蘋果中多酚氧化酶最適pH的測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)二 蘋果中多酚氧化酶最適 pH 的測(cè)定1、 實(shí)驗(yàn)原理存在于果蔬中的多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）在適宜的條件下能引起果蔬的酶促褐變。因此，多酚氧化酶對(duì)于食品加工具有重要意義。多酚氧化酶是一種含銅離子的酶，它能催化兩類不同的反應(yīng)。一是一元酚羥基化，二是鄰-二酚氧化。在一些植物中，多酚氧化酶能同時(shí)催化這兩類反應(yīng)；而在另一些植物中，多酚氧化酶僅能催化鄰-二酚氧化，卻不能催化一元酚羥基化。如果采用鄰-二酚作底物，那么隨著酶催化反應(yīng)進(jìn)行，反應(yīng)混合物的吸光值因鄰-苯醌的量的增加而增大，因此可采用分光光度法測(cè)定多酚氧化酶的活力。2、 試劑和儀器試劑：0.2mol/L醋酸-醋酸

2、鈉緩沖液，pH分別為3.6、4.0、4.6、5.0和5.6、0.2mol/L磷酸鹽緩沖液，pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0、0.01mol/L兒茶酚溶液、0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，pH=6.5、丙酮儀器：組織搗碎機(jī)、抽濾裝置、721分光光度計(jì)（含比色皿）、秒表、常規(guī)玻璃儀器、離心機(jī)三、實(shí)驗(yàn)步驟1、從蘋果中萃取多酚氧化酶將100 g蘋果迅速去梗和核后切成小塊，和400mL左右預(yù)先冷凍至26的丙酮一起倒入組織搗碎機(jī)中均質(zhì)（20,000 rpm，2 min），然后迅速抽濾，保留濾紙上的沉淀部分，將沉淀薄層中殘留的丙酮用冷風(fēng)吹去，至沉淀無(wú)丙酮味。將所得丙酮粉轉(zhuǎn)移至150 mL 0

3、.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）中，攪拌30 min，然后離心（4,10000 r/m,20 min），離心所得上清液如有混濁，則用8層紗布過濾，從而得到多酚氧化酶提取液。2、不同pH下多酚氧化酶活力的測(cè)定在比色皿中分別加入1.81.1 mL pH為3.6的緩沖液和0.7mL兒茶酚溶液，攪勻后加入0.51.2mL多酚氧化酶提取液，迅速攪勻，測(cè)定反應(yīng)混合物在400 nm下的吸光值隨時(shí)間的變化，參比以緩沖液代替酶液。依次測(cè)定4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0幾個(gè)pH。四、數(shù)據(jù)記錄與處理數(shù)據(jù)記錄：pH值3.64.04.65.05.66.06.57.07

4、.58.0加酶量（mL）1.01.210´OD值0.1720.166（12s）0.1600.1500.147（12s）0.115（12s）0.106（15s）0.130（11s）0.160（11s）0.15120´OD值0.2140.2040.2100.1940.1490.1150.1070.1320.1620.15130´OD值0.2580.2500.2580.2400.1520.1150.1090.1340.1630.15140´OD值0.3000.2950.3020.2960.1560.1170.1080.1350.1650.15250´

5、OD值0.3410.3380.3480.3290.1610.1170.1100.1360.1660.15360´OD值0.3820.3770.3920.3730.1660.1180.1110.1370.1700.15470´OD值0.4200.4180.4330.4150.1710.1210.1130.1390.1730.15680´OD值0.4570.4560.4750.4550.1750.1230.1170.1430.1750.15890´OD值0.4940.4940.5140.4960.1790.1260.1180.1430.1780.161100

6、´OD值0.5290.5300.5540.5340.1860.1270.1200.1450.1820.164110´OD值0.5650.5670.5910.5720.1880.1300.1210.1510.1840.165120´OD值0.5980.6010.6260.6070.1920.1330.1240.1510.1880.168用Excel處理數(shù)據(jù)，得到不同pH下消光-時(shí)間曲線的斜率，斜率的物理意義即每分鐘增加的消光值，也即酶的活力單位數(shù)。數(shù)據(jù)處理：pH值3.64.04.65.05.66.06.57.07.58.0加酶量1.0mL1.2mL酶活力0.2328

7、0.24100.25400.24980.02640.01020.01020.01140.01550.0098酶活mL0.23280.24100.25400.24980.0220.00850.00850.00950.01290.0082用Excel作圖得到下圖：由酶活力-pH曲線關(guān)系可以得知蘋果中的多酚氧化酶在pH=4.6時(shí)的酶活力最高，也就是說(shuō)pH4.6是蘋果中多酚氧化酶的最適pH。5、 討論1、 蘋果中存在著多酚氧化酶的天然底物，因此在制備多酚氧化酶提取液的過程中，快速和低溫是必要的條件，否則將得到褐色的酶液。2、 丙酮可使酶蛋白沉淀下來(lái)，從而與天然底物分離，但是常溫下丙酮會(huì)導(dǎo)致酶變性，因此必須先冷卻至26。事實(shí)上，在試驗(yàn)中，丙酮并沒有冷卻到