生化實(shí)驗(yàn)報(bào)告4

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告 纖維素酶活力的測定 還原糖的測定-3,5-二硝基水楊酸法 劉欣怡 201100140057 2011級(jí)生物基地班 周一下午 同組者：劉藝 2013年4月8號(hào) 周一下午一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)會(huì)并掌握用3、5二硝基水楊酸法測定酶活力方法。2、鞏固使用分光光度計(jì)。3、掌握還原糖和總糖測定的基本原理。4、學(xué)習(xí)比色法測定還原糖的操作方法。二、實(shí)驗(yàn)器材1、試劑：（1）3、5二銷基水楊酸顯色液：稱取10克3、5-二銷基水楊酸，溶入蒸餾水中，加入20克分析純氫氧化鈉，200克酒石酸鉀鈉，加水500毫升，升溫溶解后，加入重蒸酚2克，無水亞硫酸鈉0.5克。加熱攪拌，待全溶后冷卻，定容至1000毫升。

2、存于棕色瓶中，放置一周后使用。（2）纖維素酶：0.05g酶溶解定容至50ml，取1ml再定容至100ml待測（用PH4.5乙酸-乙酸鈉緩沖液配制）。即20g/ml。（3）05%羧甲基纖維素鈉水溶液（CMC）：用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸鈉緩沖溶液配置，溶解后成膠狀液，靜置過夜。使用前搖勻。（4）標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液：稱取干燥至恒重的葡萄糖100毫克，溶解后定容至100毫升，此溶液含葡萄糖1.00毫克/毫升。（5）西瓜汁：使用新鮮的西瓜現(xiàn)場榨得西瓜汁，并且過濾以備用。（6）蒸餾水2、器材：722型分光光度計(jì)、水浴鍋、電爐、多個(gè)比色管、移液槍、燒杯、不同型號(hào)的移液管、多個(gè)試管、槍頭、試管架、多

3、個(gè)膠頭滴管、洗耳球、溫度計(jì)、試管夾、量筒等。三、實(shí)驗(yàn)原理1、纖維素酶：纖維素酶是一種多組分酶，包括C1酶、CX酶和-葡萄糖苷酶三種主要組分。其中C1酶的作用是將天然纖維素水解成無定形纖維素，CX酶的作用是將無定形纖維素繼續(xù)水解成纖維寡糖，-葡萄糖苷酶的作用是將纖維寡糖水解成葡萄糖。纖維素酶水解纖維素產(chǎn)生的纖維二糖、葡萄糖等還原糖能將堿性條件下的3,5-二硝基水楊酸（DNS）還原，生成棕紅色的氨基化合物，在550nm波長處有最大光吸收，在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈比例關(guān)系，利用比色法測定其還原糖生成的量就可測定纖維素酶的活力。產(chǎn)生纖維素酶的菌種容易退化，導(dǎo)致產(chǎn)酶能力降低。纖維素酶在

4、食品行業(yè)和環(huán)境行業(yè)均有廣泛應(yīng)用。在進(jìn)行酒精發(fā)酵時(shí)，纖維素酶的添加可以增加原料的利用率，并對酒質(zhì)有所提升。由于纖維素酶難以提純，實(shí)際應(yīng)用時(shí)一般還含有半纖維素酶和其他相關(guān)的酶，如淀粉酶（amylase）、蛋白酶（Protease）等纖維素酶種類繁多，來源很廣。不同來源的纖維素酶其結(jié)構(gòu)和功能相差很大。由于真菌纖維素酶產(chǎn)量高、活性大，故在畜牧業(yè)和飼料工業(yè)中應(yīng)用的纖維素酶主要是真菌纖維素酶。常見的畜禽飼料如谷物、豆類、麥類及加工副產(chǎn)品等都含有大量的纖維素。除了反芻動(dòng)物借助瘤胃微生物可以利用一部分外，其它動(dòng)物如豬、雞等單胃動(dòng)物則不能利用纖維素。近年來，國內(nèi)外利用真菌纖維素酶成為提高畜禽生產(chǎn)性能和飼料利用率

5、的重要措施之一。2、酶活力：酶活力（enzyme activity）也稱為酶活性，是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力的大小可用在一定條件下，酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的速度來表示，酶催化反應(yīng)速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。測定酶活力實(shí)際就是測定酶促反應(yīng)的速度。酶促反應(yīng)速度可用單位時(shí)間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。在一般的酶促反應(yīng)體系中，底物往往是過量的，測定初速度時(shí)，底物減少量占總量的極少部分，不易準(zhǔn)確檢測，而產(chǎn)物則是從無到有，只要測定方法靈敏，就可準(zhǔn)確測定。因此一般以測定產(chǎn)物的增量來表示酶促反應(yīng)速度較為合適。3、本實(shí)驗(yàn)中酶活力定義：1g酶每分鐘水解生成1微克葡萄糖的量定義為一

6、個(gè)活力單位。由此定義我們可以計(jì)算本實(shí)驗(yàn)中的纖維素酶活力。4、還原糖：能夠還原斐林(H.von Fehling)試劑或托倫斯(B.Tollens)試劑的糖稱為還原糖，所有的單糖（除二羥丙酮），不論醛糖、酮糖都是還原糖。大部分雙糖也是還原糖，蔗糖例外。斐林試劑是含Cu2 絡(luò)合物的溶液，被還原后得到磚紅色Cu2O的沉淀。托倫斯試劑被還原后能生成單質(zhì)銀，在試管壁上可看到“銀鏡”。 分子結(jié)構(gòu)中含有還原性基團(tuán)（如游離醛基或游離羰基）的糖，叫還原糖。如葡萄糖。果糖含有游離的醛基，所以果糖也屬于還原糖。一般情況下，單糖的還原能力主要來自它的醛基，如葡萄糖，而多糖則大多因?yàn)榘肟s醛羥基的存在。還原后，自

7、己會(huì)變成糖酸。如葡萄糖就會(huì)變成葡萄糖酸。 如該糖是一酮糖，酮基就會(huì)斷裂，分解成兩個(gè)較小的分子，如果糖。除蔗糖外，所有單糖及雙糖在本尼迪克特試驗(yàn)中呈陽性反應(yīng)，所以所有單糖及雙糖都具有還原性。但有時(shí)果糖可能會(huì)算作非還原糖處理。還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計(jì)，在540 nm波長下測定光密度值，查對標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時(shí)，每斷裂一個(gè)糖苷鍵需加入一分子水，所以在計(jì)算多糖含量時(shí)應(yīng)乘以0.9。還原糖的

8、測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，如乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，對沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進(jìn)行測定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計(jì)）。黃色    桔紅色四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 使用3,5-二硝基水楊酸法，并且借助分光光度計(jì)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定纖維素酶的活力以及西瓜汁中還原糖的含量。五、實(shí)驗(yàn)步驟（一）纖維素酶活力的測定標(biāo)注：0.1g纖維素酶溶解定容至50mL.取1mL再定容

9、至100mL，即10g/ml的纖維素酶液待測。（用PH4.5乙酸-乙酸鈉緩沖液配制，、此實(shí)驗(yàn)已配好）1、空白管的制備：用移液管取1mL酶液置于干凈的比色管中，貼上標(biāo)簽“空白”，緊接著沸水浴5分鐘，取出冷卻，然后用移液管加3mL0.5%CMC。2、樣品管的制備：取干凈的3支比色管，標(biāo)上1、2、3，分別加入3mL0.5%CMC以及1mL酶液。3、集體操作：將配置好的樣品管與空白管同時(shí)置于50°C 水浴鍋水浴30分鐘。取出后，立刻沸水浴10分鐘。取出后冷卻，然后再分別用移液管加入3mL 3,5-二硝基水楊酸顯色液，然后再沸水浴10分鐘，取出冷卻后再定容至25mL（比色管上的25ml刻度），

10、撕取一小塊保鮮膜封在比色管口并且用橡皮筋扎緊，然后倒轉(zhuǎn)比色管混勻溶液。打開分光光度計(jì)開關(guān)預(yù)熱15min，然后將樣品管和空白管都在550nm下測量其OD值，并且記錄數(shù)據(jù)。為了讓測得的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)而不需要繪制延長線，所以在第一次測量之后，又將各個(gè)樣品溶液稀釋了2倍，即將各個(gè)比色管中的溶液減少到比色管上的刻度12.5ml處，然后再定容到最大的25ml刻度線處，再進(jìn)行測量，記錄所有數(shù)據(jù)。最終計(jì)算在得到標(biāo)準(zhǔn)曲線之后。（二）西瓜汁中還原糖的測定1、標(biāo)準(zhǔn)曲線比色管的制備： 取6支干凈的比色管，分別標(biāo)上1、2、3、4、5、6，依次（按照從1號(hào)到6號(hào)的順序）用移液管向各個(gè)比色管中加入0、0.2、0.

11、4、0.6、0.8、1ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。然后再按照相同的順序依次在各個(gè)比色管中用移液管加入1、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml的蒸餾水。2、樣品比色管的制備：用移液管吸取2ml的壓榨并過濾好的西瓜汁，用100ml容量瓶定容至100ml刻度線?；靹蚝?，用移液管分別吸取0.5ml稀釋好的西瓜汁至三個(gè)干凈的比色管中，三個(gè)比色管編號(hào)依次為7、8、9，然后再分別用移液管移取0.5ml蒸餾水至3個(gè)標(biāo)記好的樣品比色管中。3、集體操作：將配置好的6支標(biāo)準(zhǔn)曲線比色管以及3支樣品比色管放入同一個(gè)大燒杯中，用移液管一次向各個(gè)比色管中加入3ml配置好的顯色液，然后將所有的比色管沸水浴10min。取出后冷卻。然

12、后加蒸餾水值比色管上的25ml刻度線。撕取一小塊保鮮膜封好比色管口，并且用橡皮筋扎好保鮮膜，然后用中指堵住比色管口并來回倒轉(zhuǎn)比色管以混勻溶液。打開分光光度計(jì)預(yù)熱15min，然后用1號(hào)管作為空白管，依次測定各個(gè)比色管中溶液的OD值，該過程中，1號(hào)比色管的溶液倒入小杯中后，放入分光光度計(jì)的第一處就不用再取出。記錄數(shù)據(jù)。4、計(jì)算：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算西瓜汁中還原糖的含量。同時(shí)，將上面測得的纖維素酶活力的OD值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得纖維素酶的活力。N×OD值對應(yīng)的葡萄糖量纖維素酶活力單位=30×1N酶液的稀釋倍數(shù)30糖化所用時(shí)間（min）1反應(yīng)酶液毫升數(shù)標(biāo)注：對于本次實(shí)驗(yàn)

13、中的全部冷卻操作，均是將比色管從沸水中取出后，現(xiàn)在空氣中冷卻一會(huì)，待比色管的溫度手可以承受后再用流水沖洗比色管外壁來冷卻，千萬注意不好讓水流入比色管中！六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、纖維素酶活力測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 表I、纖維素酶活力的測定編號(hào)空白樣品一樣品二樣品三酶液/mL1(失活)111CMC/mL333350恒溫30min，取出后立即沸水浴10min顯色液/mL3333沸水浴中煮沸顯色10min,冷卻,加蒸餾水至25mLA（550nm）0.0000.7790.7780.794 4個(gè)比色管中的溶液稀釋2倍A(550nm)0.000 0.404 0.4030.3982、西瓜汁中還原糖的測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 表II、還

14、原糖的測定管號(hào)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品123456789標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液/ml00.20.40.60.81.0稀釋的西瓜汁/ml0.50.50.5水/ml1.00.80.60.40.200.50.50.5顯色劑/ml分別加入3ml顯色劑，然后沸水浴10min，取出后冷卻，然后加水定容至25ml，混勻A（550nm）0.0000.1180.2750.4190.5490.6730.2750.2780.2733、標(biāo)準(zhǔn)曲線：4、纖維素酶活力的計(jì)算： 注意，本次實(shí)驗(yàn)中的酶液，老師配制成了20g/ml。（1）本次實(shí)驗(yàn)一共做了三組平行實(shí)驗(yàn)以及一組空白實(shí)驗(yàn)，一共得到了3個(gè)OD值，因?yàn)榇舜蚊甘切庐a(chǎn)品，所以一開始實(shí)驗(yàn)的稀釋

15、倍數(shù)不是很合適，得到的OD值超出了標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍，因?yàn)槌霾糠植恢欠褚琅f是正比關(guān)系，所以又將三組樣品稀釋了2倍后再測，得到的OD值符合要求，取平均值為： （0.404+0.403+0.398）/3=0.402（2）如上圖，擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式為y=0.686x-0.004,則將OD值為0.402即y=0.402帶入該方程式中，得到： x=0.592 即OD值對應(yīng)的葡萄糖含量為0.592mg/ml，即592ug/ml。（3）回顧整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作可以得出，一開始只加入了1ml的酶液，即20g，而酶活力的定義是針對1g酶，所以相當(dāng)于酶液稀釋了5*104倍；在實(shí)驗(yàn)中，第一次測得的OD值比較大，超出了標(biāo)

16、準(zhǔn)曲線的范圍，所以又將每一個(gè)樣品溶液稀釋了2倍，再進(jìn)行測量，此時(shí)測得的OD值符合要求。所以： N=105 因?yàn)楸敬螌?shí)驗(yàn)中所使用的酶液是20 ug/ml，再根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)中酶活力的定義（1g酶每分鐘水解生成1微克葡萄糖的量定義為一個(gè)活力單位）可以得： 纖維素酶活力單位（592*105）/（30*1）=1.97*106 U/g 該結(jié)果根據(jù)的酶活力的定義是老師寫在黑板上的。（根據(jù)實(shí)驗(yàn)講義上的酶活力的定義，即1mg酶每分鐘水解生成1微克葡萄糖的量定義為一個(gè)活力單位，此時(shí)纖維素酶活力單位=1.97*103U/mg）5、西瓜汁中還原糖的計(jì)算：（1）本次實(shí)驗(yàn)中一共做了三個(gè)樣品比色管，得到了三個(gè)OD值，取平均得

17、： （0.275+0.278+0.273）/3=0.275（2）如上圖，擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式為y=0.686x-0.004,則將OD值為0.275即y=0.275帶入該方程式中，得到： x=0.400（3）回顧整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作，西瓜汁首先是2ml稀釋定容至100ml，即稀釋了50倍，然后吸取0.5ml于比色管中，又加入了0.5ml蒸餾水，之后的操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同?？傊还蚕♂屃?0*2=100倍。由此可得： （0.400*100）/1000=0.0400g/ml即西瓜汁中還原糖的含量為0.0400g/ml。七、實(shí)驗(yàn)分析1、本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：(1)纖維素酶活力的計(jì)算：對于本次實(shí)驗(yàn)，除了實(shí)驗(yàn)操作中

18、移液量的準(zhǔn)確性、空白實(shí)驗(yàn)的制作以及平行實(shí)驗(yàn)的制作這些需要注意的地方外，在最后計(jì)算時(shí)，要根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)中酶活力的定義來分析計(jì)算。本次實(shí)驗(yàn)中，對于酶液的稀釋倍數(shù)N的判斷很關(guān)鍵，因?yàn)楸敬螌?shí)驗(yàn)定義1g酶每分鐘水解生成1微克葡萄糖的量定義為一個(gè)活力單位，而操作中，加入了1ml酶，含有20g，即相當(dāng)與1g酶稀釋了5*104倍，之后在測量OD值時(shí)，又將各個(gè)樣品溶液稀釋了2倍，所以一共稀釋了105倍。對于思考時(shí)的干擾因素將1ml的酶液加入到比色管后，最后測量OD之前，定容到比色管的刻度線25ml，并不是將酶液稀釋了25倍。因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線指定時(shí)，每支比色管中均加入了由蒸餾水和標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液混合的不同濃度的葡萄糖溶液

19、1ml，之后在測量OD之前也是定容到了25ml，計(jì)算時(shí)，根據(jù)樣品溶液的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上尋找相對應(yīng)的葡萄糖含量，此時(shí)是1ml纖維素酶液及1ml葡萄糖溶液之間的對應(yīng)關(guān)系，所以無需考慮定容到25ml的影響。除此之外，其他的數(shù)據(jù)較易分析，即1ml酶液、30min反應(yīng)時(shí)間以及對應(yīng)的以g/ml為單位的葡萄糖含量，然后直接帶入公式計(jì)算即可。對于本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，三組平行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果平行性還不錯(cuò)，其中的兩個(gè)樣品的OD值相差0.001，剩下的一個(gè)稍微偏離的多一些，但是這三個(gè)OD值的差別均在小數(shù)的千分位上，所以結(jié)果還是理想的。（2）西瓜汁中還原糖的測定：本次實(shí)驗(yàn)是使用的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，以葡萄糖來表征西瓜汁中所有的還原

20、糖。對于計(jì)算西瓜汁中還原糖的含量，算法以及思考方式同之前一些用到分光光度計(jì)的實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)的含量測定、RNA的含量測定等是一樣的。對于本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，測得的西瓜汁稀釋樣品的OD值，三組平行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果平行性非常好，幾乎沒有差別，分析成功的原因有：嚴(yán)格用移液管的有刻度部分仔細(xì)認(rèn)真移取試劑；認(rèn)真仔細(xì)定容，嚴(yán)格按照凹液面的最低處和刻度線平齊來實(shí)施；分光光度計(jì)提前預(yù)熱，且預(yù)熱時(shí)間合適；定容后，用保鮮膜封好比色管口，并用橡皮筋扎好關(guān)口，然后認(rèn)真倒轉(zhuǎn)混合比色管中加入的試劑，溶液混合均勻；測量OD值時(shí)，嚴(yán)格用待測溶液潤洗比色杯3次；2、纖維素酶實(shí)驗(yàn)誤差分析：在該實(shí)驗(yàn)中，有以下方面可能導(dǎo)致誤差：（1）比色管中溶液定容

21、到25ml后未充分混勻，導(dǎo)致上層溶液濃度偏低，進(jìn)而影響OD值測量；（2）測OD值時(shí)，使用比色杯潤洗次數(shù)不足，影響測定；（3）空白管在沸水浴時(shí)未完全失活，會(huì)導(dǎo)致調(diào)零基準(zhǔn)不準(zhǔn)確，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；（4）樣品管和空白管放入沸水浴的操作沒有保證時(shí)間相同，會(huì)直接導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差；（5）定容時(shí)應(yīng)使液體先完全冷卻，否則宜出現(xiàn)誤差；（6）用移液管移取液體，管口最后的一滴易產(chǎn)生移液量的誤差；（7）分光光度計(jì)預(yù)熱時(shí)間短，儀器還不穩(wěn)定就開始測量；（8）各個(gè)比色管中顯色劑加入的量并不全是精確地3ml；（9）50水浴時(shí)間不足30min，或者超過30min；3、還原糖實(shí)驗(yàn)誤差分析：在該實(shí)驗(yàn)中，有以下方面可能導(dǎo)致誤差：（1）各個(gè)比

22、色管中顯色劑加入的量并不全是精確的3ml；（2）比色管中溶液定容到25ml后未充分混勻，導(dǎo)致上層溶液濃度偏低，進(jìn)而影響OD值測量；（3）測OD值時(shí)，使用比色杯潤洗次數(shù)不足，影響測定；（4）定容時(shí)應(yīng)使液體先完全冷卻，否則宜出現(xiàn)誤差；（5）用移液管移取液體，管口最后的一滴易產(chǎn)生移液量的誤差；（6）分光光度計(jì)預(yù)熱時(shí)間短，儀器還不穩(wěn)定就開始測量；4、回顧整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過程，為了又好又快地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以加快實(shí)驗(yàn)速度的操作有：（1）使用較大一些的移液管，吸一次試劑后，加入到多個(gè)比色管中，注意要使用有刻度的部分；（2）纖維素酶活力測定實(shí)驗(yàn)的比色管和還原糖含量測定實(shí)驗(yàn)的比色管同時(shí)進(jìn)行配制，兩人合作完成；（3）使

23、用熱水進(jìn)行加熱可以更快的得到沸水??；（4）使用分光光度計(jì)時(shí)，向比色杯中倒溶液，從濃度小的開始，濃度一次增大，這樣不需要用蒸餾水沖洗比色杯，可以直接用待測的溶液潤洗；（5）測OD值時(shí)，空白溶液的比色杯放入第一位后便不用再取出，一直用來標(biāo)定即可。八、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1、注意是用移液管取液，并且使用有刻度的部分，不要使用移液槍，不準(zhǔn)確。2、注意清洗比色管后，盡量將水甩干凈。3、沸水浴后，取出冷卻，一定要先在空氣中冷卻，待溫度降下些后再流水冷卻。否則也冷易爆。4、用流水冷卻比色管時(shí)，千萬不要讓水進(jìn)入比色管5、分光光度計(jì)要提前打開開關(guān)預(yù)熱，這樣更準(zhǔn)確。6、在測定時(shí)，調(diào)零用1號(hào)管液一定在相應(yīng)的各管液測定完成后

24、，方可從比色杯中棄掉。7、用移液管加各試劑時(shí)，不能混用。8、在測定時(shí)為使各樣品和空白管處理一致，應(yīng)同時(shí)加入試劑，同時(shí)放入水浴中，同時(shí)取出水浴，以使反應(yīng)得進(jìn)行程度一致。9、在測溶液的OD值之前，應(yīng)將溶液搖勻，搖勻的方法是用保鮮膜蒙住試管口，然后來回震蕩試管。10、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與樣品測定應(yīng)同時(shí)進(jìn)行顯色，并使用同一空白調(diào)零點(diǎn)比色。11、若比色液顏色過深，其吸光度可能超出標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍，可將樣液適當(dāng)稀釋后再顯色測定12、注意在實(shí)驗(yàn)前先將比色管貼好標(biāo)簽，尤其是空白管，以免在實(shí)驗(yàn)中比色管混淆。13、實(shí)驗(yàn)中由于比色管中溶液量過多，若用旋窩攪拌器混勻，可能使溶液濺出，可使用保鮮膜，將其覆蓋在比色管口，上下?lián)u

25、動(dòng)比色管，進(jìn)行混勻。14、分光光度計(jì)使用前應(yīng)進(jìn)行預(yù)熱30min，使其發(fā)光穩(wěn)定，且在無樣品放置時(shí)，應(yīng)使試樣室蓋打開，此時(shí)光門自動(dòng)關(guān)閉，以保護(hù)光電管。15、使用比色管時(shí)要將其擦拭干凈，應(yīng)用吸水紙吸去比色管表面溶液，用擦鏡紙擦拭，以避免對比色管光滑一面造成磨損。16、測量時(shí)，不可以其磨砂面正對光源。17、在標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)，應(yīng)從低濃度到高濃度以此測量，因?yàn)榈蜐舛鹊臍埩粢簩Ω邼舛却郎y液的測定不會(huì)有太大影響，所以可不用潤洗比色管，但若有高濃度到低濃測定，則需要對比色管進(jìn)行潤洗，以消除誤差，因?yàn)楦邼舛葰埩粢簳?huì)對低濃度的溶液濃度造成很大影。18、用分光光度計(jì)測量OD值時(shí)，對于用來標(biāo)定的空白溶液，倒入小杯后放在

26、第一個(gè)孔洞中。19、因?yàn)橐淮沃荒軠y量4種溶液，所以第一位上的空白溶液不要拿出，每測量一次就標(biāo)定一次。20、注意本次實(shí)驗(yàn)，酶液是10g/ml，標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液是1mg/ml。21、計(jì)算時(shí)，注意回顧實(shí)驗(yàn)操作，看看一共稀釋了多少倍。22、計(jì)算纖維素酶活力時(shí)，注意本次實(shí)驗(yàn)中有關(guān)酶活力的定義。23、測量結(jié)束后，將數(shù)據(jù)拿給老師看。24、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將儀器歸位，并且玻璃儀器洗干凈。九、實(shí)驗(yàn)思考題1、兩個(gè)空白管是否有需要設(shè)立？曲線是否需要過原點(diǎn)？酶失活空白管設(shè)立的作用？ 答：兩個(gè)空白管都需要設(shè)立。酶失活空白管設(shè)立作用是排除酶和纖維素和與顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生的影響。常規(guī)的100沸水浴滅酶活并不徹底,殘留酶活形成的空白值

27、會(huì)導(dǎo)致測定結(jié)果產(chǎn)生較大的負(fù)偏差。建立了一種簡便可靠的空白實(shí)驗(yàn)方法:以底物空白與酶液空白的算術(shù)和作為總空白值處理,其酶活測定偏差小于2%。并指出應(yīng)在規(guī)范的測試條件下測定酶活,其測定結(jié)果才具有可比性,因此曲線需要過原點(diǎn)。2、影響纖維素酶產(chǎn)量和活力的因素很多，例如？答：除菌種外，還有培養(yǎng)溫度、pH、水分、基質(zhì)、培養(yǎng)時(shí)間等。這些因素不是孤立的，而是相互聯(lián)系的。3、和測定還原糖相比，3,5-二硝基水楊酸比色法是如何對總糖進(jìn)行測定的? 答：植物中的總糖包括單糖、寡糖和多糖，單糖是還原糖，可直接測定。而沒有還原性的寡糖和多糖，需用高濃度的酸在加熱的條件下水解成有還原性的單糖，還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖

28、酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成一定比例關(guān)系，利用分光光度計(jì)，在540nm波長下測定光密度值，查對標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時(shí)，每斷裂一個(gè)糖苷鍵需要加入一分子水，所以在計(jì)算多糖含量時(shí)應(yīng)乘以0.9。4、什么叫標(biāo)準(zhǔn)曲線？答：標(biāo)準(zhǔn)曲線是指通過測定一系列已知組分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的某理化性質(zhì)，而得到的性質(zhì)的數(shù)值曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的物理/化學(xué)屬性跟儀器響應(yīng)之間的函數(shù)關(guān)系。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的目的是推導(dǎo)待測物質(zhì)的理化屬性。在分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析，通常情況下的標(biāo)

29、準(zhǔn)工作曲線是一條直線。與校正曲線不同，它是以標(biāo)準(zhǔn)溶液及介質(zhì)組成的標(biāo)準(zhǔn)系列，標(biāo)繪出來的曲線。校正曲線的標(biāo)準(zhǔn)系列的伴生組分必須與試樣相匹配，以便測量結(jié)果的準(zhǔn)確。只有標(biāo)準(zhǔn)曲線與校正曲線相重合的條件下，才可以用標(biāo)準(zhǔn)曲線來代替校正曲線。5、如何正確繪制和使用標(biāo)準(zhǔn)曲線?答：標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)在坐標(biāo)紙上繪制，橫坐標(biāo)軸距坐標(biāo)紙底邊1.52cm，標(biāo)示出刻度和葡萄糖的毫克數(shù)；縱坐標(biāo)軸距坐標(biāo)紙左邊1.52cm，標(biāo)示刻度和光密度值；曲線為過原點(diǎn)的直線，測定點(diǎn)均勻分布在直線的兩側(cè)；標(biāo)準(zhǔn)曲線只能在測試條件完全相同的情況下，用于確定樣品中的物質(zhì)含量。對于重復(fù)的測定，應(yīng)取吸光度的平均值查標(biāo)準(zhǔn)曲線；測定數(shù)據(jù)不應(yīng)記在標(biāo)準(zhǔn)曲線上。6、簡述

30、一些葡萄糖含量的測定方法及原理？答：（1）如果糖樣中沒有別的帶醛基的有機(jī)物，可以用DNS法測還原糖；（2）如果糖樣中有別的帶醛基的有機(jī)物，可以考慮采用高效液相色譜法（HPLC）；（3）其它也有一些方法，比如一樓的碘量法等等。但是，有不足，一是不精確，二是試劑有毒或者購買困難。十、實(shí)驗(yàn)小結(jié) 通過本次實(shí)驗(yàn)，我學(xué)習(xí)并掌握了3,5-二硝基水楊酸法測定纖維素酶活力以及還原糖含量的原理以及操作，我了解了相關(guān)纖維素酶、還原糖以及3,5-二硝基水楊酸的基本知識(shí)，我鞏固了分光光度計(jì)的使用以及操作和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，我還學(xué)習(xí)了有關(guān)酶活力的概念?？傊?，通過這次實(shí)驗(yàn)，我收獲了很多，從操作以及知識(shí)全方面得到了提升。 但是

31、，通過這次實(shí)驗(yàn)，我也認(rèn)識(shí)到了自己的一點(diǎn)不足，在這次做實(shí)驗(yàn)的過程中，因?yàn)楸壬軘?shù)量較多，而且是兩個(gè)實(shí)驗(yàn)原理類似的實(shí)驗(yàn)合并到一起上課，所以自己操作時(shí)一開始有一點(diǎn)混亂，比色管寫標(biāo)簽也沒及時(shí)到位，一開始有點(diǎn)手忙腳亂，但是后來就好了。由這次實(shí)驗(yàn)，我明白，以后實(shí)驗(yàn)開始前，不要急于下手開始做，要先快速想一想這個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，小組內(nèi)兩個(gè)人大致分一下工再開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，有條不紊才能做得又好又快。十一、參考文獻(xiàn)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（第四版） 陳鈞輝、李俊、張冬梅、張?zhí)?、朱婉華編；科學(xué)出版社出版。十二、附錄1、纖維素酶的分類：（1）葡聚糖內(nèi)切酶：能在纖維素酶分子內(nèi)部任意斷裂-1，4糖苷鍵。 （2）葡聚糖外切酶或纖維二糖酶：能從纖維分子的非還原端依次裂解1，4糖苷鍵釋放出纖維二糖分子。（3）葡萄糖苷酶：能將纖維二糖及其他低分子