海藻糖生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)新技術(shù)

1、海藻糖生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)新技術(shù)1研究背景1.1海藻糖的分子結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)海藻糖（Trehalose）是由兩個葡萄糖分子以1,1-糖苷鍵連結(jié)而成，分子內(nèi)不存在游離的半縮羥基，是一種穩(wěn)定的非還原性二糖。海藻糖有3種光學(xué)異構(gòu)體，其中型和型在自然界中很少存在，而型是最常見的海藻糖。圖a.海藻糖的分子結(jié)構(gòu)（型）海藻糖無色無嗅，具很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、酸穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，對蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞膜等活體成分有很強(qiáng)的穩(wěn)定作用，在活體受到外界壓力（如干燥、凍結(jié)、滲透壓等）時有保護(hù)作用。1.2海藻糖的來源海藻糖廣泛存在于植物（藻類）、細(xì)菌、真菌、酵母和無脊椎動物體內(nèi)（昆蟲）。1.3海藻糖的工業(yè)應(yīng)用由于海藻糖具備穩(wěn)定的細(xì)胞膜和

2、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，海藻糖具有抗冷凍性、保濕性、耐高溫性、干燥抗性、非還原性等良好的加工特性，加之外源性的海藻糖具有良好的非特異性保護(hù)作用，因此廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、精細(xì)化工和化妝品等領(lǐng)域。海藻糖可作為冷凍食品的保護(hù)劑。使用淀粉的食品，易因淀粉的老化而變硬，出現(xiàn)松散、白濁等現(xiàn)象，工業(yè)上主要通過添加糖類抑制淀粉老化，而其中海藻糖防止淀粉老化的作用明顯優(yōu)于其他糖類。在有效的保護(hù)蛋白質(zhì)分子的天然結(jié)構(gòu)的同時，也保持了食品的質(zhì)地和風(fēng)味。目前已成功利用海藻糖干燥的食品有牛奶、咖啡、果汁、脫水蔬菜等。海藻糖甜度低，滲透壓與蔗糖相當(dāng)，具有抗齲齒功能，可在食品中代替蔗糖使用。作為保護(hù)牙齒食品的甜味劑廣泛應(yīng)用于各種糖果、

3、口香糖、糕點(diǎn)、飲料、冰淇淋、巧克力等。海藻糖具有保護(hù)生物分子的獨(dú)特功能，是生物分子的特效保護(hù)劑和組織細(xì)胞的穩(wěn)定劑，為醫(yī)用生物制品，如血液制品、酶、疫苗、病毒、激素、單克隆抗體、重組人體蛋白等的干燥保存、運(yùn)輸和使用帶來極大的方便。英國劍橋Quadsant公司和WHO進(jìn)行合作，利用海藻糖干燥脊髓灰質(zhì)炎疫苗，解決從生產(chǎn)地到第三世界一些國家的長途運(yùn)輸中的冷凍問題，統(tǒng)計(jì)僅此一項(xiàng)即可節(jié)省數(shù)百萬美元的冷凍系統(tǒng)費(fèi)用。海藻糖也可應(yīng)用于保健品產(chǎn)業(yè)。活菌制劑是當(dāng)今保健品的開發(fā)熱點(diǎn)，但活菌在人體腸道內(nèi)的存活率難以保證。如果能將海藻糖作為干燥保護(hù)劑，制成具有較高活力的菌粉，再用只能在腸道溶解的材料包裝，生產(chǎn)出口服腸溶膠

4、囊，將會大大提高活菌制劑的生物效價。糖脂是最重要的一類生物表面活性劑，海藻糖酯酶具有良好的表面活性性能，可用于石油的三次開采、日化、紡織等工業(yè)。另外海藻糖基本上不被牙齒所帶的微生物發(fā)酵，可作為保護(hù)性增香劑，其結(jié)晶形式可與粘結(jié)劑如羥乙基淀粉等一起用作糖衣材料。海藻糖具有保濕、防曬、防紫外線功效，所以可作為保濕劑、保護(hù)劑、紫外吸收劑等用于皮膚化妝品、洗面奶。還可作為甜味劑、改良劑用于唇膏、口腔清涼劑、口腔芳香劑等。1.4海藻糖的生產(chǎn)途徑 海藻糖生產(chǎn)方法主要有合成法、發(fā)酵法、提取法、酶轉(zhuǎn)化法以及基因工程法。海藻糖的化學(xué)合成法是在2,3,4,6-四乙?；咸烟呛?,4,6-三乙酰-1,2-脫水-D-葡

5、萄糖之間產(chǎn)生環(huán)氧乙烷加成生成。發(fā)酵法主要步驟是通過采用誘變、細(xì)胞融合或基因重組等方法培育出高產(chǎn)海藻糖的菌株，采用優(yōu)化培養(yǎng)基和適宜的條件發(fā)酵，再采用有效分離提取技術(shù)對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行精制。目前可利用的微生物主要包括酵母、革蘭氏陽性菌，特別是微球菌屬。提取法主要是指微生物提取法，也可從植物中提取，但該方法成本太高，產(chǎn)率太低未見工業(yè)化應(yīng)用。微生物提取法是以酵母、乳酸菌、霉菌及其它含海藻糖的微生物為提取源通過發(fā)酵優(yōu)化等提取出海藻糖，以酵母為主。早期商品化的海藻糖是從酵母中提取的，該方法主要是培養(yǎng)酵母菌株到對數(shù)生長期，然后通過對培養(yǎng)條件的控制，使酵母細(xì)胞處于脅迫環(huán)境中(如營養(yǎng)饑餓、高溫、高滲透壓、干燥和冷凍

6、等)，造成酵母菌體內(nèi)海藻糖的含量顯著增加，可達(dá)細(xì)胞十重的20，然后利用乙醇等有機(jī)溶劑從酵母菌中抽提純化海藻糖。2000年，南寧中諾生物工程有限責(zé)任公司利用此酶系成功開發(fā)出酶法轉(zhuǎn)化木薯淀粉生產(chǎn)海藻糖的工藝，使我國成為世界上第2個酶法工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖的國家。短鏈糊精該工藝?yán)枚替満?jīng)MTSase和MTHase作用轉(zhuǎn)化生產(chǎn)海藻糖。2002年，我國結(jié)晶海藻糖產(chǎn)量達(dá)到200 t，價格為79元kg，海藻糖在我國也開始應(yīng)用于食品加工行業(yè)。各種方法特點(diǎn)比較見表。表1.海藻糖生產(chǎn)方法的比較方法應(yīng)用實(shí)例特點(diǎn)合成法至今未實(shí)用化產(chǎn)率低、分離困難微生物發(fā)酵提取法日本味之素株式會社利用氨基酸生產(chǎn)菌已實(shí)現(xiàn)海藻糖工業(yè)化生

7、產(chǎn)提取效率低，成本過高酶轉(zhuǎn)化法磷酸化酶法1998年日本有過商業(yè)化報(bào)道需消耗高能物質(zhì)且磷酸化酶不穩(wěn)定雙酶法1994年日本林原生化研究所（轉(zhuǎn)化率可達(dá)80%）以直鏈淀粉為底物轉(zhuǎn)化率高合成酶法1995年發(fā)明，是目前研究熱點(diǎn)之一底物為麥芽糖反應(yīng)時間過長，反應(yīng)溫度低基因工程法轉(zhuǎn)基因植物法把合成海藻糖的基因引入果蔬植物中，使海藻糖在作物中自行積累含量低成本高基因工程菌將酶基因轉(zhuǎn)入微生物宿主中高效表達(dá)并合成海藻糖，或構(gòu)建基因工程菌高效表達(dá)海藻糖合成相關(guān)的酶，在體外將底物轉(zhuǎn)化為海藻糖成本低高效合成法和提取法產(chǎn)率過低，且成本較高，無法進(jìn)行工業(yè)化應(yīng)用；而磷酸化酶法需消耗高能物質(zhì)，加之磷酸化酶本身不穩(wěn)定也不適用于工業(yè)

8、生產(chǎn)。目前應(yīng)用較多的是海藻糖合成酶一步反應(yīng)法和雙酶法。海藻糖合成酶法以麥芽糖為直接底物，工藝簡單，轉(zhuǎn)化率高，但反應(yīng)時間過長，反應(yīng)溫度低（一般為20-30）。而雙酶法以直鏈淀粉為底物，通過兩種酶的反復(fù)反應(yīng)最終形成海藻糖。工業(yè)上常用脫支酶進(jìn)行淀粉初步水解為雙酶法提供底物?，F(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)中也常常使用基因工程法（特別是構(gòu)建基因工程菌）與酶轉(zhuǎn)化法結(jié)合。綜合以上方法的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選用基因工程菌與雙酶法結(jié)合的方法2研究內(nèi)容構(gòu)建基因工程菌高效表達(dá)海藻糖合成相關(guān)的兩種酶麥芽寡糖基海藻糖合成酶(Mahooligosyl trehalose synthase，MTSage，EC549915)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(

9、Malt001igosyl trehalose trehalohyrolase，MTHase，EC321141)，其中MTSase作用于底物還原性末端產(chǎn)生,1，4糖苷鍵到-1，1糖苷鍵的分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基作用，形成中間產(chǎn)物麥芽寡糖基海藻糖；MTHase則專一地內(nèi)切該中間產(chǎn)物中麥芽寡糖基與海藻糖相連的-1，4糖苷鍵，使之分解產(chǎn)生海藻糖和減少2個葡萄糖單位的新麥芽寡糖如此反復(fù)交替進(jìn)行2種酶反應(yīng)就可以將麥芽寡糖或直鏈淀粉轉(zhuǎn)化成主要為海藻糖，以及少量葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖的產(chǎn)物。而配合脫支酶基因工程菌，三種酶共同作用可將可溶性淀粉最終轉(zhuǎn)化為海藻糖。實(shí)驗(yàn)選取pHY300-PLK穿梭質(zhì)粒為載體，先進(jìn)行誘導(dǎo)型啟動子的克隆，然后進(jìn)行報(bào)告基因的克?。╔1，Y1，Z1），三種基因功能見下表；轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，最終得到所需的海藻糖。表2.三種報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物基因表達(dá)產(chǎn)物X1GlgXY1MTSaseZ1MTHase3實(shí)驗(yàn)進(jìn)展3.1誘導(dǎo)型啟動子的克隆3.