實(shí)驗(yàn)八、培養(yǎng)基配制與滅菌ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)八、培養(yǎng)基的配制與滅菌實(shí)驗(yàn)八、培養(yǎng)基的配制與滅菌 目目 的的 要要 求求 了解培養(yǎng)基的配制原理和方法，掌握其了解培養(yǎng)基的配制原理和方法，掌握其配制過(guò)程。配制過(guò)程。 了解幾種滅菌方法，掌握干熱滅菌法和了解幾種滅菌方法，掌握干熱滅菌法和加壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。加壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。 熟悉分離、培養(yǎng)微生物前的有關(guān)準(zhǔn)備工熟悉分離、培養(yǎng)微生物前的有關(guān)準(zhǔn)備工作及操作方法。作及操作方法。實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 材材 料料 藥品：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、馬鈴薯、蔗糖；藥品：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、馬鈴薯、蔗糖；可溶性淀粉、可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO47H2O、FeS

2、O47H2O等。等。 高壓蒸汽滅菌器、恒溫干熱滅菌箱、細(xì)菌過(guò)濾器、紫外線高壓蒸汽滅菌器、恒溫干熱滅菌箱、細(xì)菌過(guò)濾器、紫外線殺菌燈。殺菌燈。 其它：天平、牛角匙、電爐、其它：天平、牛角匙、電爐、1N HCl、1N NaOH、pH試紙、試紙、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、帶玻璃珠的三刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、帶玻璃珠的三角瓶、帶棉塞的無(wú)菌試管、無(wú)棉塞的空試管、培養(yǎng)皿、吸角瓶、帶棉塞的無(wú)菌試管、無(wú)棉塞的空試管、培養(yǎng)皿、吸管、各種包裝紙、防水紙、繩索、棉花、標(biāo)簽等。管、各種包裝紙、防水紙、繩索、棉花、標(biāo)簽等。方法與步驟方法與步驟 培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制 分離培養(yǎng)微生物常用器皿的準(zhǔn)

3、備分離培養(yǎng)微生物常用器皿的準(zhǔn)備 培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法培養(yǎng)基的配制方法和步驟培養(yǎng)基的配制方法和步驟 稱量：按照配方正確稱取各種原料放于搪瓷杯中。稱量：按照配方正確稱取各種原料放于搪瓷杯中。 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒攪勻，加熱溶解。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒攪勻，加熱溶解。 調(diào)調(diào)pH值：用值：用1N NaOH或或1N HCl調(diào)調(diào)pH，用，用pH試紙對(duì)照。試紙對(duì)照。 加瓊脂溶化：加熱過(guò)程中要不斷攪拌，可適當(dāng)補(bǔ)水。加瓊脂溶化：加熱過(guò)程中要不斷攪拌，可適當(dāng)補(bǔ)水。 分裝：注意不要污染棉塞。分裝：注意不要污染棉塞。 包扎成捆，掛上標(biāo)簽必須用鉛筆寫(xiě)），注明何種

4、培養(yǎng)基。包扎成捆，掛上標(biāo)簽必須用鉛筆寫(xiě)），注明何種培養(yǎng)基。 滅菌備用：培養(yǎng)基滅菌后必須在滅菌備用：培養(yǎng)基滅菌后必須在370C下恒溫培養(yǎng)下恒溫培養(yǎng)24h，確定無(wú)，確定無(wú)菌生長(zhǎng)，方可使用。菌生長(zhǎng)，方可使用。方法與步驟方法與步驟 （培養(yǎng)基的配制方法和步（培養(yǎng)基的配制方法和步驟）驟）方法與步驟方法與步驟 （培養(yǎng)基的配制方法和步（培養(yǎng)基的配制方法和步驟）驟）方法與步驟方法與步驟 （幾種培養(yǎng)基的配方及配（幾種培養(yǎng)基的配方及配制）制） 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基用于分離和培養(yǎng)細(xì)牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基用于分離和培養(yǎng)細(xì)菌，是一種天然培養(yǎng)基配方如下：菌，是一種天然培養(yǎng)基配方如下： 牛肉膏牛肉膏 3g 蛋白胨蛋白胨 1

5、0g 氯化鈉氯化鈉 5g 瓊脂瓊脂 20g 自來(lái)水自來(lái)水 1000mL pH 7.27.4 滅菌滅菌 1.05kg/cm2，20min 淀粉瓊脂培養(yǎng)基高氏一號(hào)淀粉瓊脂培養(yǎng)基高氏一號(hào)Gause1），用于分離），用于分離和培養(yǎng)放線菌，是一種合成培養(yǎng)基。配方如下：和培養(yǎng)放線菌，是一種合成培養(yǎng)基。配方如下： 可溶性淀粉可溶性淀粉 20.0g KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4 7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4 7H2O 0.01g 瓊脂瓊脂 20g 自來(lái)水自來(lái)水 1000mL 滅菌：滅菌： 1.05kg/cm2 30min 馬鈴薯或豆芽汁蔗糖或葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基馬鈴

6、薯或豆芽汁蔗糖或葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于分離和培養(yǎng)真菌之用，是一種半合成培養(yǎng)基），用于分離和培養(yǎng)真菌之用，是一種半合成培養(yǎng)基），其配方如下：其配方如下： 去皮馬鈴薯或鮮豆芽）去皮馬鈴薯或鮮豆芽） 200g 蔗糖或葡萄糖）蔗糖或葡萄糖） 20g 自來(lái)水自來(lái)水 1000mL 瓊脂瓊脂 20g pH 自然自然 滅菌：（含蔗糖滅菌：（含蔗糖1.05kg/cm2 20min （含葡萄糖（含葡萄糖0.1kg/cm2 30minYPD培養(yǎng)基分離培養(yǎng)酵母菌）培養(yǎng)基分離培養(yǎng)酵母菌） YPD 或YPED，：Yeast Extract Peptone Dextrose Medium(1L)，酵母膏蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基：

7、配方：1% Yeast Extract酵母膏） ，2% Peptone蛋白胨） ，2% Dextrose (glucose)（葡萄糖），若制固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉。 無(wú)菌水的制備無(wú)菌水的制備 無(wú)菌水為下一次微生物無(wú)菌水為下一次微生物分離實(shí)驗(yàn)中所需要的材料。分離實(shí)驗(yàn)中所需要的材料。 100mL三角燒瓶裝有玻璃珠），裝自三角燒瓶裝有玻璃珠），裝自來(lái)水來(lái)水99.0mL，試管中裝，試管中裝4.5mL自來(lái)水，自來(lái)水，塞上棉塞，包扎、滅菌備用。三角燒瓶塞上棉塞，包扎、滅菌備用。三角燒瓶和試管須預(yù)先塞好棉塞，并滅菌。和試管須預(yù)先塞好棉塞，并滅菌。方法與步驟方法與步驟 （分離培養(yǎng)微生物常用器（分離培養(yǎng)微生

8、物常用器皿的準(zhǔn)備）皿的準(zhǔn)備） 清洗一些玻璃儀器：如三角燒瓶、試管、培養(yǎng)皿、吸管等。清洗一些玻璃儀器：如三角燒瓶、試管、培養(yǎng)皿、吸管等。 棉塞的制作棉塞的制作 包裝培養(yǎng)皿和吸管等。包裝培養(yǎng)皿和吸管等。 四、本卷須知稱藥品用的牛角匙不要混用；稱完藥品應(yīng)及時(shí)蓋緊瓶蓋。調(diào)pH時(shí)要小心操作，避免回調(diào)，不同培養(yǎng)基各有配制特點(diǎn)，要注意具體操作。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄本實(shí)驗(yàn)配制培養(yǎng)第的名稱、數(shù)量，并圖解說(shuō)明其配制過(guò)程，指明要點(diǎn)。思考題思考題 固體培養(yǎng)基加瓊脂后加熱溶化時(shí)要注意哪些問(wèn)題？ 配制培養(yǎng)基有哪幾個(gè)步驟?在操作過(guò)程中應(yīng)注意些什么問(wèn)題?為什么? 培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?若不能及時(shí)滅菌應(yīng)如何處理？已

9、滅菌的培養(yǎng)基進(jìn)行無(wú)菌檢查？ 采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外所有的微生物永遠(yuǎn)喪失其生長(zhǎng)繁殖能力的措施稱之為滅菌。滅菌是要進(jìn)行微生物純培養(yǎng)的需要。 實(shí)驗(yàn)室最常用的滅菌方法是利用高溫處理達(dá)到殺菌效果。高溫主要是使微生物的蛋白質(zhì)和核酸等重要生物大分子發(fā)生變性。高溫滅菌分為干熱滅菌和濕熱滅菌兩大類。濕熱滅菌的效果比優(yōu)于干熱滅菌。濕熱下熱量易于傳遞，更容易破壞保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的氫鍵等結(jié)構(gòu)，加速其變性。此外，過(guò)濾除菌、射線滅菌和消毒、化學(xué)藥物滅菌和消毒等也是微生物學(xué)操作中不可缺少的常用方法。消毒和滅菌消毒和滅菌 三、操作步驟()高壓蒸汽滅菌法高壓蒸汽滅菌法適用于培養(yǎng)基、無(wú)菌水、工作服等物品的滅菌。1加水

10、將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，以水面與三角架相平為至。2裝料 將裝料桶放回鍋內(nèi)，裝入待滅菌的物品。裝有培養(yǎng)基的容器放置時(shí)要防止液體溢出，瓶塞不要緊貼桶壁，以防冷凝水沾濕棉塞。3加蓋 將蓋上與排氣孔相連接的排氣軟管插人內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)，擺正鍋蓋，對(duì)齊螺口，然后以同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓的方式擰緊所有螺栓，并打開(kāi)排氣閥；4排氣 加熱待水煮沸后，水蒸汽和空氣一起從排氣孔排出。一般認(rèn)為，當(dāng)水沸后約5min，表明鍋內(nèi)空氣已排凈。5升壓 當(dāng)鍋內(nèi)空氣排凈時(shí)，即可關(guān)閉排氣閥，壓力開(kāi)始上升。6保壓保壓 當(dāng)壓力表指針達(dá)到所需壓力刻度時(shí)，當(dāng)壓力表指針達(dá)到所需壓力刻度時(shí)，控制熱源。開(kāi)始計(jì)時(shí)并維持壓力至

11、所需時(shí)控制熱源。開(kāi)始計(jì)時(shí)并維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用間。本實(shí)驗(yàn)用121，20min滅菌。滅菌。7降壓降壓 達(dá)到所需滅菌時(shí)間后，關(guān)閉熱源，達(dá)到所需滅菌時(shí)間后，關(guān)閉熱源，讓壓力自然下降到零后，打開(kāi)排氣閥。放讓壓力自然下降到零后，打開(kāi)排氣閥。放凈余下的蒸汽后，再打開(kāi)鍋蓋，取出滅菌凈余下的蒸汽后，再打開(kāi)鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內(nèi)剩水。物品，倒掉鍋內(nèi)剩水。8無(wú)菌檢查無(wú)菌檢查 將已滅菌培養(yǎng)基于將已滅菌培養(yǎng)基于37培養(yǎng)培養(yǎng)24h，無(wú)雜菌生長(zhǎng)，即可待用。無(wú)雜菌生長(zhǎng)，即可待用。(二)干熱滅菌法干熱滅菌法適用于玻璃器皿，如試管、培養(yǎng)皿、三角瓶、移液管等的滅菌；1 裝入待滅菌物品 預(yù)先將各種器皿用紙包好或裝入金

12、屬制的培養(yǎng)皿筒、移液管筒內(nèi)，然后放人電熱烘箱中。2升溫 關(guān)好電烘箱門(mén)，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，旋動(dòng)恒溫調(diào)節(jié)器至所需溫度刻度(本實(shí)驗(yàn)所需為160170)，此時(shí)烘箱紅燈亮，表明烘箱已開(kāi)始加熱，當(dāng)溫度上升至所設(shè)定溫度后則烘箱綠燈亮，表示已停止加溫。3恒溫恒溫 當(dāng)溫度升到所需溫度后，維持此當(dāng)溫度升到所需溫度后，維持此溫度溫度2h。4降溫降溫 切斷電源，自然降溫。切斷電源，自然降溫。5.取出滅菌物品取出滅菌物品 待電烘箱內(nèi)溫度降到待電烘箱內(nèi)溫度降到70以下后，才能打開(kāi)箱門(mén)，取出滅菌物品。以下后，才能打開(kāi)箱門(mén)，取出滅菌物品。(三)過(guò)濾除菌法有些物質(zhì)，如抗生素、血清、維生素等易受熱分解，因而要采用過(guò)濾除菌法。1過(guò)濾器

13、的種類(1)濾膜過(guò)濾器：由醋酸纖維素、硝酸纖維素等制成，有孔徑大小不同的多種規(guī)格(如0.1m、0. 22m、0.3m、0. 45m等)，過(guò)濾細(xì)菌常用0.45m孔徑。其優(yōu)點(diǎn)是吸附性小，即溶液中的物質(zhì)損耗少，濾速快，每張濾膜只使用1次，不用清洗。 (2)蔡氏濾器：是一種金屬制成的過(guò)濾漏斗，蔡氏濾器：是一種金屬制成的過(guò)濾漏斗，其過(guò)濾部分是一種用石棉纖維和其他填充其過(guò)濾部分是一種用石棉纖維和其他填充物壓制成的片狀結(jié)構(gòu)。溶液中的細(xì)菌通過(guò)物壓制成的片狀結(jié)構(gòu)。溶液中的細(xì)菌通過(guò)石棉纖維的吸附和過(guò)濾而被去除，但對(duì)溶石棉纖維的吸附和過(guò)濾而被去除，但對(duì)溶液中其他物質(zhì)的吸附性也大。每張纖維板液中其他物質(zhì)的吸附性也大。

14、每張纖維板只能使用只能使用1次。次。(3)玻璃濾器：是一種由玻璃制成的過(guò)濾漏斗，玻璃濾器：是一種由玻璃制成的過(guò)濾漏斗，其過(guò)濾部分是由細(xì)玻璃粉燒結(jié)成的板狀構(gòu)其過(guò)濾部分是由細(xì)玻璃粉燒結(jié)成的板狀構(gòu)造。玻璃濾器規(guī)格很多，造。玻璃濾器規(guī)格很多，5號(hào)號(hào)(孔徑孔徑25m)和和6號(hào)號(hào)(孔徑小于孔徑小于2m)適用于過(guò)濾細(xì)菌。其適用于過(guò)濾細(xì)菌。其優(yōu)點(diǎn)是吸附量少，但每次使用后要洗凈再優(yōu)點(diǎn)是吸附量少，但每次使用后要洗凈再用。清洗方法是：用水充分沖洗，然后浸用。清洗方法是：用水充分沖洗，然后浸于含于含1KNO3的濃硫酸中的濃硫酸中24h，再用蒸餾水，再用蒸餾水抽洗數(shù)次。在抽洗液中加人數(shù)滴抽洗數(shù)次。在抽洗液中加人數(shù)滴Ba

15、Cl2，至，至不出現(xiàn)不出現(xiàn)BaSO4沉淀時(shí)，即表示已洗凈。沉淀時(shí)，即表示已洗凈。 2過(guò)濾裝置（1按圖4-4進(jìn)行安裝，為阻止空氣中細(xì)菌進(jìn)人濾瓶而在接管處塞入棉花、外用紙包好進(jìn)行121濕熱滅菌20min。(2)為加快過(guò)濾速度，一般用負(fù)壓抽氣過(guò)濾，可接真空泵進(jìn)行抽濾。 四、本卷須知1使用滅菌鍋應(yīng)嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行，避免發(fā)生事故；滅菌時(shí)，操作者切勿擅自離開(kāi)，務(wù)必待壓力下降到零后，才可打開(kāi)鍋蓋。2干熱滅菌時(shí)電烘箱中物品不要擺得太擁擠，以免阻礙空氣流通而影響滅菌效果；滅菌物品不要與電烘箱內(nèi)壁的鐵板接觸以免包裝紙烤焦起火。3過(guò)濾除菌時(shí)應(yīng)注意檢查過(guò)濾裝置各連接處是否漏氣，以防污染。 滅菌后：擺斜面，物品烘干等。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1記錄各種不同物品所用的滅菌方法及滅菌條件(溫度、壓力等)。六、問(wèn)題和思考1比較各種滅菌方法的原理及適用范圍。2高壓蒸汽滅菌中為什么要把冷空氣排凈，為什么在滅菌后不能驟然快速降壓，并要再放盡鍋內(nèi)蒸汽才能打開(kāi)鍋蓋?每