DGGE技術(shù)在環(huán)境微生物多樣性研究中的應(yīng)用-

1、技術(shù)與方法生物技術(shù)通報B I O TECHNOLOGY BULL ET I N2009年第12期DGGE 技術(shù)在環(huán)境微生物多樣性研究中的應(yīng)用張珍妮1,2吳曉芙1陳永華1,2石卉1(1中南林業(yè)科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程研究所,長沙410004;2中南林業(yè)科技大學(xué)生物環(huán)境科學(xué)與技術(shù)研究所,長沙410004摘要:微生物是污水凈化的主要作用者之一。采用變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electr ophresis,DGGE 方法培育和鑒定土壤微生物具有可靠性強、重復(fù)性好、方便快捷等優(yōu)點,已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境科學(xué)和污染防治研究領(lǐng)域。綜述了基于PCR 2DGGE 技術(shù)的基本原理

2、、關(guān)鍵環(huán)節(jié)及其在微生物多樣性研究中的應(yīng)用,同時就其自身存在的不足進行了評價并提出了解決方案。關(guān)鍵詞:PCR 2DGGE 微生物多樣性Appli cati on i n Research on M i crobi a l D i versityof Envi ronment by DGGE Techn i queZhang Zhenni 1,2W u Xiaofu 1Chen Yonghua 1,2Shi Hui1(1Institute of Environm ent Science and Engineering,Central South U niversity of Forestry an

3、d Technology,Changsha 410004;2Institute ofB iology Environm ent Science and Technology,Central South U niversity of Forestry and Technology,Changsha 410004Abs trac t:M icr oorganis m p lays an i m portant r ole in waste water treat m ent 1Accounted f or by its high levels of reliability and rep r o

4、2ducibility as well as its convenience in operati on,the denaturing gradient gel electr ophoresis (DGGE has been widely used f or cultiva 2ti on and identificati on of m icr obial communities in the fields of envir on mental sciences with focus on polluti on contr ol 1The p rinci p le of the DGGE te

5、chnique and the concerned key fact ors in its app licati on f or analysis of m icr obial communities were described in this pa 2per 1I n comparis on,the potential app licati on areas of the DGGE technique and its li m itati ons were als o discussed 1Key wo rd s:PCR 2DGGE M icr oorganis m D iversity收

6、稿日期:2009207220基金項目:國家水體污染控制與治理科技重大專項(2008ZX072122001,國家科技部國際合作項目(20072DF A91420,湖南省博士后基金(2008RS4027,中南林業(yè)科技大學(xué)校青年基金重點項目(2008001A ,中南林業(yè)科技大學(xué)生物環(huán)境科學(xué)與技術(shù)研究所開放基金,湖南省環(huán)境科學(xué)學(xué)科建設(shè)項目(2006180作者簡介:張珍妮(19852,女,在讀碩士,研究方向:環(huán)境生物學(xué);E 2mail:zhangzhenni_20031631com 通訊作者:吳曉芙(19532,男,教授,研究方向:水土污染控制;E 2mail:wuxiaofu530911vi p 11

7、631com環(huán)境中微生物的種類和數(shù)量是及其豐富的,微生物能把有機質(zhì)作為營養(yǎng)源轉(zhuǎn)化為組成物質(zhì)和能量,它們在污染物的吸附和降解起著核心作用1,2。所以在分析環(huán)境樣品時,了解微生物的群落結(jié)構(gòu),對鑒定和分離處理系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌很重要。自1985年P(guān)ace 等3利用核酸測序方法來研究微生物的進化問題以來,分子生物學(xué)技術(shù)逐漸被引入到微生物多樣性研究中。1993年Muyzer 等4最初將變性梯度凝膠電泳DGGE 技術(shù)引入微生物生態(tài)研究,DGGE 技術(shù)是一種DNA 指紋技術(shù),是多態(tài)性分析技術(shù)的一種,可分辨出相同長度但序列不同的DNA 片段。這種方法可以有效地避免在傳統(tǒng)富集、培養(yǎng)、分離、研究過程中造成的微生物多樣

8、性丟失,種群構(gòu)成發(fā)生變化等弊病,能夠更直接、可靠地反映出微生物的原始組成情況。Muyzer 4研究表明占整個群落細菌數(shù)量約1%或以上的類群就能夠通過DGGE 監(jiān)測到,而傳統(tǒng)方法只能分離出占環(huán)境微生物總數(shù)011%10%的微生物。因此,綜述了DGGE 的基本原理與關(guān)鍵環(huán)節(jié)、及其在微生物多樣性研究中的應(yīng)用,同時就其自身存在的缺點進行了評價并提出了解決方案。1D GGE 技術(shù)的原理DGGE 技術(shù)是使用具有化學(xué)變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠對DNA 進行電泳,該凝膠電泳時能夠有區(qū)別地解鏈PCR 擴增產(chǎn)物。在進行變性梯度凝膠2009年第12期張珍妮等:DGGE技術(shù)在環(huán)境微生物多樣性研究中的應(yīng)用電泳時,長度相同

9、而在堿基序列上存在差異的DNA 雙鏈的解鏈需要不同的變性劑濃度。序列不同的DNA片段就會在各自想用的變性劑濃度下變性,發(fā)生空間構(gòu)型的變化。起初雙鏈DNA以現(xiàn)狀向正極移動,隨著變性劑濃度的增加,DNA中具有低G+C 含量的序列的部分被打開,而高G+C含量的部分仍保持雙鏈。DNA雙鏈一旦解鏈,DNA分子形成端部的叉狀或中間的環(huán)節(jié)(即DNA部分熔化。其在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度將會急劇下降,以至停留在其相應(yīng)的不同變性劑梯度位置,染色后可以在凝膠上呈現(xiàn)為分開的條帶。如此使能將具有相同長度而序列有差異的DNA分子分離開(圖1。圖1D GGE研究微生物多樣性的一般步驟2D GGE技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和優(yōu)化21

10、1提取DNA的方法的比較樣品群落總DNA的提取是DGGE研究微生物群落的基礎(chǔ)。人工濕地樣品中細菌種類復(fù)雜且混雜有大量有毒物質(zhì)、腐殖質(zhì)5,如何使所有細胞裂解、充分釋放DNA、有效去除雜質(zhì),建立高效、可靠的DNA提取方法成為研究者關(guān)注的熱點。從土壤中提取DNA的方法可以分為兩類6,一類是直接提取法,在土壤中直接裂解微生物體,再提取DNA7。另一類是間接提取法,先將微生物菌體與土壤顆粒分開,再提取DNA8,其優(yōu)缺點見表1。采用直接提取法的較多,包括3種方法,且樣品總DNA提取質(zhì)量的高低多以獲得量大、能用于后續(xù)分子操作和盡可能地包含樣品中所有微生物類群的遺傳信息為指標。DNA提取過程中一般用乙醇、異丙

11、醇和聚乙二醇(PEG等有機溶劑沉淀DNA分子,這些有機溶劑對樣品的DNA均有一定的優(yōu)先選擇性。Porteous等12認為異丙醇沉淀核酸量較高,且腐殖酸污染較少。M iller13認為S DS 結(jié)合氯仿或苯酚進行玻璃研磨可以優(yōu)化DNA 提取量。表1土壤微生物D NA提取方法的比較類型原理方法優(yōu)缺點直接提取法將樣品直接懸浮在裂解緩沖液中處理,使其釋放DNA,繼而抽提純化S DS2高鹽提取法11S DS2酚氯仿抽提法S DS高鹽提取DNA得率較高;S DS酚氯仿抽提DNA得率較低,且會造成DNA的剪切9S DS法提取的DNA中含有較多腐殖酸等雜質(zhì),要經(jīng)過純化才能用于后續(xù)研究10CT AB2S DS法

12、DNA純度較高,片段完整,可以直接用于后續(xù)一般的操作10間接提取法先將微生物菌體與土壤顆粒分開,再提取DNANycodenz法15B lending法16間接提取法的DNA得率明顯低于直接提取法,Nycodenz介質(zhì)密度梯度離心可得到相對干凈的菌泥,且細胞分離效率較高,可達20%50%14,但其價格昂貴,操作復(fù)雜;而B lending法操作簡單快速,成本低,但分離出的菌泥中含有非細胞物質(zhì)和土壤污染物212PCR的擴增及其偏差和優(yōu)化PCR擴增是PCR2DGGE技術(shù)中至關(guān)重要的步驟之一。通常采用16S r DNA中的保守區(qū)作為引物進行PCR反應(yīng)。這是由于16S r DNA具有以下幾個特點:(116

13、S r DNA約為1540個核苷酸長,序列長短適中,適合用作分類學(xué)上的研究17;(2原核生物體都具有16S r DNA;(316S r DNA非常保守,不會在不同的個體間進行基因交換,各物種具自己的獨特序列18,19;(4目前已有相當完備的16S r DNA 基因資料庫,經(jīng)過GenBank和R ibos omal Database Pr oject(RDP基因資料庫作對比分析,并可進行親源關(guān)系分析、鑒定等。目前被廣泛被廣泛使用的細菌16S r DNA通用引物是338f/518r(V3區(qū)、341f/ 926r(V3V5區(qū)和968f/1401r(V6V8區(qū)。Yu94生物技術(shù)通報B iotechno

14、logyB u lletin2009年第12期等20認為擴增V3區(qū)及V3V5區(qū)的引物為最佳引物選擇,V3區(qū)的PCR2DGGE條帶數(shù)最多、分離效果最好。如果需要較長的擴增產(chǎn)物,則選擇V3V5區(qū)。PCR技術(shù)主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸3個步驟反復(fù)的循環(huán)構(gòu)成,是在一種特異耐熱酶Taq DNA聚合酶的催化下完成的由DNA聚合酶催化反應(yīng)?？偨Y(jié)不同的PCR擴增反應(yīng)體系21,22,然后根據(jù)土壤微生物總DNA的特性,依據(jù)常規(guī)的PCR 反應(yīng)體系,試驗不同的反應(yīng)程序,得出效果較好的PCR條帶。其反應(yīng)程序如下:941m in;501m in 和721m in,共33個循環(huán),然后725m in為最后的延伸階段。

15、對基本組成以外的其它變化再進行描述:在9096內(nèi)每間隔2設(shè)系列變形溫度,結(jié)果表明,90無區(qū)帶,最適變性溫度為94。在40 60內(nèi),每隔5設(shè)系列退火溫度。結(jié)果表明,最適溫度為45和50。當其它擴增條件確定后,設(shè)擴增的循環(huán)次數(shù)分別為25、30、35和40個。結(jié)果表明,以35個循環(huán)的產(chǎn)物較為理想。從研究的結(jié)果可看出,任何試驗條件偏離最佳試驗條件將導(dǎo)致擴增無產(chǎn)物或非特異性產(chǎn)物,將影響PCR試驗的可靠性。213最佳電泳條件的選擇電泳條件的選擇在整個分析過程中具有至關(guān)重要的作用,電泳條件的優(yōu)劣直接關(guān)系到條帶分離的好壞,影響后續(xù)分析工作。DGGE電泳條件不同,即使是相同的樣品所得的圖譜也會有差異23。DGG

16、E 電泳條件選擇包括變性劑梯度、電泳溫度和時間、顯影的效果的確定。理論認為,只要選擇的電泳條件足夠精細,有1個堿基差異的DNA片段都可被分開。DGGE電泳條件一般通過經(jīng)驗數(shù)據(jù)或反復(fù)試驗來確定。通常根據(jù)基因片段的大小來確定聚丙烯酰胺凝膠濃度,當片段大小在200bp左右時,一般采用8%的凝膠。變性劑的梯度范圍要根據(jù)垂直DGGE試驗來確定,垂直試驗曲線斜率較大的部分代表解鏈區(qū)域的T m(解鏈溫度值,此時低溫解鏈區(qū)的不同分子達到最佳分離狀態(tài)24。通常選擇水平膠的的變性劑梯度范圍為30%(相當于T m范圍10左右,對于不同的樣品還需要進行調(diào)整。對大多數(shù)DNA片段5065是比較適合的,通常電泳的溫度要低于

17、樣品解鏈區(qū)域的T m值。土壤樣品相對而言比較復(fù)雜多樣,其解鏈溫度通常選擇在60左右進行優(yōu)化25。電泳時間取決于樣品的片段大小、凝膠濃度、變性劑梯度和電泳時的電壓等因素,一個條件的改變都可能引起電泳時間的不同,可以用時間進程法優(yōu)化出最佳電泳時間。Muyer和S malla26建議利用時間進程試驗確定最佳的電泳時間。具體方法是將待測樣品以恒定的時間間隔在同一塊凝膠上電泳,以獲得樣品最大分辨率的時間為最佳電泳時間。在Sigler23的研究中發(fā)現(xiàn),較長時間的電泳會改變DGGE膠中變性劑梯度,導(dǎo)致電泳圖譜的變化,3個不同的樣品,同樣在電壓1000V的體系下進行電泳分離,隨著電泳時間的減少,分離的效果變好

18、。為了更好的顯示DGGE條帶,可以選擇不同的染色方式(E B、SY BR Green I和銀染。其中,SY BR Green染色的優(yōu)點是背景色低,可以觀察到盡可能多的條帶;銀染的靈敏度最高,但銀染過后的條帶不能用于雜交分析27。3D GGE在環(huán)境治理中的應(yīng)用311DGGE技術(shù)在廢水生物處理研究中的應(yīng)用劉新春等28應(yīng)用PCR2DGGE方法,對在相同的操作條件下分別用低溫菌和常溫菌接種的兩套活性污泥系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化進行了追蹤。由于工藝相同,使得接種的低溫菌和常溫菌群在相同的操作條件下,產(chǎn)生了相似的微生物群落結(jié)構(gòu)。隨著運行時間的增加,其菌群結(jié)構(gòu)相似程度也越來越高,說明環(huán)境的變化是決定

19、微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因子。趙興青等29采用PCR2DGGE分子指紋圖譜技術(shù)比較南京玄武湖、莫愁湖和太湖不同位置的表層沉積物微生物群落結(jié)構(gòu),研究結(jié)果表明,三湖泊沉積物微生物的16S r DNA的PCR擴增結(jié)果約為626bp,為16S r DNA V3V5區(qū)特異性片段。三湖泊除具有特征性的微生物種屬外,還分布約5個相同的細菌種群。趙繼紅等30用PCR2DGGE技術(shù)分析啤酒廢水處理系統(tǒng)的微生物區(qū)系,對S BR池活性污泥細菌多樣性進行比較,得出S BR池不同深度和不同曝氣量的微生物種群結(jié)構(gòu)完全一致,不同處理時段和不同時間的微生物種群結(jié)構(gòu)一致,但優(yōu)勢菌群不同。說明水解酸化池的活性污泥微生物多052009

20、年第12期張珍妮等:DGGE技術(shù)在環(huán)境微生物多樣性研究中的應(yīng)用樣性受深度的影響變化較大,在結(jié)構(gòu)組成和種群數(shù)量上均有較大的差異。吳卿等31應(yīng)用PCR2DGGE 研究飲用水中微生物的多樣性,得出不同取樣點飲用水樣品中雖然存在特異菌,但各取樣點水樣中的優(yōu)勢菌相同。從這些研究中可以看出菌群結(jié)構(gòu)主要是由環(huán)境條件決定,一般在相同的廢水中采用不同的處理,微生物種群結(jié)構(gòu)一般一致,但優(yōu)勢菌群不同。312DGGE技術(shù)在土壤微生物研究中的應(yīng)用羅海峰等32采用PCR2DGGE技術(shù)分析農(nóng)田土壤微生物多樣性,得出了DGGE能夠?qū)ν寥罉悠分械牟煌⑸锏?6S r RNA基因的V3區(qū)的DNA擴增片段進行分離,為這些DNA片

21、段的定性和鑒定提供了條件。林曦等33進行了南極中山站排污口土壤中微生物群落的DGGE分析,針對16S r DNA基因中V3保守區(qū)域進行比較分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)中山站排污口樣品中的微生物組成表現(xiàn)出與周圍環(huán)境不同的特征。滕應(yīng)等34用PCR2DGGE技術(shù)分析了重金屬污染農(nóng)田土壤細菌群落的多樣性,反映了重金屬復(fù)合污染影響到農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)的細菌豐富度,改變土壤環(huán)境的優(yōu)勢菌群,使農(nóng)田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性發(fā)生變化。Muller等35用PCR2DGGE 方法研究了Hg污染對土壤微生物群落,特別是細菌群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果反映了Hg污染改變了細菌群落結(jié)構(gòu)以及降低了其多樣性,同時耐Hg速生細菌明顯變多,證明了多樣性

22、的減少會降低生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性,甚至導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)機能的衰退。313DGGE技術(shù)在膜生物處理研究中的應(yīng)用孫寶盛等36應(yīng)用PCR2DGGE技術(shù)解析膜生物反應(yīng)器中微生物群落多樣性,指出不同的膜生物反應(yīng)器在長期穩(wěn)定運行后形成了各自特定的生態(tài)群落結(jié)構(gòu),既有共同的優(yōu)勢種群也有各自特有的種群,相同的微生物種群在不同反應(yīng)器中的優(yōu)勢地位不同,各自特有的微生物群落則是由于水質(zhì)的不同經(jīng)過長期演替而來。蘇俊峰等37利用PCR2DGGE技術(shù)初步分析了生物陶粒反應(yīng)器細菌的種群演替情況,結(jié)果表明群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢種群的數(shù)量具有時序動態(tài)性,微生物多樣性與廢水的處理效果出現(xiàn)協(xié)同變化的特征。蔣建文等38采用PCR2DGGE技術(shù)比較了生物

23、膜和水體微生物多樣性的差異。結(jié)果表明隨著微生物膜的逐漸成熟和微生物群落的穩(wěn)定,生物膜上微生物多樣性呈高于水體微生物多樣性的態(tài)勢。肖勇等39利用PCR2DGGE研究處理垃圾滲濾液序批式生物膜反應(yīng)器(S BBR中的細菌多樣性。結(jié)果表明該馴化后的S BBR生物膜和滲濾液原水中都有比較豐富的細菌多樣性,滲濾液中存在著豐富的厭氧細菌,為生物膜馴化提供了豐富的脫氮功能菌種,馴化的生物膜中同時存在好氧反硝化細菌、厭氧氨氧化細菌、大量的硝化細菌和反硝化細菌。4D GGE技術(shù)的展望DGGE其自身也存在一些缺點:(1只能分離較小的片段(<500bp,對于大片段的分離效率下降。因此,給引物設(shè)計和系統(tǒng)發(fā)育分析帶

24、來一定困難。(2DGGE圖譜中單一的條帶并不總是代表單一的菌株,或是在不同的泳道中移動到同一位置的條帶可能由不同的細菌組成。Sehiguchi等40在試驗中發(fā)現(xiàn)DGGE圖譜中的單一條帶不能被測序,對帶中DNA進行克隆和基因文庫研究發(fā)現(xiàn),此條帶中包含多條不同的DNA序列。(3DGGE通常顯示群落中優(yōu)勢種類的r DNA片段,只有占整個群落細菌數(shù)量約l%或以上的類群能夠通過DGGE檢測到。Val2 laeys41發(fā)現(xiàn)DGGE并不能分離樣品中所有的DNA 片段。(4由于某些種類的16S r DNA不同拷貝之間的多態(tài)性問題,可能導(dǎo)致自然群落中細菌數(shù)量的過多估計42。(5DGGE技術(shù)對微生物的分類鑒定依賴

25、于基因數(shù)據(jù)庫,若數(shù)據(jù)庫中基因序列信息不夠豐富,將會限制DGGE的使用。DGGE技術(shù)作為一項新興的研究手段和工具,還需要加強和改進以下幾個方面:(1需要摸索適合具體樣品的DNA提取方法和最佳PCR條件;(2優(yōu)化DGGE條件和仔細分析具體結(jié)果。(3加強DGGE技術(shù)與其它技術(shù)的聯(lián)用。有研究中發(fā)現(xiàn)37,同一種樣品采用不同的方法分析,傳統(tǒng)方法能夠檢測到的細菌,在分子方法中卻不能被發(fā)現(xiàn),這可能是在PCR過程中該菌未被擴增的緣故。DGGE方法可以采用雙梯度DGGE/TGGE,如聯(lián)合使用一個丙烯酰胺梯度或溫度梯度以達到更好的分辨率;利用末端標記的熒光PCR產(chǎn)物、附加熒光內(nèi)泳道標準化檢測稀少群落組成和精確的樣品

26、對樣品比較。使用功能型基因作為分子標記也能區(qū)別關(guān)系相近但生態(tài)15生物技術(shù)通報B iotechnologyB u lletin2009年第12期差異的種群;DGGE與克隆文庫等技術(shù)結(jié)合,可克服局限性,充分發(fā)揮分離的優(yōu)勢。目前的發(fā)展趨勢是PCR2DGGE/TGGE與其他分子技術(shù)以及微生物學(xué)、地球化學(xué)方法聯(lián)合使用,這樣可以減少不同技術(shù)的弊端與局限性,綜合各種技術(shù)的優(yōu)勢,從而更真實地揭示環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的本質(zhì)。(4進一步豐富基因數(shù)據(jù)庫,建立更加完善的基因序列信息,為DGGE技術(shù)對微生物的分類鑒定提供更好的信息平臺。參考文獻1Hopp HG,Emerick LC,Gocke K1App lied

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