜柱技術(shù) ：不同硅膠類

8、型比較：不同硅膠類型比較 (TE1)流動(dòng)相流動(dòng)相: 含含0.05%甲醇的二氯甲甲醇的二氯甲烷烷 液相色譜柱液相色譜柱toluenebenzanilidephenolbenzyl alcoholZorbax SilSpherisorbZorbax Rx-Sil甲苯甲苯N-苯甲酰苯胺苯甲酰苯胺苯酚苯酚苯甲醇苯甲醇使用高純硅膠，使用高純硅膠，可增加柱效可增加柱效（提高靈敏度）（提高靈敏度）8有機(jī)化學(xué)有機(jī)化學(xué) 5988-6366ENpH對(duì)苯胺取代物分析的影響對(duì)苯胺取代物分析的影響 (ORCH1)流動(dòng)相流動(dòng)相25mM磷酸磷酸: 甲醇甲醇=58: 42 流速流速: 1 mL/min 22C液相色譜柱液相色

9、譜柱: ZORBAX StableBond-C18色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m對(duì)位甲氧基苯胺對(duì)位甲氧基苯胺間位苯甲胺間位苯甲胺3-氨基氨基-苯甲腈苯甲腈對(duì)位氯苯胺對(duì)位氯苯胺間位氯苯胺間位氯苯胺鄰位氯苯胺鄰位氯苯胺pH: 2.5pH: 7.0改變流動(dòng)相改變流動(dòng)相pH，可增加柱效可增加柱效（提高靈敏度）（提高靈敏度）9生化生化 肽肽 5988-6293EN三氟乙酸濃度對(duì)于反相肽的分離的影響三氟乙酸濃度對(duì)于反相肽的分離的影響 (B10)Peptide流動(dòng)相流動(dòng)相: A: 水和三氟乙酸水和三氟乙酸B: 乙腈和三氟乙酸乙腈和三氟乙酸0 - 30% B （30 min.內(nèi)）內(nèi)）流

10、速流速: 1 mL/minUV: 254 nm進(jìn)樣量進(jìn)樣量: 6uL十肽菌素標(biāo)樣十肽菌素標(biāo)樣S1-S5（疏水性有略微差異）（疏水性有略微差異）40C液相色譜柱液相色譜柱: ZORBAX 300 SB-C8色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m1.0%三氟乙酸三氟乙酸0.05%三氟乙酸三氟乙酸0.25%三氟乙酸三氟乙酸改變流動(dòng)相改變流動(dòng)相pH，可增加柱效可增加柱效（提高靈敏度）（提高靈敏度）10食品分析食品分析 5988-6360EN流動(dòng)相強(qiáng)度對(duì)單糖和二糖分離的影響流動(dòng)相強(qiáng)度對(duì)單糖和二糖分離的影響 (FD4)流動(dòng)相流動(dòng)相: 乙腈乙腈/水如圖水如圖流速流速: 1 mL/min示差折

11、光檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器液相色譜柱液相色譜柱: ZORBAX NH2 色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5m果糖果糖葡糖葡糖蔗糖蔗糖Palatinose海藻糖海藻糖異麥芽糖異麥芽糖乙腈乙腈/水水70/30乙腈乙腈/水水75/25 改變有機(jī)相改變有機(jī)相%，可增加柱效可增加柱效（提高靈敏度）（提高靈敏度）11色譜柱技術(shù)色譜柱技術(shù) 5988-6468EN有機(jī)改性劑和有機(jī)改性劑和pH對(duì)于選擇性的影響對(duì)于選擇性的影響 (TE5)流動(dòng)相流動(dòng)相: 25 mM磷酸緩沖液磷酸緩沖液流速流速: 1.0 mL/min.22C液相色譜柱液相色譜柱: ZORBAX StableBond-CN色譜柱尺寸色譜

12、柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5manisidinem-toluidine4-cl-aniline3-aminobenzonitrile3-cl-aniline2-cl-aniline甲氧基苯胺甲氧基苯胺間位苯甲胺間位苯甲胺4-氯氯-苯胺苯胺3-氨基苯甲腈氨基苯甲腈3-氯氯-苯胺苯胺2-氯氯-苯胺苯胺42%甲醇甲醇 ：58%緩沖液緩沖液 30%甲醇甲醇 ：70%緩緩沖液沖液pH 2.6pH 3.0改變有機(jī)相改變有機(jī)相%，可增加柱效可增加柱效（提高靈敏度）（提高靈敏度）12色譜柱技術(shù)色譜柱技術(shù) 5988-6453ENZORBAX Eclipse系列色譜柱系列色譜柱的選擇性的選擇性 (TE3

13、1)液相色譜柱液相色譜柱: ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m流動(dòng)相流動(dòng)相: 甲醇甲醇 : 水水=70: 30UV: 254 nm流速流速: 1.0 mL / min.室溫室溫Zorbax Eclipse XDB-苯基苯基Zorbax Eclipse XDB-C8Zorbax Eclipse XDB-C181.尿嘧啶尿嘧啶2.苯酚苯酚3.4-氯氯-硝基苯硝基苯4.甲苯甲苯5.萘萘1.Uracil2.Phenol3.4-Cl-nitrobenzene4.Toluene5.Naphthalene改變鍵合相，改變鍵合相，可增加柱效

14、可增加柱效（提高靈敏度）（提高靈敏度）13生物制藥生物制藥液相色譜柱液相色譜柱: Zorbax Extend-C18色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 2.1 x 150 mm, 5um三氟乙酸和氫氧化銨用于肽類三氟乙酸和氫氧化銨用于肽類RP-HPLCESI-MS分離的選擇性比較分離的選擇性比較Selectivity Comparison of TFA and NH4OH for Peptide RP-HPLCESI-MS Analysis流速流速: 0.25 mL/min. 溫度溫度: 25 梯度梯度: 5-60% B in 20 min.LC/MS: 正離子正離子, ESI- Vf 70V, Vcap

15、 4.5 kV, N2- 35 psi, 12 L/min., 300樣品樣品: 4L (各各50 ng)三氟乙酸條件三氟乙酸條件: A- 0.1%三氟乙酸水溶液三氟乙酸水溶液B-0.085%三氟乙酸三氟乙酸 80%的乙腈溶的乙腈溶液液NH4OH條件條件: A- 20 mM NH4OH水溶液水溶液B- 20 mM NH4OH 80%的乙腈的乙腈溶液溶液改變有機(jī)添加劑，改變有機(jī)添加劑，可增加柱效可增加柱效（提高靈敏度）（提高靈敏度）14生化生化 肽肽 十肽菌素十肽菌素 5988-6299EN酸對(duì)于反相肽的分離的影響酸對(duì)于反相肽的分離的影響(B16)decapeptide液相色譜柱液相色譜柱: Z

16、ORBAX 300 SB-C8 色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m十肽菌素十肽菌素 S1十肽菌素十肽菌素 S2十肽菌素十肽菌素 S3十肽菌素十肽菌素 S4十肽菌素十肽菌素 S5decapeptide S1 decapeptide S2 decapeptide S3 decapeptide S4 decapeptide S50.1% 三氟乙酸三氟乙酸0.025 M H3PO4改變有機(jī)添加劑改變有機(jī)添加劑可增加柱效可增加柱效（提高靈敏度）（提高靈敏度）流動(dòng)相流動(dòng)相: A: 含相應(yīng)的酸的水相含相應(yīng)的酸的水相 B: 含相應(yīng)的酸的乙腈含相應(yīng)的酸的乙腈 0%-30% B（30 min.

17、內(nèi)）內(nèi)）進(jìn)樣量進(jìn)樣量: 6L肽標(biāo)樣肽標(biāo)樣UV: 254 nm流速流速: 1 mL/min40C15色譜柱技術(shù)色譜柱技術(shù) 流動(dòng)相對(duì)色譜的影響流動(dòng)相對(duì)色譜的影響(TE40)液相色譜柱液相色譜柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 4.6 x 50 mm 3.5mUV: 254 nm流速流速: 1 mL/ min.室溫室溫UracilButylparabenNaphthaleneDipropylphthalateAcenaphthene尿嘧啶尿嘧啶尼帕爾金丁酯尼帕爾金丁酯萘萘二丙基鄰苯二甲酸酯二丙基鄰苯二甲酸酯苊苊刻度混合刻度混合: Dial-a-Mix A: 水水 B: 甲醇甲醇, 用泵