UV紫外分光光度計(jì)

1、1 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) Ultraviolet and Visible Spectrophotometer 2概述是基于物質(zhì)分子對(duì)光的選擇性吸收而建立起來(lái)的分析方法。按物質(zhì)吸收光的波長(zhǎng)不同，可分為可見(jiàn)分光光度法、紫外分光光度法及紅外分光光度法。特點(diǎn)：*靈敏度較高（110mgL-1），適用于微量組分的測(cè)定。但相對(duì)誤差較大（25%）。*具有操作方便、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、靈敏度和選擇性較好等優(yōu)點(diǎn)，為常規(guī)的儀器分析方法。3 光的吸收定律Lambert-beer定律朗伯比爾定律當(dāng)一束平行的單色光照射到有色溶液時(shí)，光的一部分將被溶液吸收，一部分透過(guò)溶液，還有一部分被器皿表面所反射。設(shè)入射光強(qiáng)度為I0，透過(guò)光強(qiáng)度

2、為I，溶液的濃度為c，液層寬度為b，經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明它們之間有下列關(guān)系：kcbIIA0lg(1-1)4透光度、吸光度與溶液濃度及液層寬度的關(guān)系 （1-2） 溶液濃度與寬度的乘積與吸光度成正比，而不是與透光度成正比。以上兩式中k是比例系數(shù)，與入射光波長(zhǎng)、溶液的性質(zhì)及溫度有關(guān)。當(dāng)入射光波長(zhǎng)和溶液溫度一定時(shí)，k代表單位濃度的有色溶液放在單位寬度的比色皿中的吸光度.。當(dāng)c的單位為gL-1，b的單位為cm時(shí)，k以a表示，稱為吸光系數(shù)(absorption coefficient)，其單位為L(zhǎng)g-1cm-1，此時(shí)式（9-3）變?yōu)?abcA kbcT1lg IIlgA0(1-3)5 如果濃度c的單位為molL-1

3、，b的單位為cm，這時(shí)k常用 表示。稱為摩爾吸光系數(shù)(molar absorptivity)，其單位為L(zhǎng)mol-1cm-1，它表示吸光質(zhì)點(diǎn)的濃度為1molL-1，溶液的寬度為1cm時(shí)，溶液對(duì)光的吸收能力。 值越大，表示吸光質(zhì)點(diǎn)對(duì)某波長(zhǎng)的光吸收能力愈強(qiáng)，故光度測(cè)定的靈敏度越高。值在103以上即可進(jìn)行分光光度法測(cè)定，高靈敏度的分光光度法可達(dá)到105106。于是式（1-1）可寫成為：A=bc （1-4）與a的關(guān)系為：=Ma （1-5） 式中M為吸光物質(zhì)的摩爾質(zhì)量6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)基本構(gòu)造單色器光源檢測(cè)器吸收池信號(hào)顯示系統(tǒng)7) ：在整個(gè)紫外光區(qū)或可見(jiàn)光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有在整個(gè)紫外光區(qū)或可見(jiàn)光

4、譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長(zhǎng)的使用壽命。足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長(zhǎng)的使用壽命?？梢?jiàn)光區(qū)：可見(jiàn)光區(qū)：鎢燈、鹵鎢燈、氙燈，其輻射波長(zhǎng)范圍在鎢燈、鹵鎢燈、氙燈，其輻射波長(zhǎng)范圍在3203202500 2500 nmnm。鎢燈最適宜的使用波長(zhǎng)范圍為鎢燈最適宜的使用波長(zhǎng)范圍為3203201000nm1000nm。紫外區(qū)：紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射氫、氘燈。發(fā)射185185400 400 nmnm的連續(xù)光譜。的連續(xù)光譜。使用波長(zhǎng)范圍一般為使用波長(zhǎng)范圍一般為190190360nm 360nm 。8 ：其作用是將光源輻射的復(fù)合光分解成按波長(zhǎng)順序排列的單色光。包括狹縫和色散元件

5、及準(zhǔn)直鏡三部分。色散元件用棱鏡或光柵制成。光柵其特點(diǎn)是工作波段范圍寬，適用性強(qiáng)，對(duì)各種波長(zhǎng)色散率幾乎一致。光柵由玻璃片或金屬片制成，其上準(zhǔn)確地刻有大量寬度和距離都相等的平行線條（刻痕），可近似地將它看成一系列等寬度和等距離的透光狹縫。9又稱比色皿，是由無(wú)色透明的光學(xué)玻璃或熔融石英制成，用于盛裝試液或參比溶液。玻璃吸收池：在見(jiàn)光范圍內(nèi)使用。石英吸收池：在紫外光范圍內(nèi)使用。吸收池，通常有0.5cm、1cm、2cm、3cm和5cm寬，可適用于不同濃度范圍的試樣測(cè)定。同一組吸收池的透光率相差應(yīng)小于0.5%。10把透過(guò)吸收池后透射光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換成電訊號(hào)的裝置。 檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)具有靈敏度高、對(duì)透過(guò)光的響應(yīng)時(shí)間短、

6、且響應(yīng)的線性關(guān)系好，對(duì)不同波長(zhǎng)的光具有相同的響應(yīng)可靠性。在分光光度計(jì)中常用光電管和光電倍增管等做檢測(cè)器。光電倍增管其靈敏度要比光電管約高200倍。11顯示器是將檢測(cè)器檢測(cè)的信號(hào)顯示和記錄下來(lái)的裝置。在分光光度計(jì)中常用的是微安表、數(shù)碼顯示管等。簡(jiǎn)單的分光光度計(jì)多用微安表。在標(biāo)尺上有透光度（T）和吸光度（A）兩種刻度，由于吸光度和透光度是負(fù)對(duì)數(shù)關(guān)系，因此透光度的刻度是均勻的，而吸光度的刻度是不均勻的。12分光光度計(jì)的主要類型131.1.單光單光束束：經(jīng)單色器分光后的一束平行光，輪流通過(guò)參比溶液和樣品溶液，以進(jìn)行吸光度的測(cè)定。這種簡(jiǎn)易型分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便，維修容易，適用于常規(guī)分析。2.2.

7、雙光束雙光束：經(jīng)單色器分光后經(jīng)反射鏡分解為強(qiáng)度相等的兩束光，一束通過(guò)參比池，一束通過(guò)樣品池。光度計(jì)能自動(dòng)比較兩束光的強(qiáng)度，此比值即為試樣的透射比，經(jīng)對(duì)數(shù)變換將它轉(zhuǎn)換成吸光度并作為波長(zhǎng)的函數(shù)記錄下來(lái)?？焖偃ǘ螔呙?。可消除光源不穩(wěn)定、檢測(cè)器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價(jià)格較高。3 3. .雙波長(zhǎng)雙波長(zhǎng)：由同一光源發(fā)出的光被分成兩束，分別經(jīng)過(guò)兩個(gè)單色器，得到兩束不同波長(zhǎng)（1和2）的單色光；利用切光器使兩束光以一定的頻率交替照射同一吸收池，然后經(jīng)過(guò)光電倍增管和電子控制系統(tǒng)，最后由顯示器顯示出兩個(gè)波長(zhǎng)處的吸光度差值A(chǔ)。對(duì)于多組分混合物、混濁試樣（如生物組織液）分析，以及存在背

8、景干擾或共存組分吸收干擾的情況下，利用雙波長(zhǎng)分光光度法，往往能提高方法的靈敏度和選擇性。利用雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)，能獲得導(dǎo)數(shù)光譜。14 定量分析時(shí)，通常液層厚度是相同的，按照比爾定律，濃度與吸光度之間的關(guān)系應(yīng)該是一條通過(guò)直角坐標(biāo)原點(diǎn)的直線。但在實(shí)際工作中，往往會(huì)偏離線性而發(fā)生彎曲。若在彎曲部分進(jìn)行定量，將產(chǎn)生較大的測(cè)定誤差。偏離朗伯一比爾定律的原因15 朗伯一比爾定律只對(duì)一定波長(zhǎng)的單色光才能成立，但在實(shí)際工作中，即使質(zhì)量較好的分光光度計(jì)所得的入射光，仍然具有一定波長(zhǎng)范圍的波帶寬度。在這種情況下，吸光度與濃度并不完全成直線關(guān)系，因而導(dǎo)致了對(duì)朗伯一比爾定律的偏離。所得入射光的波長(zhǎng)范圍越窄，即“單色光”

9、越純，則偏離越小。 單色光不純所引起的偏離16由于溶液本身的原因所引起的偏離 吸光系數(shù)k與溶液的折光指數(shù)n有關(guān)。溶液濃度在0.01molL-1或更低時(shí)，n基本上是一個(gè)常數(shù)，說(shuō)明朗伯一比爾定律只適用于低濃度的溶液。濃度過(guò)高會(huì)偏離朗伯一比爾定律。 朗伯比爾定律是建立在均勻、非散射的溶液這個(gè)基礎(chǔ)上的。如果介質(zhì)不均勻，呈膠體、乳濁、懸浮狀態(tài)，則入射光除了被吸收外，還會(huì)有反射、散射的損失，因而實(shí)際測(cè)得的吸光度增大，導(dǎo)致對(duì)朗伯比爾定律的偏離。17 溶質(zhì)的離解、締合、互變異構(gòu)及化學(xué)變化也會(huì)引起偏離。其中有色化合物的離解是偏離朗伯比爾定律的主要化學(xué)因素。例如，顯色劑KSCN與Fe3+形成紅色配合物Fe(SCN

10、)3，存在下列平衡：Fe(SCN)3 Fe3+3SCN溶液稀釋時(shí)，上述平衡向右，離解度增大。所以當(dāng)溶液體積增大一倍時(shí)，F(xiàn)e(SCN)3的濃度不止降低一半，故吸光度降低一半以上，導(dǎo)致偏離朗伯比爾定律。18紫外可見(jiàn)分光光度法的誤差和測(cè)量條件的選擇分光光度法的誤差 利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線段來(lái)測(cè)定被測(cè)溶液的濃度，從而減少由入射光為非單色光引起的誤差；也可以利用試劑空白和確定適宜的濃度范圍來(lái)減少由溶液本身所引起的誤差。 吸光度與透光率是負(fù)對(duì)數(shù)關(guān)系，故吸光度的標(biāo)尺刻度是不均勻的。一般來(lái)說(shuō)透光率為2065（吸光度為0.20.7）時(shí)，濃度測(cè)量的相對(duì)誤差都不太大。這就是分光光度分析中比較適宜的吸光度范圍。19 比色

11、皿的質(zhì)量，檢流計(jì)的靈敏度。，光源不穩(wěn)定、棱鏡的性能、安裝條件及光電管的質(zhì)量等都可以使分析產(chǎn)生誤差。 由分析人員所采用的實(shí)驗(yàn)條件與正確的條件有差別所引起的，如顯色條件和測(cè)量條件掌握得不好等。20 透光度讀數(shù)誤差T是一個(gè)常數(shù)，但在不同的讀數(shù)范圍內(nèi)所引起的濃度的相對(duì)誤差卻是不同的。因此，為了減小濃度的相對(duì)誤差，提高測(cè)量的準(zhǔn)確度，一般應(yīng)控制被測(cè)液的吸光度A在0.20.7（透光度為65%20%）。當(dāng)溶液的吸光度不在此范圍時(shí)，可以通過(guò)改變稱樣量、稀釋溶液以及選擇不同厚度的比色皿來(lái)控制吸光度。21一、 儀器測(cè)量條件的選擇 1.適宜的吸光度范圍由朗伯-比爾定律可知： A=lg1/T=cl 微分后得： dlgT=0.4343dT/T= -ldc 或 0.4343T/T= -lc代入朗伯-比爾定律有： c/c=0.4343T/TlgT要使測(cè)定的相對(duì)誤差c/c最小，求導(dǎo)取極小得出： lgT=-0.4343=A即當(dāng)A=0.4343時(shí)，吸光度測(cè)量誤差最小22紫外可見(jiàn)分光光度法應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用: 測(cè)量試樣