實驗二 植物基因組DNA的提取筆記

1、實驗二 植物基因組DNA的提取Tris 讀音 “吹斯”脫氧核糖核酸酶DNase是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶DNase I活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。鎂離子存在條件下，DNase I可隨機剪切雙鏈DNA的任意位點；二價錳離子存在條件下，DNase I可在同一位點剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個核苷酸突出的粘末端。苯酚在空氣中經(jīng)常被氧化生成醌，它能夠產(chǎn)生自由基，直接用于DNA分離，會使磷酸二酯鍵斷裂， 造成DNA降解。苯酚使蛋白變性，離心時沉淀下來，而DNA溶解在溶液中。 在提取DNA時用的原料成分的關系,很多植物源

2、提取材料里面含有酚類物質,酚類物質是芳族環(huán)上的氫原子被羥基或功能衍生物取代后生成的化合物.酚類物質如果經(jīng)氧化后就會很容易于DNA共價結合引起褐變.這就是褐變現(xiàn)象,為有效除去酚類物質，需要在研磨時加入抗氧化的PVP，用PVP是利用它的“CO-N=”基有很強的結合多酚化合物的能力，其結合能力隨多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而加強，結合成復合物后,通過離心除去。另外，在加入提取液時，加入B-巰基乙醇可使多酚氧化酶失活，防止酚類物質被氧化，主要是“-SH基”可以打斷多酚氧化物酶的二硫鍵而使之失活，防止酚類化合物被氧化。 巰基乙醇加入的目的是提供一種還原劑，這樣酚類物質就不能被氧化成醌，從而影響你提DN

3、A的實驗。巰基乙醇兼有這兩方面功能，消泡和保護DNA。特別是樣品中酚類物質較多的時候，可以適當增加巰基乙醇的量，DNA提取的成功率更高。巰基乙醇有消泡的作用。不然你加了CTAB在震蕩過程中會出現(xiàn)大量氣泡，影響后續(xù)操作。不是用來防止DNA氧化的。 PVP粉才是用來防止氧化的。還原劑，防止酚的氧化。很重要。如果不加提出的核酸會呈現(xiàn)灰黑色。 異戊醇的作用是消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。 我們實驗室是滅菌后加PVP和巰基乙醇,每次用前65度水浴。加CTAB時應在通風櫥中進行。RNase是一種核糖核酸內(nèi)切酶，即RNA（水解酶）它能夠特異性地水解雜交到DNA鏈上的RNA磷酸二酯鍵，故能分解RNA/DNA雜交體

4、系中的RNA鏈。該酶不能消化單鏈或雙鏈DNA。RNase A 對RNA有水解作用，但對DNA則不起作用?？梢杂脕砣コ鼶NA制品中的污染RNA。DNA/Hind Marker是由DNA經(jīng)Hind 完全酶切并經(jīng)滅活處理而成，共有8條DNA片段，已加入上樣緩沖液，可直接電泳，每次上樣5l，濃度為0.1g/l。bp)：125、564、2027、2322、4361、6557、9416、23130儲存：-20可保存一年以上，4可保存2-3個月。 目錄號 包裝 價格 MD202-50 50T 90.00 MD202-100 100T 150.00Tris飽和酚 瓶/250ml PVP(聚乙烯吡咯烷酮)：加入

5、PVP的目的是使PVP吸附酚類物質，這樣就可減輕酚類物質對你所提DNA的影響。PVP是酚的絡合物，能與多酚形成一種不溶的絡合物質，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結合，有效去除多糖。PVP為一種水溶性高分子聚合物,化學名稱為聚乙烯吡咯烷酮，是一種有機物。個人認為不適合提前加入和CTAB提取液一起高壓滅菌。我們實驗室是滅菌后加PVP和巰基乙醇,每次用前65度水浴。加CTAB時應在通風櫥中進行。聚乙烯吡咯烷酮 PVP-40 Sigma-Vetec原裝 V900008-100g 。“植物材料中,特別是老的或是經(jīng)逆境處理的材料,含有大量的酚類化合物,這些酚類化合物氧化后易與DNA共

6、價結合,使DNA帶棕色或褐色,并能抑制DNA的酶解反應.為防止這類情況出現(xiàn),可以向提取緩沖液中加入2%(W/V)的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或增加抽提緩沖液中的巰基乙醇的濃度”，“在植物總DNA提取過程中加入PVP ，可以防止植物細胞中的多酚類物質氧化”DNA的存在形式分兩個方面： 如果在體外（如提取出來的），存在狀態(tài)多樣，可以是鏈狀（動植物基因組DNA），可以是環(huán)狀（質粒DNA），可以是單獨存在也可以結合其他物質存在，可以單鏈存在也可以雙鏈存在，可以有序存在也可以雜亂存在，等等啦。如果是在體內(nèi)，真核生物。原核生物還有病毒又不一樣，真核生物基因組DNA是經(jīng)過四級包裝形成了染色體，先是DNA形成雙

7、螺旋結構，再與組蛋白形成核小體（一級結構），壓縮7倍，再形成螺旋管（二級結構），壓縮6倍，之后再形成超螺旋管（三級結構），壓縮40倍，最后超螺旋管壓縮形成染色體（四級結構），再壓縮5倍，正常細胞中基因組DNA是以染色質（相當于一級結構）形式存在，在細胞分裂的中期以染色體形式存在，真核生物細胞質DNA主要是以裸露的環(huán)狀DNA形式存在，沒有核小體結構。原核生物擬核區(qū)基因組DNA大多是環(huán)狀裸露DNA，呈彌散狀分布，而細胞質中的質粒DNA也是環(huán)狀，裸露，多呈超螺旋。病毒基因組比較多樣化，可以是DNA，也可以是RNA，可以是環(huán)狀，也可以是鏈狀，可以是一條，也可以是多條，但都是裸露的，沒有類似于核小體的結

8、構。CTAB法提取DNA的原理及步驟： 冷凍的植物組織，在低溫干燥狀態(tài)下機械磨碎。通常精提DNA，都要加液氮使材料變脆，易于研磨。低溫降低了DNase的活性，利用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）去污劑溶解細胞膜，使核蛋白等解聚，使DNA游離出來。 CTAB作為一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，與核酸形成復合物，可使核酸沉淀出來。通過離心將CTAB-核酸復合物語糖類、蛋白質等分離開來。隨后將復合物溶于高鹽溶液中，再加乙醇使核酸沉淀，而CTAB溶于乙醇，從而去除CTAB 。 =1.異丙醇和乙醇沉淀質粒的區(qū)別：異丙醇和酒精都是有機溶劑，一般來講，提取質粒的時候一開始都要用異丙醇沉淀，因為異丙醇沉淀的效

9、果要好一些，但最后大多用酒精沉淀，因為酒精容易揮發(fā)，對下游的實驗影響小。異丙醇比較疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是去鹽，它比異丙醇更親水，所以能去掉一些鹽離子。 有時還用70%的乙醇洗樣品也是為了增加鹽的溶解度。在沉淀核酸時可用乙醇與異丙醇，乙醇的極性要強于異丙醇，所以一般用2倍體積乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高時，用異丙醇沉淀可部分克服這種污染，尤其用異丙醇在室溫下沉淀對擺脫多糖、雜蛋白污染更為有效。異丙醇沉淀核酸時，高濃度鹽存在將使大量多糖存在在溶液中，從而可達到去多糖的作用。但高濃度的鹽存在會影響核酸的進一步操作，因此必須用乙醇多次洗滌脫鹽。異丙醇：優(yōu)點為所需容積小且速度快，適用

10、于濃度低，而體積大DNA樣品的沉淀。0.541.0倍體積的異丙醇可選擇性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；但對5sRNA、tRNA和多糖產(chǎn)物不產(chǎn)生沉淀，一般不需要在低溫條件下長時間放置。缺點：易使鹽類（如NaCl、蔗糖）與DNA共沉淀；在DNA沉淀中異丙醇難以揮發(fā)除去，所以常規(guī)需要用70的乙醇漂洗DNA沉淀數(shù)次。乙醇：沉淀DNA乙醇是首選的有機溶劑，對鹽類沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸發(fā)去處，不影響以后的實驗。在適當?shù)柠}濃度下，2倍樣品容積的95乙醇可有效沉淀DNA，對于RNA則需要將乙醇量增加至2.5倍。缺點是總體積較大。需在-20放置很長時間，30分鐘-1小時。同樣需要70%乙

11、醇洗滌。2.一般用的是酚：氯仿：異丙醇為25：24：1（v/v）其中酚是強烈的蛋白質變性劑，能有效使蛋白質變性而除去，氯仿有強烈的脂溶性，去除脂類雜質，本身酚：氯仿：異戊醇=25：24：1的主要作用是抽提蛋白質。步驟：質粒用等體積的酚/氯仿/異丙醇抽提一次，重復此步驟，加入兩倍體積的無水乙醇和1/10體積的3 mol/L乙酸鈉溶液后混勻，零下20攝氏度沉淀30 min后12000 r/min離心10 min，沉淀用75%乙醇洗滌一次，12000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀自然干燥后溶于2040微升去離子水中或者0.5 mol/L pH8.0的TE中。3.用酚抽提細胞DNA時，有什么

12、作用？使蛋白質變性，同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與DNA 聯(lián)結鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的優(yōu)點：1. 有效變性蛋白質；2. 抑制了DNase的降解作用。缺點：1. 能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly（A）RNA。2. 不能完全抑制RNase的活性。氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺點；加速有機相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中）用酚氯仿抽提細胞基因組DNA時，通常要在酚-氯仿中加少許異戊醇，為什么？異戊醇：減少蛋白質變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以

13、降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。為什么用無水乙醇沉淀DNA？ 用無水乙醇沉淀DNA，這是實驗中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學反應，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。 DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67左右。因而也可改用95乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95乙醇昂貴）。但是加95的乙醇使總體

14、積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95乙醇代替無水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置1530分鐘即可。用乙醇沉淀DNA時，為什么加入單價的陽離子？用乙醇沉淀DNA時，通常要在溶液中加入單價的陽離子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。CTAB法提取植物基因組DNA原理這種方法是由Murray 和Thompson（1980）修改而成的簡便方法。CTAB(十六烷基

15、三乙基溴化銨)是一種去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，當降低溶液鹽濃度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）時，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB-核酸的復合物與蛋白，多糖類物質分開。 最后通過乙醇或異丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或異丙醇而除去。DNA提取常見問題DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質。DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應，DNA中殘留有金屬離子，有RNA的存留。對策：重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質，重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)，增加70%乙醇洗滌的次數(shù)(2-3次)，加入RNase

16、降解RNA。（1）DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應。DNA提取常見問題：材料不新鮮或反復凍融、未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性、提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷，外源核酸酶污染反復凍融。盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復凍融，液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍前加入裂解緩沖液。在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量，細胞裂解后的后續(xù)操作應盡量輕柔。所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌。將DNA分裝保存于緩沖液中,避免反復凍融。（2）DNA降解，DNA提取常見問題。實驗材料不佳或量少，破壁或裂解不充分，吸附或沉淀不完全，洗滌時DNA丟失。盡量選用新鮮(幼嫩)的

17、材料，動植物要勻漿研磨充分；G+菌，酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁。高溫裂解時，時間適當延長(對于動物細胞,細菌可增加PK的用量)。增加吸附的時間、或低溫沉淀小心操作。要用冰凍材料提出高質量的基因組DNA，應確保以下幾點：1.確保采樣后立即投入液氮中保存.2.在磨樣時一定要一直使材料處于低溫狀態(tài)。研磨前先將液氮倒入研缽，研缽徹底冷卻后，再放入材料，研磨過程中，一定不要讓液氮揮發(fā)凈使材料回溫！否則會DNA降解得很厲害。裝管的時候，材料一定要有液氮的保護才行！否則研磨時的液氮保護DNA不都前功盡棄了？可以這樣做：將幾個離心管放入一個容器，向容器中加液氮，將其冷凍一下，使之處于低溫狀態(tài)，將液氮還

18、為揮發(fā)干凈的材料放入管內(nèi)，不要急著蓋蓋子，因為液氮不揮發(fā)干凈就蓋上會再次彈開。將離心管放入盛有液氮的容器，等管內(nèi)的液氮揮發(fā)干凈蓋上蓋子即可。另外，如果是在離心管上編號，最好在冷凍前寫好，否則離心管冷凍后材料會受影響不說，也很難寫上。提取DNA時加液氮的目的主要是防止DNA的降解，所以必須一直提醒自己，減少材料回溫的機會，液氮保護必須自始至終。3.在用CTAB法提取時，剛投入水浴時可以稍快速的晃動，之后的晃動一定要輕柔！4.加酚/氯仿/異戊醇靜置30min后，離心溫度不可過低。盡量保持在15度以上。5.將DNA加入異丙醇析出時用的槍頭一定要剪過的。這點很重要。過尖的槍頭會把DNA鏈弄斷。6.加入

19、異丙醇后出現(xiàn)的DNA絮狀物盡量要挑出，盡量不要離心，因為離心后雖然產(chǎn)量會增大，但是不完整的DNA也增多了。另外，看樓主的電泳圖條帶比較弱，看來不只是降解，提取量也比較少。這里對于增加提取量想說明一點，在研磨樣品時，研得細和研得很細，提出的DNA量可以相差幾倍！所以，在液氮保護的很好的情況下多研磨幾次，要比在后面的過程中離心以增加產(chǎn)量要劃得來！酚：氯仿：異戊醇25：24：1產(chǎn)品簡介：本試劑是由Tris飽和酚、氯仿和異戊醇按25:24:1的體積比混合而成的，主要用于基因組DNA的提取等試驗。注意事項：本試劑有較強的腐蝕性，應盡量避免皮膚接觸或吸入體內(nèi)。如發(fā)現(xiàn)變?yōu)榧t色或棕色，表明已發(fā)生氧化，不能繼續(xù)

20、使用。本試劑分為兩層，上層為保護水相，下層為酚氯仿異戊醇。保存要求：4，避光保存，有效期12個月。1.酚的作用：（1）有效變性蛋白質；（2）抑制了DNase的降解作用。2.氯仿的作用：加速有機相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中）3.異戊醇的作用：減少蛋白質變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定酚抽提后應用氯仿：異戊醇再作用一次，使上清液中的酚去除干凈，以免酚影響后面操作的酶的活性裂解后，直接加入異丙醇，上下顛倒晃動，若看到沉淀多了，就直

21、接挑出來；少了，離心10/15min，然后倒掉上清、晾干。CTAB法提取DNA，CTAB為什么要預熱？1、 CTAB溶液在低于15 時會形成沉淀析出,因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預熱,且離心時溫度不要低于15。2、 促進CTAB更好的溶解，以提高其釋放植物組織中DNA的效率，先達到了反應溫度，這樣實際作用時間要比不預熱短一些。液氮的作用？-1961.低溫導致植物組織凍裂，方便研磨使細胞破碎，使DNA釋放完全 2.低溫情況下各酶處于低活性狀態(tài)，有利于抑制DNAase的作用，保護DNA提取DNA時苯酚，氯仿，異戊醇（25：24：1）的作用 抽提DNA去除蛋白質時，怎樣使用酚與氯仿較好？酚與

22、氯仿是非極性分子，水是極性分子，當?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時，蛋白質分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層。作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約1015的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互

23、溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用。 為什么用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊酵？在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。Tris飽和酚的作用？Tris飽和酚一般PH大

24、于7.8，用于DNA的提取。其中，酚是強的蛋白變性劑，可以使細胞或組織中的蛋白質變性析出。 而Tris的主要作用是防治止酚類氧化，若酚類氧化，則會形成醌（兩個苯環(huán)），醌含有強自由基，會破壞核酸結構。 同時，由于PH值大于7，在堿性環(huán)境中DNA處于水相，RNA處于有機相。從而分離上清，即可得到DNA。異丙醇沉淀DNA乙醇應該是用來洗脫有機溶劑如(異丙醇)的,你說的乙醇應該是無水乙醇吧,原因可能是:你的DNA提的量太少,或是離心時間不夠,應該和所用試劑沒什么關系。 用-20度預冷異丙醇沉淀效果較等體積乙醇沉淀好；異丙醇約和2.5倍體積的乙醇效果相當；但DNA微溶于乙醇，使用乙醇沉淀會使部分DNA溶

25、解損失；所以多選用-20度預冷異丙醇。一般6500倍到8000倍重力10分鐘就可以將異丙醇沉淀的核酸緊密的離到管底。DNA在異丙醇的溶解度更低，所以用異丙醇來沉淀更完全，而后由于異丙醇不易揮發(fā)，所以用乙醇洗去異丙醇，乙醇揮發(fā)快。 用TE緩沖液保存DNA的目的？一般長期保存DNA，貯存在TE緩沖液中比較好。 TE為含EDTA的Tris-HCl(PH 8.0)緩沖液：其中比較關鍵的成分是EDTA，日常環(huán)境中不可避免的存在DNase，而DNase的活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。鎂離子存在條件下，DNase I可隨機剪切雙鏈DNA的任意位點；二價錳離子存在條件下，DNase I可在同一位點剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個核苷酸突出的粘末端。TE中含有的EDTA可以螯合金屬離子，從而使DNase失活。而Tris-HCl的作用主要是維持一定堿性PH值，有助于DNA的溶解和穩(wěn)定。 不加EDTA也是可以的，而且EDTA會影響下游酶切，連接反應以及質粒轉染進細胞的效率，如果接下來要做這些實驗是應該避免使用含EDTA的緩沖液的。短期儲存DNA也可以使用ddH2O，有助于DNA連接等效果Tris飽和酚一般PH大于7.8，用于DNA的提取。其中，酚是強的蛋白變性劑，可以使細胞或組