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文檔簡介

1、 MicroRNAs in Renal Cell Carcinoma: DiagnosticImplications of Serum miR-1233 Levels血清血清miR-1233對腎細(xì)胞癌診斷意義對腎細(xì)胞癌診斷意義Lena M. Wulfken1Rudolf MoritzCarsten Ohlmann, Stefan HoldenriederVolker Jung, FrankEdwin HerrmannGisela Walgenbach-Bru nagelBeckerAlexander von RueckerStefan C. Mu ller整理ppt整理ppt miRNA是一類

2、長約是一類長約 1924 nt的非編碼單鏈小的非編碼單鏈小RNA分分子子, 在動物中在動物中, 絕大多數(shù)絕大多數(shù)miRNA可以通過與靶基因可以通過與靶基因 3 UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合區(qū)互補(bǔ)結(jié)合, 抑制靶基因翻譯成蛋白質(zhì)抑制靶基因翻譯成蛋白質(zhì), 進(jìn)而在進(jìn)而在細(xì)胞、組織或個體水平上影響生物體的生長發(fā)育細(xì)胞、組織或個體水平上影響生物體的生長發(fā)育, 并并參與多種疾病過程。參與多種疾病過程。已有研究證實正常組織和腫瘤組織中已有研究證實正常組織和腫瘤組織中miRNA表達(dá)明表達(dá)明顯改變顯改變. miRNA在不同腫瘤中具有特定的表達(dá)模式在不同腫瘤中具有特定的表達(dá)模式. 這些特點也使這些特點也使miRNA有可能成為腫

3、瘤診斷的新的生有可能成為腫瘤診斷的新的生物學(xué)標(biāo)記和治療藥物作用的靶標(biāo)。物學(xué)標(biāo)記和治療藥物作用的靶標(biāo)。 MethodsObjectives:迄今為止,還沒有對腎癌患者循環(huán)中微?。浩駷橹梗€沒有對腎癌患者循環(huán)中微小水平進(jìn)行研究的報道。我們設(shè)計了用低密度芯水平進(jìn)行研究的報道。我們設(shè)計了用低密度芯片(片(TaqMan Low Density Array)技術(shù)檢測并且用傳統(tǒng))技術(shù)檢測并且用傳統(tǒng)的的 real-time PCR在一獨立組中證實了最有趣的在一獨立組中證實了最有趣的microRNAs, Participants:我們收集了腎腫瘤患者的血清,包括:我們收集了腎腫瘤患者的血清,包括腎細(xì)胞癌和良性

4、腎腫瘤(大嗜酸粒細(xì)胞瘤腎細(xì)胞癌和良性腎腫瘤(大嗜酸粒細(xì)胞瘤oncocytoma, 血管肌脂肪瘤血管肌脂肪瘤Angiomyolipoma),選取了非惡性疾病),選取了非惡性疾病的手術(shù)患者作為對照組,表,我們收集來自、的手術(shù)患者作為對照組,表,我們收集來自、三所大學(xué)泌尿外科至、三所大學(xué)泌尿外科至這些患者術(shù)前的血液樣本。這些患者術(shù)前的血液樣本。從血液樣本中分離出血清。從血液樣本中分離出血清。We also analyzed formalin-fixed, paraffin embeddedtissue from six patients stored in the archival files of

5、 the Institut furPathologie at theRNA isolation:提取血清中提取血清中提取病理組織切片中的提取病理組織切片中的Statistical methods:real-time PCR得出的數(shù)據(jù)用得出的數(shù)據(jù)用SDS software v2.4分析,分析,microRNA 水平用水平用RQ Managerv1.2.1計算出計算出, 數(shù)據(jù)分析用數(shù)據(jù)分析用DataAssist v2.0,數(shù)據(jù)統(tǒng)計用數(shù)據(jù)統(tǒng)計用SPSS17.軟件,軟件, microRNA 水平的特異水平的特異性、靈敏性用分析,性、靈敏性用分析,ResultsPhase-1: 標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)

6、 載樣緩沖液作用:載樣緩沖液作用:1 1)增大樣品密度,以確保)增大樣品密度,以確保DNADNA均勻進(jìn)入樣品孔內(nèi)均勻進(jìn)入樣品孔內(nèi)為了使樣品能沉入膠孔,需加入適量的蔗糖、聚蔗糖為了使樣品能沉入膠孔,需加入適量的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重或甘油以增加比重2 2)使樣品呈現(xiàn)顏色,從而使加樣操作更為便利)使樣品呈現(xiàn)顏色,從而使加樣操作更為便利3 3)含有指示劑,在電場中能以可預(yù)知速率向陽極泳)含有指示劑,在電場中能以可預(yù)知速率向陽極泳動動指示劑指示劑 電泳過程中,常使用一種有顏色的標(biāo)記物以指示樣品的遷電泳過程中,常使用一種有顏色的標(biāo)記物以指示樣品的遷移過程。核酸電泳常用的指示劑有兩種:移過程。

7、核酸電泳常用的指示劑有兩種:溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)(bromophenol blue Bb) (bromophenol blue Bb) 呈藍(lán)紫色,呈藍(lán)紫色,二甲苯青藍(lán)二甲苯青藍(lán)(xylene cyanol(xylene cyanol,Xc) Xc) 呈藍(lán)色。呈藍(lán)色。 0.50.5TBETBE做電泳液時溴酚藍(lán)的泳動率約與長做電泳液時溴酚藍(lán)的泳動率約與長300bp300bp的雙鏈的雙鏈DNADNA相同,二甲苯氰(藍(lán))則與相同,二甲苯氰(藍(lán))則與4kbp4kbp的的DNADNA相同。所以根據(jù)相同。所以根據(jù)分離樣品中分離樣品中DNADNA分子的大小,可以參照指示劑分子的大小,可以參照指示劑BbBb和和XcXc

8、的遷移的遷移情況決定是否停止電泳情況決定是否停止電泳 3 3 瓊脂糖瓊脂糖( Agarose)( Agarose)凝膠的制備凝膠的制備 制好的凝膠制好的凝膠水平電泳槽水平電泳槽A A 通常將溴化乙錠通常將溴化乙錠EB (0.5EB (0.5微克毫升,母液微克毫升,母液10mg/ml10mg/ml)) )滲人到凝膠和電泳緩沖液中。滲人到凝膠和電泳緩沖液中。B B 也可使凝膠在不加溴化乙錠時進(jìn)行電泳,也可使凝膠在不加溴化乙錠時進(jìn)行電泳, 電泳結(jié)束后再柒電泳結(jié)束后再柒DNADNA。在室溫下將凝膠浸埋在含溴。在室溫下將凝膠浸埋在含溴化乙錠化乙錠 (0.5(0.5微克毫升微克毫升) )的電泳緩沖液或水中

9、的電泳緩沖液或水中4545分鐘。分鐘。 C C 而其他系列染色劑,例如而其他系列染色劑,例如SYBR GreenSYBR Green,GelRedGelRed,雖然毒性小,但價格昂貴。雖然毒性小,但價格昂貴。4 4、 瓊脂糖凝膠中瓊脂糖凝膠中DNADNA的染色的染色 溴化乙錠溴化乙錠( ( Ethidium bromide, EB)Ethidium bromide, EB)染色染色 EBEB嵌入嵌入DNADNA堿堿基對之間基對之間, , 會會被被紫外光激發(fā)而紫外光激發(fā)而放出約放出約600nm600nm的熒光的熒光. . EB EB為為致癌物,操作時務(wù)必戴上手套致癌物,操作時務(wù)必戴上手套!535

10、3SGSGSGSGSGExcitationEmission5 5、加樣、加樣1 1) 以紫外光做為光源以紫外光做為光源. .2 2)需使用紅或黃色濾光片去除光源干擾需使用紅或黃色濾光片去除光源干擾. .3 3)操作時須小心操作時須小心EBEB, , 務(wù)務(wù)必戴上手套必戴上手套. . 估計估計DNA分子量分子量13531078872603310281/271234194118720123456M121.522.533.5123456distance migrated (cm)log10 nucleotide pairs21DNA粗略定量粗略定量20kb20kb12kb12kb10kb10kb6kb

11、6kb1.2kb1.2kb0.8kb0.8kb1. 1.將準(zhǔn)確稱量的粉狀瓊脂糖加人已定量的電泳緩沖液中;將準(zhǔn)確稱量的粉狀瓊脂糖加人已定量的電泳緩沖液中;2.2.在沸水浴中或微波爐中將糊狀物加熱直至瓊脂糖完全溶解;在沸水浴中或微波爐中將糊狀物加熱直至瓊脂糖完全溶解;3.3.將溶液冷卻至將溶液冷卻至50-60 50-60 o oC C,再加入溴化乙錠,再加入溴化乙錠 ( (取自貯存在取自貯存在4 4 o oC C避光避光瓶中瓶中500500毫克毫升水中的母液毫克毫升水中的母液) )至終濃度為至終濃度為0.50.5微克毫升;微克毫升;5.5.將瓊脂糖溶液灌注入制膠模具中,并立即插入梳子,使其齒在將瓊

12、脂糖溶液灌注入制膠模具中,并立即插入梳子,使其齒在靠近膠一端的位置形成加樣的孔格。靠近膠一端的位置形成加樣的孔格。6.6.當(dāng)凝膠完全凝固后當(dāng)凝膠完全凝固后( (在室溫下在室溫下3030一一4545分鐘分鐘) ),小心取出梳子,將,小心取出梳子,將膠安放在電泳槽中;膠安放在電泳槽中;7.7.加恰好足量的電泳緩沖液加恰好足量的電泳緩沖液( (若需要可加若需要可加0.50.5微克毫升的溴化乙微克毫升的溴化乙錠,使膠埋在溶液中深約錠,使膠埋在溶液中深約l l毫米處。毫米處。 8 .8 .加樣加樣樣品與載樣緩沖液混合后,加樣品到已浸埋在緩沖液中的凝膠樣品與載樣緩沖液混合后,加樣品到已浸埋在緩沖液中的凝膠

13、孔格中??赘裰小]d樣緩沖液:通常制成載樣緩沖液:通常制成6 6倍的濃縮液,與樣品混合后,用微量倍的濃縮液,與樣品混合后,用微量移液器加樣。移液器加樣。 9 .9 .電泳電泳電壓:電壓:5v/cm5v/cm,DNADNA向正極泳動直至溴酚藍(lán)和二甲苯青藍(lán)在凝向正極泳動直至溴酚藍(lán)和二甲苯青藍(lán)在凝膠中遷移出適當(dāng)?shù)木嚯x。膠中遷移出適當(dāng)?shù)木嚯x。 10 .10 .檢測檢測 紫外燈,凝膠成像系統(tǒng)。紫外燈,凝膠成像系統(tǒng)。防止防止EBEB污染!污染!六、聚丙烯酰胺凝膠電泳(六、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGEPAGE) CHCH2 2=CH=CHC=OC=ONHNH2 2CH2=CHCH2=CH C=O C=O NH

14、 NH CHCH2 2 NH NH C=O C=O CH CH2 2=CH=CH-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH- n nCHCH2 2-CH-CH- C=OC=O C=O C=O NHNH2 2 NH NH CHCH2 2 NH NH C=O C=O-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH- n nCHCH2 2-CH-CH- C=O C=O C=OC=O NH NH2 2 NHNH2 2丙烯酰胺(丙烯酰胺(AcrAcr)N,N-N,N-甲叉雙丙烯酰胺(甲叉雙丙烯酰胺(BisBis)聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺變性:變性:凝膠在尿素等抑制核酸堿基配對的試凝

15、膠在尿素等抑制核酸堿基配對的試劑或蛋白變性劑劑或蛋白變性劑SDS(如(如SDS-PAGE電泳電泳)的的存在下發(fā)生聚合。用途包括單鏈存在下發(fā)生聚合。用途包括單鏈DNA的分的分離,如放射性離,如放射性DNA探針的分離、探針的分離、DNA測序測序反應(yīng)產(chǎn)物的分析。反應(yīng)產(chǎn)物的分析。 SDS-PAGE用于蛋白質(zhì)分用于蛋白質(zhì)分子量的測定。子量的測定。3 3、聚丙烯酰胺凝膠較之瓊脂糖凝膠有如下優(yōu)點、聚丙烯酰胺凝膠較之瓊脂糖凝膠有如下優(yōu)點(1 1)(2 2)分辨率極高,可分開長度僅相差)分辨率極高,可分開長度僅相差0.10.1的的DNADNA分分子,即子,即1000bp1000bp中相差中相差1bp1bp(3

16、3)比瓊脂糖凝膠的載樣量大,在)比瓊脂糖凝膠的載樣量大,在1cm 1cm 1mm 1mm的膠的膠孔中能上樣到孔中能上樣到10g10g的的DNADNA樣品,而分辨率并無明顯樣品,而分辨率并無明顯下降下降(4 4)回收的)回收的DNADNA樣品純度極高,可用于要求非常嚴(yán)樣品純度極高,可用于要求非常嚴(yán)格的實驗,如轉(zhuǎn)基因動物實驗,引物合成后的分離純格的實驗,如轉(zhuǎn)基因動物實驗,引物合成后的分離純化化(5 5)經(jīng)常被用作分離蛋白質(zhì),且分離效果好。)經(jīng)常被用作分離蛋白質(zhì),且分離效果好。Acr(g)+Bis(g)V(ml)X100%T=X100%Acr(g)+Bis(g)Bis(g)C=要制備透明而有彈性的凝

17、膠,要制備透明而有彈性的凝膠, 要控制要控制在在30左右左右。T在在25時,時, 20左右;左右;T在在510時,時, 40左右;左右;T在在1520時,時, =125200左右。左右。T在在325的范圍內(nèi),凝膠易發(fā)生聚合。的范圍內(nèi),凝膠易發(fā)生聚合。8.38.38.96.78.38.38.96.7(2 2)緩沖體系離子成分及)緩沖體系離子成分及pHpH值的不連續(xù)性值的不連續(xù)性 :低導(dǎo)區(qū)低導(dǎo)區(qū)制膠玻璃板制膠玻璃板 SDSSDS(十二萬及磺酸鈉(十二萬及磺酸鈉) )是陰離子表面活性劑,是陰離子表面活性劑,與蛋白質(zhì)結(jié)合形成與蛋白質(zhì)結(jié)合形成SDS-SDS-蛋白復(fù)合物,蛋白質(zhì)分子即蛋白復(fù)合物,蛋白質(zhì)分子

18、即帶大量的負(fù)電荷,并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過原來所帶的電荷,使帶大量的負(fù)電荷,并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過原來所帶的電荷,使天然蛋白質(zhì)分子之間的電荷差別降低,甚至可以忽天然蛋白質(zhì)分子之間的電荷差別降低,甚至可以忽略略 同時蛋白質(zhì)在同時蛋白質(zhì)在SDSSDS作用下結(jié)構(gòu)變得松散,形狀作用下結(jié)構(gòu)變得松散,形狀趨向一致,趨向一致,因此,排除了蛋白質(zhì)的電荷和結(jié)構(gòu)差異,因此,排除了蛋白質(zhì)的電荷和結(jié)構(gòu)差異,SDS-SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時的泳動差異就由蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時的泳動差異就由蛋白質(zhì)的分分子量子量所決定。所決定。(電荷效應(yīng))SDS-PAGE 電泳過程電泳過程(一)試劑配置(一)試劑配置 1、30%丙烯酰胺混合液(丙烯酰胺混

19、合液(Acr:Bis 為為29:1):稱取丙烯):稱取丙烯酰胺(酰胺(Acr)29g及甲叉丙烯酰胺(及甲叉丙烯酰胺(Bis)1g,用水溶,用水溶解并稀釋至解并稀釋至100ml,貯,貯棕色瓶棕色瓶中于中于4保存,可用一個保存,可用一個月。月。( Acr和和Bis有神經(jīng)毒性?。┯猩窠?jīng)毒性!) 2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl緩沖液:取緩沖液:取1mol/L HCL溶液溶液48ml、三羥甲基甲烷(、三羥甲基甲烷(Tris)36.6g,加水至,加水至80ml使其溶解,調(diào)使其溶解,調(diào)pH至至8.8,然后用水稀釋至,然后用水稀釋至100ml,置,置棕棕色瓶色瓶中,中,4貯存。貯存。 3、

20、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液:取緩沖液:取1mol/L HCL溶液溶液48ml,Tris5.98g,加水至,加水至80ml,調(diào),調(diào)pH6.8,用水,用水稀釋至稀釋至100ml,置,置棕色瓶棕色瓶中,中,4貯存。貯存。4、Tris-甘氨酸電泳緩沖液:稱取甘氨酸電泳緩沖液:稱取Tris 6g、甘氨酸、甘氨酸28.8g,加水,加水850ml,調(diào),調(diào)pH至至8.3,加水到,加水到1000ml,4貯存。用時可做貯存。用時可做10倍稀釋。倍稀釋。 5、10% 過硫酸銨(過硫酸銨(AP)6、10%SDS(十二烷基磺酸鈉)(十二烷基磺酸鈉) 稱取稱取 SDS 10g,加水,加水100ml使

21、其溶解。使其溶解。(戴好口罩)(戴好口罩)7、四甲基乙二胺(、四甲基乙二胺(TEMED) 8、上樣緩沖液:取、上樣緩沖液:取1.0mol/L pH6.8Tris-HCl緩沖液緩沖液6.25ml,蔗糖,蔗糖10g,SDS 2.3g,1g/L溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)10ml,加,加蒸餾水溶解,混合至蒸餾水溶解,混合至100ml。 9、考馬斯亮藍(lán)染色試劑、考馬斯亮藍(lán)染色試劑 考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)R250染色液:染色液:濃度為濃度為2.5g/L,用甲醇,用甲醇 醋酸醋酸 蒸餾水蒸餾水=5 1 5的的溶液配制(溶液配制(V/V)。)。 10、脫色液:取冰醋酸、脫色液:取冰醋酸7.5ml、甲醇、甲醇5ml,加蒸餾水,

22、加蒸餾水至至100ml。 11、樣品、樣品(二)灌膠(二)灌膠 1、先將膠板(、先將膠板(590mm)封好,將配制好的分離膠液按)封好,將配制好的分離膠液按配方灌注入膠板內(nèi),約配方灌注入膠板內(nèi),約70mm高度(掌握分離膠的高高度(掌握分離膠的高度),度),在凝膠表面輕輕加一層正丁醇液在凝膠表面輕輕加一層正丁醇液(約(約34mm)。)。用于隔絕空氣,使膠面平整。室溫下靜置約用于隔絕空氣,使膠面平整。室溫下靜置約3060min。觀察膠和正丁醇之間的界面,判斷膠是否凝固。要在確觀察膠和正丁醇之間的界面,判斷膠是否凝固。要在確認(rèn)分離膠徹底凝固后才開始配制濃縮膠。認(rèn)分離膠徹底凝固后才開始配制濃縮膠。 2

23、、分離膠凝固好后,倒掉覆蓋在分離膠表面的正、分離膠凝固好后,倒掉覆蓋在分離膠表面的正丁醇,并用去離子水沖洗一次,倒置吸凈殘留的丁醇,并用去離子水沖洗一次,倒置吸凈殘留的水。將配制好的濃縮膠液灌注入膠板內(nèi)(約水。將配制好的濃縮膠液灌注入膠板內(nèi)(約15mm),插入合適的梳齒,室溫下靜置約),插入合適的梳齒,室溫下靜置約3060min。觀察膠界面,判斷膠是否凝固,準(zhǔn)備加樣。觀察膠界面,判斷膠是否凝固,準(zhǔn)備加樣。(三)樣品預(yù)處理和加樣(三)樣品預(yù)處理和加樣 1 1、取蛋白(如血清)、取蛋白(如血清)0.1ml0.1ml、適量上樣緩沖液,混、適量上樣緩沖液,混勻,在沸水中煮沸勻,在沸水中煮沸5min5m

24、in。 2 2、將膠板放入垂直電泳槽中,夾緊,將、將膠板放入垂直電泳槽中,夾緊,將Tris-Tris-甘氨酸甘氨酸電泳緩沖液加入上、下槽中,電泳緩沖液要蓋過膠電泳緩沖液加入上、下槽中,電泳緩沖液要蓋過膠板口,然后用微量加樣器(或注射器)將適量樣品板口,然后用微量加樣器(或注射器)將適量樣品加到加樣孔內(nèi)。加到加樣孔內(nèi)。 (四)電泳(四)電泳 上槽接負(fù)極,下槽接正極,先調(diào)電流為上槽接負(fù)極,下槽接正極,先調(diào)電流為18mA/濃縮膠,開始電泳,當(dāng)指示染料進(jìn)入分離膠后,濃縮膠,開始電泳,當(dāng)指示染料進(jìn)入分離膠后,將電壓調(diào)至將電壓調(diào)至20mA/分離膠,繼續(xù)電泳直至染料抵達(dá)距分離膠,繼續(xù)電泳直至染料抵達(dá)距分離膠

25、下端約分離膠下端約1cm處,停止電泳,斷開電源。電泳時處,停止電泳,斷開電源。電泳時間約間約1.01.5h。 (五)考馬斯亮藍(lán)染色:電泳結(jié)束后,取出電泳膠(五)考馬斯亮藍(lán)染色:電泳結(jié)束后,取出電泳膠板。用剝膠器輕輕撬起薄板的一頭,一邊用水輕沖,板。用剝膠器輕輕撬起薄板的一頭,一邊用水輕沖,一邊拿掉薄板,用細(xì)小水流推膠至至大培養(yǎng)皿中。一邊拿掉薄板,用細(xì)小水流推膠至至大培養(yǎng)皿中。然后將凝膠板浸入考馬斯亮藍(lán)染色液中然后將凝膠板浸入考馬斯亮藍(lán)染色液中0.5-1h,再用,再用脫色液脫色脫色液脫色12天,至背景無色為止。區(qū)帶可作定性天,至背景無色為止。區(qū)帶可作定性或定量分析。或定量分析。 (六)分子量測定

26、:精確量取并記錄染色后、各標(biāo)志(六)分子量測定:精確量取并記錄染色后、各標(biāo)志蛋白質(zhì)和各待測蛋白質(zhì)區(qū)帶的遷移率。蛋白質(zhì)和各待測蛋白質(zhì)區(qū)帶的遷移率。通過作圖求出目標(biāo)蛋白分子量。通過作圖求出目標(biāo)蛋白分子量??捡R斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)R250( 考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G250(染色方法染色方法 :1 1、在、在90ml90ml甲醇:水(甲醇:水(1:11:1,v/v)v/v)和和10ml10ml冰乙酸的混合冰乙酸的混合液中溶解液中溶解0.25g0.25g考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)R250R250,用濾紙過濾染液以用濾紙過濾染液以除去顆粒狀物質(zhì)除去顆粒狀物質(zhì)。2 2、用至少、用至少5 5倍體積的染液浸泡凝膠,放在平緩

27、搖動的倍體積的染液浸泡凝膠,放在平緩搖動的平臺上于室溫染色平臺上于室溫染色1h1h以上。以上。3 3、回收染液,將凝膠浸泡于不加染料的甲醇、回收染液,將凝膠浸泡于不加染料的甲醇- -乙酸溶乙酸溶液中,平緩搖動液中,平緩搖動4-8h4-8h進(jìn)行脫色,更換脫色液三四次。進(jìn)行脫色,更換脫色液三四次。注意:由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基注意:由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此酸的含量不同,因此G250用于不同蛋白質(zhì)測定用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差,時有較大的偏差,在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時通常選用在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時通常選用r-球蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)球蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),以減少這方面的偏

28、差。,以減少這方面的偏差。1 1、搪瓷盤中倒入、搪瓷盤中倒入2000ml2000ml左右左右70%70%乙醇,把膠做好標(biāo)記卸入乙乙醇,把膠做好標(biāo)記卸入乙醇中,搖床上固定醇中,搖床上固定15min15min。3 3、190ml190ml蒸餾水中加入蒸餾水中加入3.6%3.6%的的NaOH4.2mlNaOH4.2ml、20%AgNO20%AgNO3 33.6ml3.6ml、氨水氨水2ml2ml混勻配成染色液。倒入染色液,染色混勻配成染色液。倒入染色液,染色30min30min。2、回收乙醇(可重復(fù)用、回收乙醇(可重復(fù)用3-5次),蒸餾水洗次),蒸餾水洗2遍,每遍遍,每遍2-3min,盡可能把水倒凈

29、。盡可能把水倒凈。4、倒掉染色液,蒸餾水洗、倒掉染色液,蒸餾水洗3遍,每遍遍,每遍2-3min,盡可能把水倒凈。,盡可能把水倒凈。5 5、200ml200ml蒸餾水中加入蒸餾水中加入1%1%檸檬酸鈉檸檬酸鈉1ml1ml,甲醛,甲醛100ul100ul混勻配成混勻配成顯色液。倒入顯色液顯色至清晰。顯色液。倒入顯色液顯色至清晰。6、倒掉顯色液,加蒸餾水停顯,并洗、倒掉顯色液,加蒸餾水停顯,并洗2-3遍。遍。分子雜交分子雜交(molecular hybridizationmolecular hybridization)( (一一) ) 種類種類 1. 1. 按其分子種類劃分按其分子種類劃分 1 1)

30、 DNADNA雜交雜交探針為探針為DNADNA或或RNA RNA 2 2) RNARNA雜交雜交探針為探針為DNADNA或或cDNAcDNA 3 3) 蛋白質(zhì)免疫分析蛋白質(zhì)免疫分析探針為抗體探針為抗體核酸分子雜交技術(shù):具有一定同源性的兩條互補(bǔ)的核核酸分子雜交技術(shù):具有一定同源性的兩條互補(bǔ)的核酸單鏈在一定的條件下酸單鏈在一定的條件下( (適宜的溫度及離子強(qiáng)度等適宜的溫度及離子強(qiáng)度等) )可可按堿基互補(bǔ)原則退火形成雙鏈,具有高度特異性按堿基互補(bǔ)原則退火形成雙鏈,具有高度特異性 。RNA DNA DNA RNA 待測核酸序列及探針待測核酸序列及探針1 1)待測核酸序列:基因片段,基因組)待測核酸序列

31、:基因片段,基因組DNADNA和細(xì)胞總和細(xì)胞總RNARNA。2 2)探針:用于檢測的已知核酸片段稱之為探針)探針:用于檢測的已知核酸片段稱之為探針(probe)(probe)探針:探針: 為了便于示蹤,探針必須用一定的手段加以標(biāo)為了便于示蹤,探針必須用一定的手段加以標(biāo)記,以利于隨后的檢測。常用的標(biāo)記物是放射性同位記,以利于隨后的檢測。常用的標(biāo)記物是放射性同位素,近年來也發(fā)展了一些非放射性標(biāo)記物如素,近年來也發(fā)展了一些非放射性標(biāo)記物如地高辛、地高辛、生物素生物素等。檢測這些標(biāo)記物的方法都是極其靈敏的。等。檢測這些標(biāo)記物的方法都是極其靈敏的。 地高辛地高辛(Digoxigenin,DIG)一種從洋

32、地黃類植物(毛地黃一種從洋地黃類植物(毛地黃和毛花毛地黃)中提取的類固醇(和毛花毛地黃)中提取的類固醇(Steroid)物質(zhì))物質(zhì) ,由于,由于洋地黃植物的花和葉片在自然界中的洋地黃植物的花和葉片在自然界中的唯一來源唯一來源,因此抗,因此抗DIG的抗體不會與其他的生物物質(zhì)結(jié)合,從而可以滿足特的抗體不會與其他的生物物質(zhì)結(jié)合,從而可以滿足特異性標(biāo)記的需要異性標(biāo)記的需要 生物素生物素-親合素系統(tǒng)親合素系統(tǒng) (biotin-avidin system,BAS) 生物素可以與生物素可以與親和素親和素、鏈霉親和素鏈霉親和素結(jié)合非常緊密結(jié)合非常緊密,比抗原抗體之間親和力高幾百萬倍。比抗原抗體之間親和力高幾百

33、萬倍。所以,生物素標(biāo)記蛋白,可以用鏈霉親和素標(biāo)記的所以,生物素標(biāo)記蛋白,可以用鏈霉親和素標(biāo)記的熒光或者二抗檢測。熒光或者二抗檢測。 蛋 白 質(zhì)蛋白質(zhì)免疫分析蛋白質(zhì)免疫分析探針為抗體探針為抗體2. 2. 按樣品制備過程劃分按樣品制備過程劃分 1 1) 原位雜交原位雜交(in situ hybridization) (in situ hybridization) i. i. 原位菌落雜交:原位菌落雜交:DNADNA探針與菌落探針與菌落DNADNA的雜交。的雜交。 ii. ii. 原位噬菌斑雜交:原位噬菌斑雜交: DNADNA探針與噬菌斑探針與噬菌斑DNADNA的雜的雜交。交。 iii. iii.

34、原位細(xì)胞雜交:原位細(xì)胞雜交:cDNAcDNA與細(xì)胞中的與細(xì)胞中的RNARNA雜交雜交 iv. iv. 原位組織塊雜交:原位組織塊雜交:DNADNA探針與染色體探針與染色體DNADNA雜交。雜交。 以上都是原位裂解細(xì)胞,不需要分離以上都是原位裂解細(xì)胞,不需要分離DNADNA,RNARNA或蛋白質(zhì)樣品,可同時處理大量樣品,常用于目的基或蛋白質(zhì)樣品,可同時處理大量樣品,常用于目的基因的篩選或檢測某類細(xì)胞或組織中是否存在某一特定因的篩選或檢測某類細(xì)胞或組織中是否存在某一特定的的DNADNA、RNARNA或蛋白質(zhì)序列。或蛋白質(zhì)序列。2 2)斑點雜交)斑點雜交(dot hybridization)(dot

35、 hybridization) 先分離先分離DNADNA,RNARNA或蛋白質(zhì),然后將樣品液直接或蛋白質(zhì),然后將樣品液直接點在固體基質(zhì)上進(jìn)行雜交,不能測定分子量大小。點在固體基質(zhì)上進(jìn)行雜交,不能測定分子量大小。 3 3)轉(zhuǎn)移雜交或印跡雜交)轉(zhuǎn)移雜交或印跡雜交(blotting hybridization)(blotting hybridization) 膜上印跡雜交是指將待測核酸序列片段結(jié)合到一膜上印跡雜交是指將待測核酸序列片段結(jié)合到一定的定的固相支持物固相支持物上,然后與存在于液相中標(biāo)記的探針上,然后與存在于液相中標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交的過程,是目前最常用的一種核酸分子雜交進(jìn)行雜交的過程,是目前

36、最常用的一種核酸分子雜交方法。方法。最常用的幾種固相支持物最常用的幾種固相支持物 硝酸纖維素濾膜硝酸纖維素濾膜(Nitrocellulose filter, NCF)(Nitrocellulose filter, NCF)可與三類大分子結(jié)合,但是不能結(jié)合小分子可與三類大分子結(jié)合,但是不能結(jié)合小分子DNADNA,RNARNA和蛋白質(zhì)(和蛋白質(zhì)(20,00020,000) 尼龍膜尼龍膜尼龍膜是目前較理想的一種核酸固相支持物它有尼龍膜是目前較理想的一種核酸固相支持物它有多種類型,除網(wǎng)眼大小不一樣外,有的尼龍膜未經(jīng)多種類型,除網(wǎng)眼大小不一樣外,有的尼龍膜未經(jīng)特殊處理,有些則是經(jīng)過了正電荷基團(tuán)的修飾,這

37、特殊處理,有些則是經(jīng)過了正電荷基團(tuán)的修飾,這種修飾的尼龍膜結(jié)合核酸的能力更強(qiáng)。種修飾的尼龍膜結(jié)合核酸的能力更強(qiáng)。( (三三) )分子雜交的一般程序分子雜交的一般程序 1) DNA1) DNA和和RNARNA的雜交的雜交 制備制備DNADNA或或RNARNA樣品樣品與固定基質(zhì)結(jié)合與固定基質(zhì)結(jié)合8080真空固定真空固定預(yù)雜交預(yù)雜交加入標(biāo)記探針雜交加入標(biāo)記探針雜交洗滌洗滌放射自顯影或顯色反應(yīng)。放射自顯影或顯色反應(yīng)。 2 2)蛋白質(zhì)的免疫分析)蛋白質(zhì)的免疫分析 制備蛋白質(zhì)樣品制備蛋白質(zhì)樣品與固定基質(zhì)結(jié)合與固定基質(zhì)結(jié)合常溫空氣中固定常溫空氣中固定封閉封閉劑封閉劑封閉 一抗反應(yīng)一抗反應(yīng)洗滌洗滌二抗二抗-

38、-酶偶聯(lián)物反應(yīng)酶偶聯(lián)物反應(yīng)洗滌洗滌顯色反顯色反應(yīng)(應(yīng)(EIAEIA) 或或 一抗放射標(biāo)記物一抗放射標(biāo)記物洗滌洗滌放射自顯影(放射自顯影(RIARIA)2)Western blotting2)Western blotting雜交雜交雜交對象是蛋白質(zhì),是通過抗原抗體的免疫反應(yīng),從雜交對象是蛋白質(zhì),是通過抗原抗體的免疫反應(yīng),從混合樣品中檢測出特異的目的蛋白?;旌蠘悠分袡z測出特異的目的蛋白。 先將蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳展開,先將蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳展開, 然后將凝膠中的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到固相膜上。然后將凝膠中的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到固相膜上。2 2 用待測目標(biāo)蛋白的抗體(一抗)與固相

39、膜上的蛋白用待測目標(biāo)蛋白的抗體(一抗)與固相膜上的蛋白質(zhì)相互作用。質(zhì)相互作用。3 3 經(jīng)辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗與第經(jīng)辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗與第一抗反應(yīng)后的固相膜作用,如果一抗能與目標(biāo)蛋白一抗反應(yīng)后的固相膜作用,如果一抗能與目標(biāo)蛋白結(jié)合,則二抗可以和第一抗結(jié)合,那么二抗連接的結(jié)合,則二抗可以和第一抗結(jié)合,那么二抗連接的標(biāo)記酶與顯色底物反應(yīng)呈現(xiàn)顏色,從而可以確定固標(biāo)記酶與顯色底物反應(yīng)呈現(xiàn)顏色,從而可以確定固相膜上目標(biāo)蛋白的位置及分子質(zhì)量大小。相膜上目標(biāo)蛋白的位置及分子質(zhì)量大小。l轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜l封閉封閉l一抗雜交一抗雜交l二抗雜交二抗雜交l底物顯色底物顯色轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜一抗、二

40、抗孵育辣根過氧化物酶法(辣根過氧化物酶法(HRPHRP)堿性磷酸酶法(堿性磷酸酶法(APAP)化學(xué)發(fā)光法(化學(xué)發(fā)光法(ECL)ECL) ECL是指酶催化底物發(fā)熒光,熒光可使是指酶催化底物發(fā)熒光,熒光可使X光片曝光片曝光光, 檢測的下限可達(dá)到檢測的下限可達(dá)到pg水平水平 )三、三、DNADNA核苷酸序列的測序核苷酸序列的測序1 Sanger1 Sanger的雙脫氧終止法的雙脫氧終止法2 Maxam-Gilbert 2 Maxam-Gilbert 化學(xué)修飾法化學(xué)修飾法 3 DNA3 DNA序列的自動化分析序列的自動化分析測序技術(shù)的建立測序技術(shù)的建立 DNA DNA測序即測序即核酸核酸DNADNA分

41、子一級結(jié)構(gòu)的測定,是分子一級結(jié)構(gòu)的測定,是現(xiàn)代分子生物學(xué)一項重要的技術(shù)現(xiàn)代分子生物學(xué)一項重要的技術(shù)。 1963 1963年,年,第一次完成胰島素第一次完成胰島素5151個氨基酸個氨基酸的序列測定的序列測定 70 70年代后期,年代后期,和和Maxam-GilbertMaxam-Gilbert等人又等人又建立了核酸序列測定的方法,建立了核酸序列測定的方法,SangerSanger雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法和和Maxam-GilbertMaxam-Gilbert化學(xué)裂解法將核酸序列測定技術(shù)化學(xué)裂解法將核酸序列測定技術(shù)推進(jìn)到推進(jìn)到“直讀直讀”階段,使核酸序列測定變得遠(yuǎn)比蛋階段,使核酸序列測定變得遠(yuǎn)

42、比蛋白質(zhì)氨基酸序列測定容易,這樣人們可以通過核酸白質(zhì)氨基酸序列測定容易,這樣人們可以通過核酸序列和遺傳密碼推導(dǎo)出蛋白質(zhì)氨基酸的序列。序列和遺傳密碼推導(dǎo)出蛋白質(zhì)氨基酸的序列。O堿基堿基CPOHH12345O堿基堿基CPOHH12345OH脫氧核苷酸的連接脫氧核苷酸的連接1 1、 SangerSanger的雙脫氧終止法的雙脫氧終止法O堿基堿基CPOH12345O堿基堿基CPOHH12345H2O脫氧核苷酸的連接脫氧核苷酸的連接O堿基堿基CPHH12345O堿基堿基CPOHH12345OHX雙脫氧核苷酸雙脫氧核苷酸?ATGCGGTACCAT53測序模板5四套反應(yīng)體系四套反應(yīng)體系1-dATP, dCT

43、P, dGTP, dTTP. + ddATP2-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddCTP3-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddGTP4-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddTTP TA5TACGCCA5TACGCCATGGTATACTACGCTACGCC第一套反應(yīng)第二套反應(yīng)ACGTATGGTACCGCATTACCATGGCGTA模板互模板互補(bǔ)序列補(bǔ)序列待測序列待測序列Sanger法測序產(chǎn)物的平法測序產(chǎn)物的平均鏈長取決于均鏈長取決于ddNTP與與dNTP的比例,比例高的比例,比例高時,得到較短的產(chǎn)物時,得到較短的產(chǎn)物直讀堿基序列直讀

44、堿基序列手工測序結(jié)果手工測序結(jié)果 法是法是MaxamMaxam和和GilbertGilbert等人等人19771977年創(chuàng)建的,用來測定年創(chuàng)建的,用來測定DNADNA序列?;瘜W(xué)法是用序列?;瘜W(xué)法是用化學(xué)試劑在化學(xué)試劑在A A、G G、C C、T T處特定地裂解處特定地裂解DNADNA片段,產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈,經(jīng)過片段,產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈,經(jīng)過PAGEPAGE膠電泳后,可以直接讀出膠電泳后,可以直接讀出DNADNA的順序。的順序。 熒光檢測探頭熒光檢測探頭電泳,看誰跑得快除核苷酸序列文本文件外,全自動測序儀還提供曲線圖。除核苷酸序列文本文件外,全自動測序儀還提供曲線圖。四四 聚合酶鏈?zhǔn)椒?/p>

45、應(yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( ,PCRPCR) 1 1、基本原理:基于、基本原理:基于DNADNA的半保留復(fù)制的半保留復(fù)制,兩條鏈,兩條鏈都可以作為模板。在體內(nèi),都可以作為模板。在體內(nèi),DNADNA復(fù)制是周期性復(fù)制是周期性的,所以基因擴(kuò)增的數(shù)量有限;的,所以基因擴(kuò)增的數(shù)量有限;PCRPCR技術(shù)在體技術(shù)在體外利用人工合成的引物,再加上外利用人工合成的引物,再加上DNADNA聚合酶和聚合酶和一些合適的底物和因子,通過對溫度的控制,一些合適的底物和因子,通過對溫度的控制,使使DNADNA不斷位于變性、復(fù)性和合成的循環(huán)中,不斷位于變性、復(fù)性和合成的循環(huán)中,達(dá)到擴(kuò)增達(dá)到擴(kuò)增DNADNA的目的。的目的。thermu

46、s aquaticusTaqTaq DNA DNA多聚酶的發(fā)現(xiàn)多聚酶的發(fā)現(xiàn)19881988年年Saiki Saiki 等從溫泉等從溫泉中分離的一株水生嗜中分離的一株水生嗜熱桿菌熱桿菌(thermus (thermus aquaticus) aquaticus) 中提取到一中提取到一種耐熱種耐熱DNADNA聚合酶。聚合酶。熱穩(wěn)定的聚合酶對簡熱穩(wěn)定的聚合酶對簡化化PCRPCR過程非常重要。過程非常重要。反復(fù)進(jìn)行三步驟的循環(huán)過程:熱變性反復(fù)進(jìn)行三步驟的循環(huán)過程:熱變性退火退火引引物延伸物延伸1)熱變性:基因組)熱變性:基因組DNA在在95度下加熱度下加熱5分,雙螺旋結(jié)分,雙螺旋結(jié)構(gòu)被熱變性解鏈為兩股

47、單鏈。構(gòu)被熱變性解鏈為兩股單鏈。2)退火:將反應(yīng)混合物降溫至)退火:將反應(yīng)混合物降溫至55攝氏度,引物與上述攝氏度,引物與上述單鏈單鏈DNA上互補(bǔ)的序列雜交在一起,即退火,上互補(bǔ)的序列雜交在一起,即退火,形成模形成模板板引物復(fù)合物引物復(fù)合物。3 3)引物延伸:在)引物延伸:在DNADNA聚合酶作用下,以聚合酶作用下,以dNTPdNTP為原料,為原料,從引物從引物33端開始,沿著端開始,沿著5353的方向,按照模板鏈的方向,按照模板鏈的序列,合成一條新的序列,合成一條新DNADNA鏈,其序列與模板序列互補(bǔ)。鏈,其序列與模板序列互補(bǔ)。 經(jīng)上述變性經(jīng)上述變性-退火退火-引物延伸這一循環(huán),雙鏈引物延伸

48、這一循環(huán),雙鏈DNADNA拷貝數(shù)增加一倍。進(jìn)行拷貝數(shù)增加一倍。進(jìn)行n n次循環(huán),拷貝數(shù)將增加次循環(huán),拷貝數(shù)將增加2 2的的n n次次方倍,如進(jìn)行方倍,如進(jìn)行25302530個循環(huán),拷貝數(shù)即擴(kuò)增上百萬倍。個循環(huán),拷貝數(shù)即擴(kuò)增上百萬倍。PCRPCR基本要素基本要素 25-3525-35個循環(huán)個循環(huán) 長度:至少長度:至少 16bp 16bp ,通常為,通常為 18-30bp18-30bp。 更短的引物一般會降低擴(kuò)增的特異性,但會提高擴(kuò)增的有效性。更短的引物一般會降低擴(kuò)增的特異性,但會提高擴(kuò)增的有效性。 引物的解鏈溫度:兩個引物之間的引物的解鏈溫度:兩個引物之間的 Tm Tm 值差異最好在值差異最好在

49、 2-5 2-5 。 對于小于對于小于 20 20 個堿基的引物其個堿基的引物其 Tm Tm 值可用簡易公式計算,即值可用簡易公式計算,即 Tm=4Tm=4(G+CG+C)+2+2(A+TA+T)。)。 對于對于 20-70 20-70 個核苷酸的引物可用個核苷酸的引物可用 以下公式計算。以下公式計算。 Tm=81.5+16.6Tm=81.5+16.6(1gK+1gK+)+0.41+0.41(G+CG+C)%-%-(675/N675/N) N N 表示引物的核苷酸數(shù)目,表示引物的核苷酸數(shù)目, K+ K+ 表示單價離子即鉀離子的濃度表示單價離子即鉀離子的濃度 避免引物內(nèi)部或引物之間形成引物二聚體

50、(特別是引物的避免引物內(nèi)部或引物之間形成引物二聚體(特別是引物的 33端)。端)。 G+C G+C 含量:盡量控制在含量:盡量控制在 40% 40% 至至 60% 60% 之間,之間, 4 4 種堿基的分布應(yīng)種堿基的分布應(yīng) 盡可能均勻。盡量避免嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列,以及盡可能均勻。盡量避免嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列,以及 T T 在在 3 3 末末 端的重復(fù)排列。端的重復(fù)排列。 引物的引物的 3 3 末端最好是末端最好是 G G 或或 C C ,但不要,但不要 GC GC 連排。連排。6 6 限制性酶切位點之前加保護(hù)堿基限制性酶切位點之前加保護(hù)堿基 MgMgClCl2 2, 50mM K50mM K

51、+ + E HE H55A33A2 2)T-T-載體載體pMD18-TVector是一種高效克隆是一種高效克隆PCR產(chǎn)物的專用載產(chǎn)物的專用載體。本載體由體。本載體由pUC18載體改建而成,在載體改建而成,在pUC18載體載體的多克隆位點處的的多克隆位點處的XbaI和和SalI識別位點之間插入了識別位點之間插入了EcoRV識別位點,用識別位點,用EcoRV進(jìn)行酶切反應(yīng)后,再進(jìn)行酶切反應(yīng)后,再在兩側(cè)的在兩側(cè)的3端添加端添加“T”而成。而成。載體特點:將普通載體特點:將普通的克隆載體切成線狀,并使之的克隆載體切成線狀,并使之33末端含有一個突出末端含有一個突出堿基堿基T.T.可以大大提高可以大大提高

52、PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。產(chǎn)物的連接、克隆效率。 RT-PCRRT-PCR(reverse transcriptase-PCR,RT-PCR):reverse transcriptase-PCR,RT-PCR):又稱反又稱反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄PCR, PCR, 是以反轉(zhuǎn)錄的是以反轉(zhuǎn)錄的cDNAcDNA作模板所進(jìn)行的作模板所進(jìn)行的PCRPCR,可,可對基因的表達(dá)和序列多態(tài)性分析。對基因的表達(dá)和序列多態(tài)性分析。聚合酶聚合酶cDNAPCR擴(kuò)增AAAnAAAAnA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄 T T TnTcDNA第一鏈第一鏈mRNA常規(guī)常規(guī)PCRPCR技術(shù):技術(shù):對對PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物終

53、產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析進(jìn)行定量及定性分析定量定量PCRPCR技術(shù):技術(shù):對對PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)的產(chǎn)物每一個循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性進(jìn)行定量及定性分析分析原理:原理:實時熒光定量實時熒光定量PCR技術(shù),是指在技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。量分析的方法。 定量曲線定量曲線 熒光定量定量PCR擴(kuò)增曲線可以分成三個階段:擴(kuò)增曲線可以分成三個階段:1)熒光背景信號階段(基線期)熒光背景信號階段(

54、基線期)在基線期,擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,在基線期,擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。2)熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段(對數(shù)期)熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段(對數(shù)期)只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段,只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段,PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,可以選擇在這個階與起始模板量之間存在線性關(guān)系,可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。段進(jìn)行定量分析。3)平臺期)平臺期擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。域值(域值(threshold):將熒光信號由本底進(jìn)入指數(shù)):將熒光信號由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的熒光強(qiáng)度設(shè)定為域值。增長階段的拐點所對應(yīng)的熒光強(qiáng)度設(shè)定為域值。一般熒光域值的設(shè)置是一般熒光域值的設(shè)置是 基線(背景)熒光信號的基線(背景)熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。倍。Ct值(值(Cycle threshold):熒光信號達(dá)到域值所):熒光信號達(dá)到域值所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)稱為對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)稱為Ct值。值。 Ct值與模板起始拷貝值與模板起

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