不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點課件

1、不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點第六章第六章 個別細(xì)胞和組織個別細(xì)胞和組織(zzh)的培養(yǎng)的培養(yǎng)第一頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點類型：類型：正常正常(zhngchng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)第二頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點第一節(jié)第一節(jié) 正常正常(zhngchng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)v正常細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時都正常細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時都不易生長，建立不易生長，建立細(xì)胞系更難。細(xì)胞系更難。v正常細(xì)胞難培養(yǎng)的正常細(xì)胞難培養(yǎng)的原因原因(yunyn)是它們是分化的是它們是分化的細(xì)胞，對體外生存條件要求嚴(yán)格細(xì)胞，對體外生存條件要求嚴(yán)格.v但只要一切條件適當(dāng)仍有培養(yǎng)成功可能。但只要一切條件

2、適當(dāng)仍有培養(yǎng)成功可能。第三頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點一、上皮細(xì)胞類培養(yǎng)一、上皮細(xì)胞類培養(yǎng)(piyng)v上皮細(xì)胞可來源于外、內(nèi)、中三個胚層；上皮細(xì)胞可來源于外、內(nèi)、中三個胚層；v培養(yǎng)中只有培養(yǎng)中只有(zhyu)源于外和內(nèi)胚層的細(xì)胞能反映源于外和內(nèi)胚層的細(xì)胞能反映出上皮細(xì)胞的特征，細(xì)胞呈膜狀生長的特點。出上皮細(xì)胞的特征，細(xì)胞呈膜狀生長的特點。第四頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點v上皮細(xì)胞培養(yǎng)有三個難點：上皮細(xì)胞培養(yǎng)有三個難點：需求特殊底物，如在底物上涂有膠原底層則需求特殊底物，如在底物上涂有膠原底層則利于利于(ly)細(xì)胞生長；細(xì)胞生長；需求特殊培養(yǎng)基；需求特殊培養(yǎng)基；與上皮細(xì)胞相鄰

3、的成纖維細(xì)胞常與上皮細(xì)胞與上皮細(xì)胞相鄰的成纖維細(xì)胞常與上皮細(xì)胞同時混雜生長，并常壓過上皮細(xì)胞。同時混雜生長，并常壓過上皮細(xì)胞。v純化和延長上皮細(xì)胞生存期純化和延長上皮細(xì)胞生存期是上皮細(xì)胞培養(yǎng)是上皮細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵之一。的關(guān)鍵之一。第五頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(一一)表皮細(xì)胞培養(yǎng)表皮細(xì)胞培養(yǎng)1特點特點：v在有膠原的底物上易生長在有膠原的底物上易生長；v把人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以把人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以3T3 細(xì)胞為飼養(yǎng)細(xì)胞為飼養(yǎng)(syng)層層(用射線照射后用射線照射后)上上時，細(xì)胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。時，細(xì)胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。v降低降低pH、Ca2+的

4、含量和溫度等，均利于表皮細(xì)胞生長。的含量和溫度等，均利于表皮細(xì)胞生長。v向培養(yǎng)基中加氫化可的松向培養(yǎng)基中加氫化可的松(10 g/m1)、10-6M的異丙基腎上腺素的異丙基腎上腺素(Isoproterenol) 和和10 ng/m1 促表皮生長因子促表皮生長因子(EGF) 能促表皮能促表皮細(xì)胞生長。細(xì)胞生長。第六頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點v【飼細(xì)胞】【飼細(xì)胞】飼細(xì)胞飼細(xì)胞(Feeder Cells)也稱滋養(yǎng)細(xì)也稱滋養(yǎng)細(xì)胞，是一層經(jīng)過射線照射或絲裂霉素傷害處理的、胞，是一層經(jīng)過射線照射或絲裂霉素傷害處理的、用作克隆細(xì)胞附著底物的細(xì)胞層。用作克隆細(xì)胞附著底物的細(xì)胞層。v飼細(xì)胞作用：飼細(xì)胞作

5、用：v有同化有同化(tnghu)營養(yǎng)液的能力營養(yǎng)液的能力。v飼細(xì)胞能促克隆細(xì)胞的生長，利于克隆的形成飼細(xì)胞能促克隆細(xì)胞的生長，利于克隆的形成?？??？寺⌒纬珊箫暭?xì)胞漸死亡，換液時清除。隆形成后飼細(xì)胞漸死亡，換液時清除。第七頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點飼細(xì)胞的制備：飼細(xì)胞的制備：(1)取原代培養(yǎng)的取原代培養(yǎng)的人或動物胚胎成纖維細(xì)胞人或動物胚胎成纖維細(xì)胞，90% 匯合時匯合時制成細(xì)胞懸液，再按制成細(xì)胞懸液，再按103 細(xì)胞細(xì)胞/毫升重新接種培養(yǎng)；毫升重新接種培養(yǎng)；(2)在細(xì)胞半?yún)R合時，準(zhǔn)備在細(xì)胞半?yún)R合時，準(zhǔn)備0.25g/ml 的絲裂霉素，按的絲裂霉素，按2ug/105 細(xì)胞的量加入到培養(yǎng)瓶中

6、過夜；或用射線單次照細(xì)胞的量加入到培養(yǎng)瓶中過夜；或用射線單次照射，劑量射，劑量3050 戈瑞戈瑞(Gy)；(3)細(xì)胞經(jīng)上述處理后，細(xì)胞經(jīng)上述處理后，Hanks 液漂洗兩次、更換培養(yǎng)液、液漂洗兩次、更換培養(yǎng)液、再培養(yǎng)再培養(yǎng)24 小時小時(xiosh)，胰蛋白酶消化細(xì)胞制成懸液，按，胰蛋白酶消化細(xì)胞制成懸液，按5104/ml接種入新培養(yǎng)基中；接種入新培養(yǎng)基中；(4)48 小時后，即可用于細(xì)胞克隆之用。小時后，即可用于細(xì)胞克隆之用。第八頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點2表皮細(xì)胞培養(yǎng)程序：表皮細(xì)胞培養(yǎng)程序：(1) 取材取材：取外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，以角化層薄者為佳，早產(chǎn)：取外科植皮或手術(shù)殘余

7、皮膚小塊，以角化層薄者為佳，早產(chǎn)(zochn)流產(chǎn)兒皮膚更好，切成流產(chǎn)兒皮膚更好，切成0.5 1cm2小塊；小塊；(2) EDTA 處理處理：先置入：先置入0.02 EDTA 中室溫置中室溫置5 分鐘。分鐘。(3) 冷消化冷消化：換入：換入0.25% 胰蛋白酶中，置胰蛋白酶中，置4過夜；過夜；(4) 分離：分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開；取出皮塊，用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開；第九頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(5) 溫消化：溫消化：取出表皮單獨處理；用剪刀剪成更小的塊后，置入新的取出表皮單獨處理；用剪刀剪成更小的塊后，置入新的0.25胰蛋白酶中，胰蛋白酶中，37再

8、消化再消化30 60 分鐘；分鐘；(6)制細(xì)胞懸液：制細(xì)胞懸液：用吸管輕輕反復(fù)吹打，使成細(xì)胞懸液；用吸管輕輕反復(fù)吹打，使成細(xì)胞懸液；(7) 加培養(yǎng)液：加培養(yǎng)液：通過通過80 目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心(lxn)，吸上，吸上清，直接加入清，直接加入Eagle 液和液和20小牛血清小牛血清.(8)培養(yǎng)：培養(yǎng)：接種入碟皿中，接種入碟皿中，CO2 溫箱培養(yǎng)。溫箱培養(yǎng)。第十頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點v注意事項：注意事項：冷消化目的在于使表皮和真皮結(jié)合冷消化目的在于使表皮和真皮結(jié)合松散；松散；如冷消化后分離如冷消化后分離(fnl)下來的表皮膜自身也下來的表皮膜自身也

9、已松散，此時亦可直接置入已松散，此時亦可直接置入PBS 中用吸管吹中用吸管吹打制備細(xì)胞懸液；不再經(jīng)過第二次消化。打制備細(xì)胞懸液；不再經(jīng)過第二次消化。第十一頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(二二) 胃上皮細(xì)胞培養(yǎng)胃上皮細(xì)胞培養(yǎng)(piyng)v適于胃上皮細(xì)胞生長的條件是：適于胃上皮細(xì)胞生長的條件是：膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化法并用消化細(xì)胞；膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化法并用消化細(xì)胞；應(yīng)用膠原底物培養(yǎng)應(yīng)用膠原底物培養(yǎng)(piyng)；制備含有特定成分的培養(yǎng)基；制備含有特定成分的培養(yǎng)基；第十二頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點v培養(yǎng)程序：培養(yǎng)程序：(1) 取材取材：取胃潰瘍或胃癌手術(shù)切除胃標(biāo)本遠端：取胃潰瘍

10、或胃癌手術(shù)切除胃標(biāo)本遠端非病變區(qū)非病變區(qū)粘膜少許；粘膜少許；(2) 清洗清洗：用含慶大霉素：用含慶大霉素(400g/m1)和兩性霉素和兩性霉素(2g/m1 的的Hanks)液漂洗后，用鈍器剝離下粘膜，剪成液漂洗后，用鈍器剝離下粘膜，剪成1mm大??；大??；(3) 消化消化：在：在I 型膠原酶型膠原酶和和透明質(zhì)酸酶透明質(zhì)酸酶中，于中，于37中消化中消化80 分鐘；分鐘；(4) 離心離心：收集細(xì)胞：收集細(xì)胞(xbo)懸液，懸液，800 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分離心后，分離心后，Hanks 液漂洗兩次；液漂洗兩次；第十三頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(5) 接種接種：末次離心后加入含有：末次離心后加入含有1 2

11、胎牛胎牛血清血清(xuqng)的完全培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)基，接種入不同孔數(shù)的，接種入不同孔數(shù)的培養(yǎng)板中；接種量依不同實驗?zāi)康亩?。培養(yǎng)板中；接種量依不同實驗?zāi)康亩?。v細(xì)胞接種后一般在細(xì)胞接種后一般在16 小時內(nèi)貼壁，細(xì)胞呈多小時內(nèi)貼壁，細(xì)胞呈多角形，成島狀或片狀生長，以后逐漸聯(lián)接成角形，成島狀或片狀生長，以后逐漸聯(lián)接成片。初代培養(yǎng)可維持片。初代培養(yǎng)可維持2 3 周，第一周末達周，第一周末達高峰，最后逐漸衰退剝落。高峰，最后逐漸衰退剝落。第十四頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(三三) 肝細(xì)胞培養(yǎng)肝細(xì)胞培養(yǎng)(piyng)v肝臟具有取材方便肝臟具有取材方便(fngbin)和易于生長的優(yōu)點，和易于生

12、長的優(yōu)點，能獲得典型上皮細(xì)胞培養(yǎng)。能獲得典型上皮細(xì)胞培養(yǎng)。1初代組織塊培養(yǎng)：初代組織塊培養(yǎng)：v肝組織做組織塊培養(yǎng)效果很好。取新鮮肝臟，肝組織做組織塊培養(yǎng)效果很好。取新鮮肝臟，先剝除被膜和血管等纖維成分，用刀或剪刀先剝除被膜和血管等纖維成分，用刀或剪刀把肝剪成把肝剪成1mm3 左右的小塊，采用貼壁培養(yǎng)左右的小塊，采用貼壁培養(yǎng)法。肝組織易于貼壁，生長力好，一般次日法。肝組織易于貼壁，生長力好，一般次日即可出現(xiàn)生長暈。即可出現(xiàn)生長暈。第十五頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點2初代消化法培養(yǎng)：初代消化法培養(yǎng)：(1) 把肝組織切成把肝組織切成2 4 立方毫米的小塊，用不合鈣鎂的立方毫米的小塊，用不合鈣

13、鎂的BSS 液液洗兩次；洗兩次；(2) 移入移入1:1 的的0.1胰蛋白酶和胰蛋白酶和0.1膠原酶膠原酶(都用無鈣鎂都用無鈣鎂BSS 配制配制) 中，中，4冷消化冷消化10 12 小時后，通過小時后，通過250 微米和微米和64 微米尼龍網(wǎng)或不銹鋼紗網(wǎng)濾過微米尼龍網(wǎng)或不銹鋼紗網(wǎng)濾過(用紗布濾過亦可用紗布濾過亦可)；(3) 收集細(xì)胞收集細(xì)胞(xbo)、BSS 液洗液洗1 2 次、計數(shù)、接種培養(yǎng)；次、計數(shù)、接種培養(yǎng)；第十六頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點3肝臟灌流法：肝臟灌流法：v需用全肝，以較小動物如小鼠和大鼠為好需用全肝，以較小動物如小鼠和大鼠為好。(1) 無菌解剖動物，取出肝臟，先用無菌

14、解剖動物，取出肝臟，先用BSS 洗除血污；洗除血污；(2) 取取5ml 注射器一支注射器一支(y zh)，吸取消化液后，把，吸取消化液后，把注射器頭輕輕插入肝注射器頭輕輕插入肝管中管中，用線繩結(jié)扎牢固，以防消化液漏出，輕輕把消化液注入膽管系統(tǒng)，用線繩結(jié)扎牢固，以防消化液漏出，輕輕把消化液注入膽管系統(tǒng)，并不時輕柔壓肝臟，以便消化液進入肝小葉中；并不時輕柔壓肝臟，以便消化液進入肝小葉中； 消化液在肝內(nèi)停留消化液在肝內(nèi)停留20 30 分后，在吸出消化液的同時并輕柔壓肝臟，分后，在吸出消化液的同時并輕柔壓肝臟，以使肝細(xì)胞脫落和消化液吸出；以使肝細(xì)胞脫落和消化液吸出；第十七頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培

15、養(yǎng)特點(3) 待吸凈消化液后，注入待吸凈消化液后，注入(zh r)離心管中，低離心管中，低速離心分離，用速離心分離，用RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)(較較其它培養(yǎng)基為好其它培養(yǎng)基為好)，能獲得較純的肝上皮細(xì)，能獲得較純的肝上皮細(xì)胞和獲較好的效果。胞和獲較好的效果。第十八頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(四四) 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)(piyng)v應(yīng)用材料：應(yīng)用材料：人臍帶臍靜脈、動物大動脈等，人臍帶臍靜脈、動物大動脈等，用灌流消化用灌流消化(xiohu)法獲取細(xì)胞最為簡便。法獲取細(xì)胞最為簡便。第十九頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(1)取產(chǎn)后的新鮮臍帶；如不立即培養(yǎng)取產(chǎn)后

16、的新鮮臍帶；如不立即培養(yǎng)(piyng)可可保存于保存于4中，但不宜超過中，但不宜超過12 小時；小時；無菌無菌剪取長剪取長10 15 厘米一段厘米一段。 其它如胚胎和幼體動物的大血管，亦可用其它如胚胎和幼體動物的大血管，亦可用于培養(yǎng)；于培養(yǎng)；(2) 先用三通注射器吸先用三通注射器吸溫溫PBS 液注入臍帶的臍液注入臍帶的臍靜脈中，洗除殘血靜脈中，洗除殘血；注入口處宜用線繩結(jié)；注入口處宜用線繩結(jié)扎，以防液體返流；扎，以防液體返流；第二十頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(3) 用血管鉗夾緊臍帶一端，從另端向臍靜脈中用血管鉗夾緊臍帶一端，從另端向臍靜脈中徐徐注入最終濃度為徐徐注入最終濃度為0.1的

17、膠原酶的膠原酶，待末端，待末端出現(xiàn)液體后結(jié)扎之，令充滿血管，注入口亦應(yīng)出現(xiàn)液體后結(jié)扎之，令充滿血管，注入口亦應(yīng)結(jié)扎，以防液體返流，結(jié)扎，以防液體返流，消化消化3 10 分鐘分鐘；(4) 吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液，注入離心管中吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液，注入離心管中；為獲取更多細(xì)胞，可再注入溫為獲取更多細(xì)胞，可再注入溫PBS 沖洗沖洗2 3 次徹底清除干凈殘余細(xì)胞，一并注入離心管中次徹底清除干凈殘余細(xì)胞，一并注入離心管中離心；離心；(5) 吸除上清，加吸除上清，加1640 培養(yǎng)培養(yǎng)(piyng)液，制成細(xì)胞液，制成細(xì)胞懸液，接種入瓶皿中培養(yǎng)懸液，接種入瓶皿中培養(yǎng)(piyng)，順利時，順利時2 3

18、 天內(nèi)細(xì)胞即可長成單層。天內(nèi)細(xì)胞即可長成單層。第二十一頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點第二十二頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點v人臍帶易于獲得，培養(yǎng)效果好；細(xì)胞生長后，人臍帶易于獲得，培養(yǎng)效果好；細(xì)胞生長后，一般傳一般傳6 7 代后即衰退，難以長期維持。用代后即衰退，難以長期維持。用兔血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)較好，可傳兔血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)較好，可傳10 30 代；代；v不同不同(b tn)部位血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)性狀不同部位血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)性狀不同(b tn)，對各種作用因素反應(yīng)亦有很大差別。，對各種作用因素反應(yīng)亦有很大差別。第二十三頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(五五) 毛細(xì)血管毛細(xì)血管

19、(mo x xu un)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)v毛細(xì)血管毛細(xì)血管(mo x xu un)細(xì)小，結(jié)構(gòu)簡單，內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)小，結(jié)構(gòu)簡單，內(nèi)皮細(xì)胞外有較多的結(jié)締組織，進行分離培養(yǎng)有很大外有較多的結(jié)締組織，進行分離培養(yǎng)有很大困難。困難。v近年毛細(xì)血管培養(yǎng)已獲成功；近年毛細(xì)血管培養(yǎng)已獲成功；v利用人的小兒包皮、人脾臟、牛腎上腺、癌利用人的小兒包皮、人脾臟、牛腎上腺、癌組織組織(如卵巢癌如卵巢癌) 等均可；等均可；第二十四頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點1材料材料(cilio)：v腫瘤條件培養(yǎng)基制備腫瘤條件培養(yǎng)基制備(1) 取取C3H 小鼠的小鼠的S-180 實體肉瘤組織實體肉瘤組織；(2) 胰蛋白酶消

20、化胰蛋白酶消化，Dulbecco 改良改良Eagle 氏氏培養(yǎng)液培養(yǎng)液15m1 (含含10小牛血清小牛血清) 種到培養(yǎng)瓶種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；中培養(yǎng)；第二十五頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(3) 在細(xì)胞生長接近完全匯合時，收集培養(yǎng)液制成條件在細(xì)胞生長接近完全匯合時，收集培養(yǎng)液制成條件(tiojin)培養(yǎng)基；再培養(yǎng)基；再用含用含10小牛血清的新培養(yǎng)液后，也每隔兩天收集一次，可獲多量條小牛血清的新培養(yǎng)液后，也每隔兩天收集一次，可獲多量條件件(tiojin)培養(yǎng)基；培養(yǎng)基；(4) 4000 轉(zhuǎn)分離心后，再通過轉(zhuǎn)分離心后，再通過0.22m 微孔濾膜濾過，微孔濾膜濾過，-20凍存?zhèn)鋬龃鎮(zhèn)溆糜?臨用前融

21、解臨用前融解)。v凝膠底層制備凝膠底層制備(1) 取取60 mm Falcon 產(chǎn)培養(yǎng)皿，加產(chǎn)培養(yǎng)皿，加1% Difco 產(chǎn)明膠產(chǎn)明膠(用不合鈣和鎂的用不合鈣和鎂的Hanks 液配制液配制)，鋪蓋瓶底，形成薄層；，鋪蓋瓶底，形成薄層；(2) 置置4過夜；用前再用少許培養(yǎng)液沖洗一次。過夜；用前再用少許培養(yǎng)液沖洗一次。第二十六頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點2初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)(1) 取材取材：取新鮮牛腎上腺數(shù)個，先用：取新鮮牛腎上腺數(shù)個，先用Hanks 液液洗除血污；洗除血污；(2) 消化：消化：剝除被膜，分離出皮質(zhì)剝除被膜，分離出皮質(zhì)(pzh)，切成，切成l mm3 小塊，加小塊，加0.5膠

22、原酶室溫中消化膠原酶室溫中消化1 小時；小時；每隔每隔10 分鐘用吸管吹打懸液令消化充分；分鐘用吸管吹打懸液令消化充分；(3)過濾：過濾：通過不銹鋼紗網(wǎng)濾過，網(wǎng)眼要求只允通過不銹鋼紗網(wǎng)濾過，網(wǎng)眼要求只允許能通過小于許能通過小于110 微米長的毛細(xì)血管小段；微米長的毛細(xì)血管小段；(4)離心：離心：650 rpm，4，離心，離心7 分鐘后，棄掉分鐘后，棄掉上清膠原酶；上清膠原酶；第二十七頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(5)再離心：再離心：沉淀物用培養(yǎng)液重懸并離心，再重懸，再離心，沉淀物用培養(yǎng)液重懸并離心，再重懸，再離心，共兩次；共兩次；(6) 制細(xì)胞懸液：制細(xì)胞懸液：末次沉淀物仍用含末次沉淀

23、物仍用含10小牛血清的小牛血清的Dulbecco 改良改良Eag1e 氏培養(yǎng)液重懸后，稍吹打；氏培養(yǎng)液重懸后，稍吹打；(7)接種：接種：接種入鋪有明膠底層的培養(yǎng)皿中，接種入鋪有明膠底層的培養(yǎng)皿中，37培養(yǎng)；在培養(yǎng)；在培養(yǎng)頭培養(yǎng)頭1 3 小時中，毛細(xì)血管小段和內(nèi)皮細(xì)胞最先貼附小時中，毛細(xì)血管小段和內(nèi)皮細(xì)胞最先貼附于底物上，而腎上腺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞卻仍在培養(yǎng)液中漂于底物上，而腎上腺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞卻仍在培養(yǎng)液中漂??；??；(8)換液：換液：吸除培養(yǎng)液，再吸除培養(yǎng)液，再加入加入(jir)腫瘤條件培養(yǎng)液腫瘤條件培養(yǎng)液；每兩；每兩天換液一次。毛細(xì)血管小段一般成自天換液一次。毛細(xì)血管小段一般成自1 4 個內(nèi)

24、皮細(xì)胞，個內(nèi)皮細(xì)胞，v以后每個小段在底物上慢慢展成特殊形態(tài)的細(xì)胞島，能持續(xù)以后每個小段在底物上慢慢展成特殊形態(tài)的細(xì)胞島，能持續(xù)2 5 天。天。第二十八頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點3毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)：毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)：(1) 初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)2 3 天后，鏡下確認(rèn)幾個毛細(xì)血天后，鏡下確認(rèn)幾個毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞島，在培養(yǎng)皿背面，用不脫色筆劃管內(nèi)皮細(xì)胞島，在培養(yǎng)皿背面，用不脫色筆劃圈圈起；圈圈起；(2) 鏡下檢查，如圈內(nèi)殘有非內(nèi)皮細(xì)胞時，可用鏡下檢查，如圈內(nèi)殘有非內(nèi)皮細(xì)胞時，可用顯微顯微(xin wi)細(xì)針在倒置顯微細(xì)針在倒置顯微(xin wi)鏡下挑除；用鏡下挑除；用細(xì)胞解剖

25、器也可，宜在凈化臺無菌氣流中、打細(xì)胞解剖器也可，宜在凈化臺無菌氣流中、打開培養(yǎng)皿蓋進行，但時間不宜過長開培養(yǎng)皿蓋進行，但時間不宜過長(15 20 分分鐘鐘)；圈外非內(nèi)皮細(xì)胞可用無菌膠刮刮除；圈外非內(nèi)皮細(xì)胞可用無菌膠刮刮除；第二十九頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(3) 用培養(yǎng)液漂洗兩次，以去除漂浮細(xì)胞；用培養(yǎng)液漂洗兩次，以去除漂浮細(xì)胞；(4) 剩余內(nèi)皮細(xì)胞島如小剩余內(nèi)皮細(xì)胞島如小(5 20 個細(xì)胞個細(xì)胞) 而少時，生長增殖而少時，生長增殖常變得緩慢或完全不生長，此時需加入常變得緩慢或完全不生長，此時需加入(jir)3T3等飼細(xì)胞；等飼細(xì)胞；飼細(xì)胞接種量為飼細(xì)胞接種量為4000 細(xì)胞細(xì)胞cm

26、2；(5) 當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞充滿所有飼細(xì)胞空間后，用胰蛋白酶消化、離當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞充滿所有飼細(xì)胞空間后，用胰蛋白酶消化、離心、加入腫瘤條件培養(yǎng)基；心、加入腫瘤條件培養(yǎng)基；(6) 接種入明膠底物皿中繼續(xù)培養(yǎng)接種入明膠底物皿中繼續(xù)培養(yǎng)(飼細(xì)胞死亡被淘汰飼細(xì)胞死亡被淘汰)，細(xì)胞增，細(xì)胞增殖生長匯合后，按殖生長匯合后，按1:5 傳代。傳代。第三十頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點第三十一頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點二、結(jié)締組織二、結(jié)締組織(jid-zzh)類細(xì)胞培養(yǎng)類細(xì)胞培養(yǎng)(一一) 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)v包括人在內(nèi)的各種成纖維細(xì)胞都很容易包括人在內(nèi)的各種成纖維細(xì)胞都很容易(rngy)培養(yǎng)，也

27、是其它組織培養(yǎng)時的副產(chǎn)物，極易培養(yǎng)，也是其它組織培養(yǎng)時的副產(chǎn)物，極易獲得。獲得。v用人或動物胚體為好；動物可用小鼠或雞胚，用人或動物胚體為好；動物可用小鼠或雞胚，去頭和內(nèi)臟，剪成小碎塊后，用胰蛋白酶消去頭和內(nèi)臟，剪成小碎塊后，用胰蛋白酶消化法培養(yǎng)；如為人胚，可取皮膚培養(yǎng)。幼兒化法培養(yǎng)；如為人胚，可取皮膚培養(yǎng)。幼兒包皮是培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的很好對象。包皮是培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的很好對象。第三十二頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點小鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)(piyng)條件v12.514.5d胎齡的小鼠胎兒分離效果最好；胎齡的小鼠胎兒分離效果最好；v最佳培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基為DMEM添加添加15%小牛血清；小牛血清

28、；v第第3代細(xì)胞增殖最旺盛；代細(xì)胞增殖最旺盛；v室溫條件室溫條件(tiojin)下，下，0.125%胰蛋白酶消化時間胰蛋白酶消化時間以以810min為宜。為宜。v在培養(yǎng)在培養(yǎng)ES細(xì)胞時，應(yīng)選擇第細(xì)胞時，應(yīng)選擇第35代的小鼠成代的小鼠成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。第三十三頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點小鼠成纖維細(xì)胞小鼠成纖維細(xì)胞(xbo)；細(xì)胞細(xì)胞(xbo)來源：來源：swiss小鼠胚胎小鼠胚胎 第三十四頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點第三十五頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(二二) 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)v巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、巨噬

29、細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。v巨噬細(xì)胞容易獲得，便于巨噬細(xì)胞容易獲得，便于(biny)培養(yǎng)，并可進行純化。但屬培養(yǎng)，并可進行純化。但屬不繁殖型細(xì)胞群，難以長期生存，好的條件下僅能生活不繁殖型細(xì)胞群，難以長期生存，好的條件下僅能生活2 3周，因之多用作初代培養(yǎng)周，因之多用作初代培養(yǎng)。v巨噬細(xì)胞也能建成無限細(xì)胞系；大多來自小鼠，如巨噬細(xì)胞也能建成無限細(xì)胞系；大多來自小鼠，如P388D-1、J774A1、RAW309、Cr. 1 等。等。第三十六頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點1培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)技術(shù)(jsh)要點：要點：

30、v來源和取材來源和取材 巨噬細(xì)胞可來源于人胸水、腹巨噬細(xì)胞可來源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。水、血和透析液等材料。v實驗多從動物血液、肺、脾和胸腹腔獲取，實驗多從動物血液、肺、脾和胸腹腔獲取，其中以從動物腹腔取材最常用。用其中以從動物腹腔取材最常用。用40g 的的PHA 注入腹腔中，能產(chǎn)生注入腹腔中，能產(chǎn)生6 8106 個細(xì)個細(xì)胞，而且無刺激性，效果較好。胞，而且無刺激性，效果較好。第三十七頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點2培養(yǎng)方法：培養(yǎng)方法：v培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各種方法和各種來源獲取細(xì)胞，其中以培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各種方法和各種來源獲取細(xì)胞，其中以小鼠腹腔取材法最為實用。人的材料除來源不

31、同外，培養(yǎng)小鼠腹腔取材法最為實用。人的材料除來源不同外，培養(yǎng)方法大同小異。方法大同小異。v程序程序(1) 實驗前三天，向每只小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫基乙酸肉實驗前三天，向每只小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫基乙酸肉湯湯1ml (勿注入腸內(nèi)勿注入腸內(nèi))；(2) 引頸殺死動物；手提鼠尾將全鼠浸入引頸殺死動物；手提鼠尾將全鼠浸入70酒精中酒精中3 5 秒；秒；(3) 置動物于解剖臺上，用針頭固定置動物于解剖臺上，用針頭固定(gdng)四肢，雙手持鑷撕開皮四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁；膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁；(4) 再用再用70酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸酒精擦洗腹膜壁后

32、，用注射器吸10ml Eag1e 液注入腹腔中，同時從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，令液體液注入腹腔中，同時從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內(nèi)充分流動；在腹腔內(nèi)充分流動；第三十八頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(5) 用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側(cè)，使腹腔用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側(cè)，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內(nèi)；中液體集于針頭下吸取入針管內(nèi)；(6) 小心拔出針頭，把液體注入離心管中，小心拔出針頭，把液體注入離心管中， (4)離心離心10 分分鐘后，去上清，加鐘后，去上清，加10 ml Eagle 培養(yǎng)基；培養(yǎng)基；(7) 計數(shù)細(xì)胞，每只小鼠可產(chǎn)生計數(shù)細(xì)胞，每只小鼠可產(chǎn)生

33、20 30106 細(xì)胞，其細(xì)胞，其中中90為巨噬細(xì)胞；為巨噬細(xì)胞；(8) 為獲取為獲取3105 個貼附細(xì)胞平方厘米，需接種個貼附細(xì)胞平方厘米，需接種2.5106m1；(9) 為純化培養(yǎng)為純化培養(yǎng)(piyng)細(xì)胞，去除其它白細(xì)胞，接種數(shù)小細(xì)胞，去除其它白細(xì)胞，接種數(shù)小時后，去除培養(yǎng)時后，去除培養(yǎng)(piyng)液，用液，用Eagle 液沖洗液沖洗1 2 次后，次后，再加新再加新Eagle 培養(yǎng)培養(yǎng)(piyng)液置液置37 CO2 溫箱中培養(yǎng)。溫箱中培養(yǎng)。第三十九頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點第四十頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點三、肌組織三、肌組織(zzh)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)v以心肌和

34、骨骼肌培養(yǎng)較為實用。以心肌和骨骼肌培養(yǎng)較為實用。(一一) 骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)v動物胚或幼體的動物胚或幼體的大腿肌組織為最好的培養(yǎng)材料大腿肌組織為最好的培養(yǎng)材料。取材常。取材常用生后用生后1 2 天的乳鼠天的乳鼠(Wistar 大鼠更好大鼠更好)。(1) 取材取材：殺死動物，無菌取大腿肌組織，切成殺死動物，無菌取大腿肌組織，切成0.3 0.5 厘米厘米小塊；小塊；(2)消化消化：用不含鈣鎂離子的用不含鈣鎂離子的Hanks 液配的液配的0.25胰蛋白胰蛋白酶酶(y dn bi mi)消化，無菌紗網(wǎng)或紗布濾過，合成培養(yǎng)基消化，無菌紗網(wǎng)或紗布濾過，合成培養(yǎng)基加加10小牛小牛(或馬或馬)血清培

35、養(yǎng)，血清培養(yǎng)，為促進分化可加為促進分化可加1 的胎汁；的胎汁；第四十一頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(3)接種：接種：細(xì)胞接種量為細(xì)胞接種量為2106/皿；接種在膠原或明膠的底皿；接種在膠原或明膠的底物上能促進細(xì)胞分化。物上能促進細(xì)胞分化。v明膠制備比較簡單，常用明膠制備比較簡單，常用Hanks 液配的液配的0.01明膠。明膠。v生長特點：生長特點：細(xì)胞生長開始呈紡錘形，培養(yǎng)細(xì)胞生長開始呈紡錘形，培養(yǎng)50 52 小時后小時后將出現(xiàn)融合形成肌細(xì)胞狀多核纖維。數(shù)日后融合停止，此將出現(xiàn)融合形成肌細(xì)胞狀多核纖維。數(shù)日后融合停止，此時能觀察時能觀察(gunch)到橫紋。一般在融合后二三天內(nèi)能見到收

36、到橫紋。一般在融合后二三天內(nèi)能見到收縮現(xiàn)象；因收縮運動有時可導(dǎo)致細(xì)胞從底物脫離?？s現(xiàn)象；因收縮運動有時可導(dǎo)致細(xì)胞從底物脫離。第四十二頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(二) 心肌細(xì)胞培養(yǎng)(piyng)v最常用材料：最常用材料：v雞胚心肌、小鼠、大鼠以及人胎兒心肌等都雞胚心肌、小鼠、大鼠以及人胎兒心肌等都可應(yīng)用可應(yīng)用。v心肌是比較容易培養(yǎng)和生長心肌是比較容易培養(yǎng)和生長(shngzhng)的組織，的組織，可應(yīng)用多種方法進行培養(yǎng)，如可應(yīng)用多種方法進行培養(yǎng)，如懸滴培養(yǎng)、組懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法等，主要取等，主要取心室肌心室肌培培養(yǎng)，均能獲得良好的生長效果。養(yǎng)，均能獲得良

37、好的生長效果。第四十三頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點v程序程序(1) 選新鮮受精雞卵，置溫箱中孵育選新鮮受精雞卵，置溫箱中孵育(f y)(溫箱中放有水槽，以維持溫箱中放有水槽，以維持箱內(nèi)濕度箱內(nèi)濕度)；每日翻動一次；每日翻動一次(180 度度)，孵育，孵育(f y)9 12 天；天；(2) 取雞胎；取雞胎；(3) 用眼科剪剪開胸腔，剝出心臟，置入皿中用用眼科剪剪開胸腔，剝出心臟，置入皿中用Hanks 液漂洗液漂洗1 2 次；次；(4) 小心剪除大的動靜脈，保留心室??；用小心剪除大的動靜脈，保留心室??；用組織塊或消化培養(yǎng)法均可組織塊或消化培養(yǎng)法均可。初代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形，初代培養(yǎng)的雞

38、胚心肌呈紡錘形，v純化及生長特點：純化及生長特點：常雜有成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞；常雜有成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞；心肌細(xì)胞亦較其它心肌細(xì)胞亦較其它成分貼壁慢，可反復(fù)貼壁法排除其它細(xì)胞成分。在培養(yǎng)成功時，相成分貼壁慢，可反復(fù)貼壁法排除其它細(xì)胞成分。在培養(yǎng)成功時，相差顯微鏡下可觀察到橫紋；一周后便可出現(xiàn)節(jié)律性收縮現(xiàn)象。差顯微鏡下可觀察到橫紋；一周后便可出現(xiàn)節(jié)律性收縮現(xiàn)象。第四十四頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)(piyng)第四十五頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點第四十六頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點四、神經(jīng)組織細(xì)胞培養(yǎng)四、神經(jīng)組織細(xì)胞培養(yǎng)v神經(jīng)組織主

39、要由兩種神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)組織主要由兩種神經(jīng)細(xì)胞(xbo)(神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞(xbo)）組成。）組成。v神經(jīng)元為高度分化的細(xì)胞，在組織發(fā)生晚期已失掉增殖神經(jīng)元為高度分化的細(xì)胞，在組織發(fā)生晚期已失掉增殖能力，對生存條件要求高，能力，對生存條件要求高，只有在適宜情況下，如只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或在加入神經(jīng)生長因子接種在膠原底層上，或在加入神經(jīng)生長因子(NGF) 和膠質(zhì)細(xì)胞因子時，才能生存，并可能出現(xiàn)一定和膠質(zhì)細(xì)胞因子時，才能生存，并可能出現(xiàn)一定程度的分化現(xiàn)象，如長出突起等，但卻難使之增程度的分化現(xiàn)象，如長出突起等，但卻難使之增殖；殖；即使培養(yǎng)胚胎組織情況也是如此。

40、即使培養(yǎng)胚胎組織情況也是如此。第四十七頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點v神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞為較易培養(yǎng)成分，它分少突、星神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞為較易培養(yǎng)成分，它分少突、星形和小膠質(zhì)三種形和小膠質(zhì)三種。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元有共神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元有共存存(gngcn)關(guān)系。關(guān)系。第四十八頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞(xbo)第四十九頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點大鼠大鼠c6膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)細(xì)胞(xbo)第五十頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點第五十一頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點v(一一) 初代培養(yǎng)初代培養(yǎng) 神經(jīng)元能發(fā)生一定分化現(xiàn)象，如生長突起，但神經(jīng)元能發(fā)生一定

41、分化現(xiàn)象，如生長突起，但因無增殖能力，最后衰退死亡；但神經(jīng)膠質(zhì)尤因無增殖能力，最后衰退死亡；但神經(jīng)膠質(zhì)尤以星形細(xì)胞能繼續(xù)以星形細(xì)胞能繼續(xù)(jx)生存和分裂增殖。生存和分裂增殖。v(二二) 傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng) 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。不僅能獲得生長的膠質(zhì)細(xì)胞并可形成能傳分。不僅能獲得生長的膠質(zhì)細(xì)胞并可形成能傳代的二倍體細(xì)胞系。代的二倍體細(xì)胞系。第五十二頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(三三) 培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法v人腦組織可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)組織來自手術(shù)人腦組織可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)組織來自手術(shù)室無菌取腦髓灰質(zhì)或白質(zhì)均可用于

42、培養(yǎng)，室無菌取腦髓灰質(zhì)或白質(zhì)均可用于培養(yǎng)，1程序：程序：(1) 細(xì)胞懸液制備細(xì)胞懸液制備(zhbi)：獲取腦組織后，先仔細(xì)剝除腦膜和獲取腦組織后，先仔細(xì)剝除腦膜和血管等纖維成分，置入血管等纖維成分，置入Hanks 液中漂洗液中漂洗1 2 次后，置于次后，置于30 50倍的倍的Hanks 液中；腦組織比較柔軟，反復(fù)吹打即液中；腦組織比較柔軟，反復(fù)吹打即可制備成細(xì)胞懸液；可制備成細(xì)胞懸液；(2) 排除脂肪成分和其它碎塊排除脂肪成分和其它碎塊：把懸液注入離心管中，在：把懸液注入離心管中，在室溫直立室溫直立5 10 分鐘后，細(xì)胞或細(xì)胞團塊自然下沉，分鐘后，細(xì)胞或細(xì)胞團塊自然下沉，脂肪等雜物易漂浮于懸液

43、表層，吸除上清，如此反復(fù)脂肪等雜物易漂浮于懸液表層，吸除上清，如此反復(fù)二三次可獲較多的細(xì)胞成分；二三次可獲較多的細(xì)胞成分；第五十三頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(3)濾過、計數(shù)、接種：濾過、計數(shù)、接種：向末次沉降物中加入適向末次沉降物中加入適量營養(yǎng)液，通過紗網(wǎng)或紗布濾過，計數(shù)細(xì)胞量營養(yǎng)液，通過紗網(wǎng)或紗布濾過，計數(shù)細(xì)胞并調(diào)整好細(xì)胞密度，接種入培養(yǎng)瓶或皿中，并調(diào)整好細(xì)胞密度，接種入培養(yǎng)瓶或皿中，置置5C02 溫箱中培養(yǎng)；溫箱中培養(yǎng)；(4)傳代：傳代：細(xì)胞生長匯合后，可用細(xì)胞生長匯合后，可用0.25胰蛋白胰蛋白酶消化酶消化(xiohu)法做傳代處理。法做傳代處理。第五十四頁，共七十頁。不同類型

44、細(xì)胞的培養(yǎng)特點2生長特點：生長特點：v接種后初期，細(xì)胞可能接種后初期，細(xì)胞可能(knng)出現(xiàn)飄浮不貼壁出現(xiàn)飄浮不貼壁現(xiàn)象，貼壁后在短期內(nèi)也可能現(xiàn)象，貼壁后在短期內(nèi)也可能(knng)不見細(xì)胞不見細(xì)胞分裂現(xiàn)象；細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境過程較長，然而一分裂現(xiàn)象；細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境過程較長，然而一旦生長后，即能進入較旺盛的增殖狀態(tài)。旦生長后，即能進入較旺盛的增殖狀態(tài)。v生長開始常雜有巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上生長開始常雜有巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞等，傳二、三代后，這些成分即消失，皮細(xì)胞等，傳二、三代后，這些成分即消失，逐漸形成均一的星形膠質(zhì)細(xì)胞，一般形成連逐漸形成均一的星形膠質(zhì)細(xì)胞，一般形成連接不甚緊密的單層細(xì)胞

45、接不甚緊密的單層細(xì)胞第五十五頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點第二節(jié)第二節(jié) 腫瘤腫瘤(zhngli)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)v腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首先癌細(xì)胞是比較容易培養(yǎng)的細(xì)胞，當(dāng)前先癌細(xì)胞是比較容易培養(yǎng)的細(xì)胞，當(dāng)前(dngqin)建立的細(xì)胞系中癌細(xì)胞系是最多的。建立的細(xì)胞系中癌細(xì)胞系是最多的。v腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究癌變機理、抗癌藥檢測、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究癌變機理、抗癌藥檢測、癌分子生物學(xué)極其重要的手段。癌分子生物學(xué)極其重要的手段。第五十六頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法v腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除、腫瘤細(xì)

46、胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜選用適宜(shy)的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面。的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面。v初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。一、要點一、要點1取材：取材：v人腫瘤細(xì)胞來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材時盡量避免人腫瘤細(xì)胞來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材時盡量避免用退變組織，要用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。第五十七頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點2培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：v腫瘤細(xì)胞對培養(yǎng)基的要求不如正常腫瘤細(xì)胞對培養(yǎng)基的要求不如

47、正常(zhngchng)細(xì)胞嚴(yán)格，細(xì)胞嚴(yán)格，一般常用的一般常用的RPMI l640、DMEM、Mc-Coy5A 等培養(yǎng)等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞對血清的需求基等皆可用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞對血清的需求比正常比正常(zhngchng)細(xì)胞低，正常細(xì)胞低，正常(zhngchng)細(xì)胞培養(yǎng)不加血細(xì)胞培養(yǎng)不加血清不能生長，腫瘤細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長。清不能生長，腫瘤細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長。腫瘤細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大。腫瘤細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大。v培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞仍需加血清和相關(guān)生長因子培養(yǎng)更易成功。培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞仍需加血清和相關(guān)生長因子培養(yǎng)更易成功。第五十八頁，共七十頁。不同

48、類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點3成纖維細(xì)胞的排除：成纖維細(xì)胞的排除：v成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時混雜生長，致成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時混雜生長，致難以純化腫瘤細(xì)胞。而且難以純化腫瘤細(xì)胞。而且(r qi)成纖維細(xì)胞常成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長得快，最終能壓制腫瘤細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞生長得快，最終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞的生長。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。培養(yǎng)中的關(guān)鍵。第五十九頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點成纖維細(xì)胞排除法1機械刮除法：機械刮除法：v是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭(用膠塞剪成三角形插以不銹鋼用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲絲)，

49、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用，或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用(也可用也可用特制電熱燒灼器刮除特制電熱燒灼器刮除)。刮除程序為：。刮除程序為：(1) 標(biāo)記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細(xì)胞的部位部位(bwi)；(2) 刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標(biāo)記空間；窺視下，刮除無標(biāo)記空間；(3) 用用Hanks 液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細(xì)胞；液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細(xì)胞；(5) 注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)

50、仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重復(fù)刮注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重復(fù)刮除至完全除掉為止。除至完全除掉為止。第六十頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點2反復(fù)貼壁法：反復(fù)貼壁法：v根據(jù)腫瘤細(xì)胞根據(jù)腫瘤細(xì)胞(xbo)比成纖維細(xì)胞比成纖維細(xì)胞(xbo)貼壁速度慢的特點，貼壁速度慢的特點，并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液，并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液， (1) 細(xì)胞生長達一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，細(xì)胞生長達一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，Hanks 沖洗沖洗2 次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液；懸液；(2) 編號為編號為A、B、C

51、 三個培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入三個培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A 培培養(yǎng)瓶中，置溫箱中靜止培養(yǎng)養(yǎng)瓶中，置溫箱中靜止培養(yǎng)520 分鐘后，輕輕傾斜培分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入入B 培養(yǎng)瓶中后；向培養(yǎng)瓶中后；向A 瓶中補充少許完全培養(yǎng)液置溫箱瓶中補充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；中繼續(xù)培養(yǎng)；(3) B瓶中細(xì)胞瓶中細(xì)胞520 分鐘后，按處理分鐘后，按處理A 的方法，把培養(yǎng)液注的方法，把培養(yǎng)液注入入C 培養(yǎng)瓶中；再向培養(yǎng)瓶中；再向B 瓶中補加完全培養(yǎng)基。瓶中補加完全培養(yǎng)基。第六十一頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點

52、v當(dāng)三個瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)當(dāng)三個瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)(piyng)液后，均在溫箱液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)中繼續(xù)培養(yǎng)(piyng)。如操作成功，次日觀察可。如操作成功，次日觀察可見見A 瓶主要為成纖維細(xì)胞，瓶主要為成纖維細(xì)胞，B 瓶兩類細(xì)胞相瓶兩類細(xì)胞相雜，雜，C 瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時可反復(fù)瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時可反復(fù)處理多次，直至癌細(xì)胞純化為止。處理多次，直至癌細(xì)胞純化為止。第六十二頁，共七十頁。不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點3消化排除法：消化排除法：(1) 先是用先是用0.5胰蛋白酶和胰蛋白酶和0.02EDTA (1:1) 混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次，然后再換成新的混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下窺視和混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細(xì)胞脫落下來后，不時搖動培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細(xì)胞脫落下來后，便立即停止消化；便立即停止消化；(2) 把消化液吸入離心管中