胚胎冷凍保存

1、胚胚 胎胎 冷冷 凍凍 保保 存存將胚胎貯存在將胚胎貯存在196196超低溫下長期保存超低溫下長期保存的方法。這是的方法。這是2020世記世記7070年代試驗成功的一項新年代試驗成功的一項新技術(shù)，是胚胎移植技術(shù)的重大突破。技術(shù)，是胚胎移植技術(shù)的重大突破。胚胎冷凍保存的基本概念胚胎冷凍保存的意義胚胎移植不受時間和地點的限制，提高了胚胚胎移植不受時間和地點的限制，提高了胚胎移植技術(shù)的效率；胎移植技術(shù)的效率；長期保存優(yōu)良母?；蜃羁煽康募夹g(shù)措施；長期保存優(yōu)良母牛基因最可靠的技術(shù)措施； 便于國際間交流；便于國際間交流；替代種畜引種。替代種畜引種。 滲透性：甘油、乙二醇（甘油、乙二醇（EGEG）、丙二醇

2、（）、丙二醇（PGPG）和）和DMSODMSO等，防止溶質(zhì)效應(yīng)。等，防止溶質(zhì)效應(yīng)。 非滲透性：蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、PVPPVP和聚蔗糖等，和聚蔗糖等，降低胚胎外液的冰點，減少胚胎外冰晶形成，并能促使降低胚胎外液的冰點，減少胚胎外冰晶形成，并能促使胚胎內(nèi)部的水分外流，從而最終減少胚胎內(nèi)部冰晶的形胚胎內(nèi)部的水分外流，從而最終減少胚胎內(nèi)部冰晶的形成。成?；A(chǔ)液：基礎(chǔ)液： mPBS（改良）、（改良）、 TCM-199、PBS、HEPES等，最常用等，最常用mPBS。 抗凍劑的種類及作用特點：分子量小于100，易于滲透特點：分子量大，不進入細胞玻璃化的概念：玻璃化的概念：是一

3、種物理現(xiàn)象，指通過快速降溫越過冰晶形成的階段，是一種物理現(xiàn)象，指通過快速降溫越過冰晶形成的階段，不發(fā)生結(jié)晶即可固化，使溶液形成一種無規(guī)則結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定玻璃樣固不發(fā)生結(jié)晶即可固化，使溶液形成一種無規(guī)則結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定玻璃樣固體，且保持液態(tài)時正常的分子和離子分布，則胚胎細胞免受損傷。體，且保持液態(tài)時正常的分子和離子分布，則胚胎細胞免受損傷。即高濃度的抗凍劑，急速冷卻后，液體的黏性增加，冰晶不能即高濃度的抗凍劑，急速冷卻后，液體的黏性增加，冰晶不能形成，由液態(tài)變?yōu)橥该靼牍虘B(tài)的現(xiàn)象。形成，由液態(tài)變?yōu)橥该靼牍虘B(tài)的現(xiàn)象。玻璃化溶液（玻璃化溶液（VSVS）：）：細胞內(nèi)液抗凍劑：細胞內(nèi)液抗凍劑：這種抗凍劑這種抗凍劑分子

4、量小，容易透過細胞膜，分子量小，容易透過細胞膜，使其內(nèi)使其內(nèi)部迅速達到玻璃化所需要的濃度，所以稱為細胞內(nèi)液抗凍劑。如二部迅速達到玻璃化所需要的濃度，所以稱為細胞內(nèi)液抗凍劑。如二甲基亞砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。甲基亞砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。細胞外液抗凍劑：細胞外液抗凍劑：這種抗凍劑這種抗凍劑分子量較大，一般很難透過細胞膜，分子量較大，一般很難透過細胞膜，所以稱為細胞外液抗凍劑。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡所以稱為細胞外液抗凍劑。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSABSA）等。）等。上述兩種抗凍劑組合后，用

5、基礎(chǔ)液上述兩種抗凍劑組合后，用基礎(chǔ)液mPBSmPBS調(diào)制成各種玻璃化溶液。調(diào)制成各種玻璃化溶液。抗凍劑的種類及作用 結(jié)晶變化：結(jié)晶變化： 溫度降至冰點時，冰晶首先在胚胎外液溫度降至冰點時，冰晶首先在胚胎外液形成。溫度、冰晶和外液的溶質(zhì)濃度，迫使胚胎內(nèi)部形成。溫度、冰晶和外液的溶質(zhì)濃度，迫使胚胎內(nèi)部的水不斷外流，胚胎內(nèi)部溶質(zhì)濃度增加。的水不斷外流，胚胎內(nèi)部溶質(zhì)濃度增加。 溶質(zhì)效應(yīng)：溶質(zhì)效應(yīng)： 降溫速度太慢，胚胎內(nèi)水充分外流，溶降溫速度太慢，胚胎內(nèi)水充分外流，溶質(zhì)濃度極度增加，細胞膜的脂蛋白復(fù)合物和胞質(zhì)內(nèi)的質(zhì)濃度極度增加，細胞膜的脂蛋白復(fù)合物和胞質(zhì)內(nèi)的一些其他功能蛋白變性，造成對胚胎的不可逆損害。

6、一些其他功能蛋白變性，造成對胚胎的不可逆損害。 機械效應(yīng)：機械效應(yīng)： 降溫速度過快，胚胎內(nèi)部的水來不及溢降溫速度過快，胚胎內(nèi)部的水來不及溢出到胚胎外面而直接在胚胎內(nèi)部形成冰晶，從而對胚出到胚胎外面而直接在胚胎內(nèi)部形成冰晶，從而對胚胎造成致命的機械損傷。胎造成致命的機械損傷。 胚胎冷凍保存過程中的變化和損傷 常規(guī)冷凍法：“植冰植冰”后控制降溫速度，避免過后控制降溫速度，避免過快以免胚胎內(nèi)部形成大塊冰晶；避免過慢，以免胚胎快以免胚胎內(nèi)部形成大塊冰晶；避免過慢，以免胚胎過分脫水而產(chǎn)生溶質(zhì)效應(yīng)。過分脫水而產(chǎn)生溶質(zhì)效應(yīng)。 超速冷凍法：非滲透性防凍劑對胚胎進行凍前脫非滲透性防凍劑對胚胎進行凍前脫水處理，將

7、胚胎平衡一段時間，而后投入液氮保存。水處理，將胚胎平衡一段時間，而后投入液氮保存。 玻璃化冷凍法：應(yīng)用高濃度防凍劑，使胚胎內(nèi)外應(yīng)用高濃度防凍劑，使胚胎內(nèi)外液的同源晶核形成溫度與玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度基本接近，液的同源晶核形成溫度與玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度基本接近，控制防凍劑與胚胎的平衡時間和溫度，使防凍劑對胚控制防凍劑與胚胎的平衡時間和溫度，使防凍劑對胚胎毒性降低到最低程度。胚胎內(nèi)外液能迅速轉(zhuǎn)化形成胎毒性降低到最低程度。胚胎內(nèi)外液能迅速轉(zhuǎn)化形成玻璃體，直接投入液氮保存。玻璃體，直接投入液氮保存。 胚胎冷凍保存方法 歷史：歷史：19721972年首先獲小鼠胚胎冷凍成功；年首先獲小鼠胚胎冷凍成功；19731973年

8、牛的胚胎冷凍后獲得成功，并產(chǎn)下后代。年牛的胚胎冷凍后獲得成功，并產(chǎn)下后代。 操作流程：操作流程：（1 1）抗凍液中平衡：）抗凍液中平衡：室溫下（室溫下（20202525），在含有），在含有1 12 2摩爾摩爾升抗凍劑的磷酸緩沖液（升抗凍劑的磷酸緩沖液（PBSPBS）中，胚胎經(jīng)）中，胚胎經(jīng)1010分鐘平衡，使細胞內(nèi)部抗凍劑濃度基本達到飽和。分鐘平衡，使細胞內(nèi)部抗凍劑濃度基本達到飽和。常 規(guī) 冷 凍 法（2 2）植冰（誘發(fā)結(jié)冰）：）植冰（誘發(fā)結(jié)冰）：植冰的概念：植冰的概念：在液氮中冷卻后的鑷子或棉簽夾住塑料細管上在液氮中冷卻后的鑷子或棉簽夾住塑料細管上端（棉栓端），使抗凍液迅速通過端（棉栓端），使

9、抗凍液迅速通過66左右冰點，強制左右冰點，強制性地使細胞外液形成冰晶，稱之為植冰。性地使細胞外液形成冰晶，稱之為植冰。目的：目的：當溫度降到抗凍液冰點附近時，經(jīng)植冰迅速凍結(jié)，以當溫度降到抗凍液冰點附近時，經(jīng)植冰迅速凍結(jié)，以防胚胎細胞內(nèi)部產(chǎn)生冰晶，給胚胎造成物理性的損傷，致防胚胎細胞內(nèi)部產(chǎn)生冰晶，給胚胎造成物理性的損傷，致使胚胎死亡。使胚胎死亡。將胚胎移入事先配置好抗凍液的將胚胎移入事先配置好抗凍液的0.250.25毫升塑料細管內(nèi)毫升塑料細管內(nèi)封口后進行冷卻。當溫度降至封口后進行冷卻。當溫度降至66左右時，用上述方法左右時，用上述方法誘發(fā)結(jié)冰。誘發(fā)結(jié)冰。常 規(guī) 冷 凍 法（3 3）自動降溫儀中緩

10、慢降溫）自動降溫儀中緩慢降溫：植冰后的細管按一定速度緩：植冰后的細管按一定速度緩慢降溫。慢降溫。 以以0.330.33分鐘降至分鐘降至30303535時投入液氮；時投入液氮； 以以1.01.0分鐘的速度降至分鐘的速度降至8080時投入液氮；時投入液氮； 以以0.50.5分鐘降至分鐘降至30303535時投入液氮。時投入液氮。原理：原理：植冰后使細胞外液濃度相對增高，促使細胞內(nèi)部水分植冰后使細胞外液濃度相對增高，促使細胞內(nèi)部水分充分脫出，因此緩慢降溫是非常必要的。由于脫水使細胞充分脫出，因此緩慢降溫是非常必要的。由于脫水使細胞內(nèi)部充分收縮，同時抗凍劑滲透到細胞內(nèi)部使內(nèi)部溶液黏內(nèi)部充分收縮，同時抗

11、凍劑滲透到細胞內(nèi)部使內(nèi)部溶液黏性增大，這時投入液氮中，由于過冷抑制冰晶形成。性增大，這時投入液氮中，由于過冷抑制冰晶形成。常 規(guī) 冷 凍 法（4 4）解凍：）解凍：貯存在液氮中的塑料細管取出后，迅速浸入室貯存在液氮中的塑料細管取出后，迅速浸入室溫或溫或3737水浴中解凍。水浴中解凍。（5 5）除去抗凍劑：）除去抗凍劑：原因：原因： 解凍后的胚胎，細胞內(nèi)部抗凍劑濃度較高，對胚胎解凍后的胚胎，細胞內(nèi)部抗凍劑濃度較高，對胚胎有毒害作用；此外，若直接移入等滲生理溶液中，水分會有毒害作用；此外，若直接移入等滲生理溶液中，水分會伸入細胞內(nèi)引起膨脹，使細胞受損傷。伸入細胞內(nèi)引起膨脹，使細胞受損傷?？箖鲆海嚎?/p>

12、凍液：蔗糖溶液；蔗糖溶液；操作：操作：解凍后胚胎由解凍后胚胎由濃度高的抗凍液濃度高的抗凍液中移向中移向濃度低的抗凍液，濃度低的抗凍液，進行梯度稀釋進行梯度稀釋；即將胚胎先移入高滲蔗糖溶液中，再移入；即將胚胎先移入高滲蔗糖溶液中，再移入低滲蔗糖溶液中，在脫水的同時脫出抗凍劑，而后移入等低滲蔗糖溶液中，在脫水的同時脫出抗凍劑，而后移入等滲生理溶液中洗凈，待胚胎基本復(fù)原后進行移植或繼續(xù)培滲生理溶液中洗凈，待胚胎基本復(fù)原后進行移植或繼續(xù)培養(yǎng)。養(yǎng)。常 規(guī) 冷 凍 法 從培養(yǎng)液中吸取胚胎，并放置在冷凍液中: 1.5M 乙二醇 + 蔗糖 + PBS + AA + FCS 裝入細管 (編號預(yù)先準備好) 放入冷

13、凍容器 -6.0 Seeding ice 每分鐘降低 0.5 ，一直到-30為止 放入液氮容器常 規(guī) 冷 凍 程 序玻璃化的概念：玻璃化的概念：是一種物理現(xiàn)象，指通過快速降溫越過冰晶形成的階段，是一種物理現(xiàn)象，指通過快速降溫越過冰晶形成的階段，不發(fā)生結(jié)晶即可固化，使溶液形成一種無規(guī)則結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定玻璃樣固不發(fā)生結(jié)晶即可固化，使溶液形成一種無規(guī)則結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定玻璃樣固體，且保持液態(tài)時正常的分子和離子分布，則胚胎細胞免受損傷。體，且保持液態(tài)時正常的分子和離子分布，則胚胎細胞免受損傷。即高濃度的抗凍劑，急速冷卻后，液體的黏性增加，冰晶不能即高濃度的抗凍劑，急速冷卻后，液體的黏性增加，冰晶不能形成，由液態(tài)變?yōu)?/p>

14、透明半固態(tài)的現(xiàn)象。形成，由液態(tài)變?yōu)橥该靼牍虘B(tài)的現(xiàn)象。玻璃化溶液（玻璃化溶液（VSVS）：）：細胞內(nèi)液抗凍劑：細胞內(nèi)液抗凍劑：這種抗凍劑這種抗凍劑分子量小，容易透過細胞膜，分子量小，容易透過細胞膜，使其內(nèi)使其內(nèi)部迅速達到玻璃化所需要的濃度，所以稱為細胞內(nèi)液抗凍劑。如二部迅速達到玻璃化所需要的濃度，所以稱為細胞內(nèi)液抗凍劑。如二甲基亞砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。甲基亞砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。細胞外液抗凍劑：細胞外液抗凍劑：這種抗凍劑這種抗凍劑分子量較大，一般很難透過細胞膜，分子量較大，一般很難透過細胞膜，所以稱為細胞外液抗凍劑。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡所以稱為細胞外液抗

15、凍劑。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSABSA）等。）等。上述兩種抗凍劑組合后，用基礎(chǔ)液上述兩種抗凍劑組合后，用基礎(chǔ)液mPBSmPBS調(diào)制成各種玻璃化溶液。調(diào)制成各種玻璃化溶液。胚胎玻璃化冷凍幾種常見的玻璃化冷凍方法：幾種常見的玻璃化冷凍方法：（1 1）RallRall等（等（19851985）玻璃化冷凍保存法：）玻璃化冷凍保存法：是最初發(fā)明的玻是最初發(fā)明的玻璃化冷凍保存方法，他們采用的璃化冷凍保存方法，他們采用的VS1VS1玻璃化溶液，是以透玻璃化溶液，是以透過性抗凍劑二甲基亞砜過性抗凍劑二甲基亞砜（DMSODMSO）為主體溶

16、液）為主體溶液，為緩和其化，為緩和其化學毒性，添加了乙酰胺學毒性，添加了乙酰胺(AA)(AA)、丙二醇、丙二醇(PG)(PG)和非透過性抗凍和非透過性抗凍劑聚乙二醇劑聚乙二醇(PEG)(PEG)。PEGPEG具有促進玻璃化形成的作用。胚胎具有促進玻璃化形成的作用。胚胎在玻璃化溶液中平衡時，濃度由低到高（在玻璃化溶液中平衡時，濃度由低到高（25255050100100VS1VS1）；平衡溫度由高到低（）；平衡溫度由高到低（22224 444）三步完）三步完成，計成，計3535分鐘平衡后投入液氮中冷凍保存。分鐘平衡后投入液氮中冷凍保存。胚胎玻璃化冷凍（2 2）ScheffenScheffen等玻璃

17、化冷凍保存法：等玻璃化冷凍保存法：主體抗凍劑：主體抗凍劑：丙三醇（丙三醇（G G）和丙二醇）和丙二醇(P)(P)；玻璃化溶液：玻璃化溶液：上述兩種抗凍劑各含上述兩種抗凍劑各含2525混合而成混合而成(PG25)(PG25)，兩者混合后可降低溶液的化學毒性，無需添加細胞非透兩者混合后可降低溶液的化學毒性，無需添加細胞非透過性抗凍劑。過性抗凍劑。方法：方法：室溫下（室溫下（20202525），胚胎于），胚胎于1010丙三醇溶液中平丙三醇溶液中平衡衡1010分鐘，然后在分鐘，然后在PG25PG25中平衡中平衡3030秒鐘，然后投入液氮中秒鐘，然后投入液氮中冷凍保存。冷凍保存。（3 3）KasaiKa

18、sai等玻璃化冷凍保存法：等玻璃化冷凍保存法：抗凍劑：抗凍劑：乙二醇（乙二醇（EGEG）為細胞內(nèi)液抗凍劑（透過性保護）為細胞內(nèi)液抗凍劑（透過性保護劑），其具備分子量小、溶液滲透壓高、細胞膜透過性劑），其具備分子量小、溶液滲透壓高、細胞膜透過性強的特點；聚蔗糖（強的特點；聚蔗糖（FicollFicoll）為細胞外液抗凍劑，有利）為細胞外液抗凍劑，有利于促進玻璃化形成；蔗糖于促進玻璃化形成；蔗糖(Sucrose)(Sucrose)是為了冷凍前胚胎是為了冷凍前胚胎細胞的脫水，細胞內(nèi)部細胞的脫水，細胞內(nèi)部EGEG的調(diào)整及解凍后的的調(diào)整及解凍后的EGEG的脫出。的脫出。玻璃化溶液：玻璃化溶液：上述三種抗

19、凍劑經(jīng)上述三種抗凍劑經(jīng)mPBSmPBS調(diào)整成調(diào)整成EFSEFS玻璃化溶玻璃化溶液；液；方法：方法：室溫胚胎在室溫胚胎在EFSEFS玻璃化溶液中玻璃化溶液中2 25 5分鐘平衡后，即分鐘平衡后，即投入液氮。投入液氮。胚胎玻璃化冷凍（2 2）ZhuZhu等玻璃化冷凍保存法：等玻璃化冷凍保存法：主體抗凍劑：主體抗凍劑：乙二醇、甘油和二甲基亞砜；乙二醇、甘油和二甲基亞砜；玻璃化溶液：玻璃化溶液：EFSEFS、GFSGFS和和EDFSEDFS；方法：方法：室溫下，將胚胎在室溫下，將胚胎在1010乙二醇或乙二醇或1010甘油或甘油或1010乙乙二醇二醇1010二甲基亞砜中平衡二甲基亞砜中平衡5 5分鐘，再移入分鐘，再移入EFSEFS或或GFSGFS或或EDFSEDFS玻璃化溶液中平衡玻璃化溶液中平衡3030秒鐘，即兩步法冷