糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶

1、會計(jì)學(xué)1糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶第一節(jié)第一節(jié) 糖基轉(zhuǎn)移酶糖基轉(zhuǎn)移酶( (Glycosyltransferases)l糖基轉(zhuǎn)移酶是一系列參與催化雙糖、聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶是一系列參與催化雙糖、聚糖和糖復(fù)合物中糖鏈合成的一類酶。和糖復(fù)合物中糖鏈合成的一類酶。l負(fù)責(zé)將活性供體負(fù)責(zé)將活性供體( (通常是通常是NDP-NDP-糖糖) )的單糖轉(zhuǎn)的單糖轉(zhuǎn)移到糖、蛋白質(zhì)、脂類、核酸分子上，完移到糖、蛋白質(zhì)、脂類、核酸分子上，完成糖基化反應(yīng)。成糖基化反應(yīng)。l目前發(fā)現(xiàn)的糖基轉(zhuǎn)移酶有目前發(fā)現(xiàn)的糖基轉(zhuǎn)移酶有100100多種，其主要多種，其主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。一、糖基轉(zhuǎn)移酶的命名

2、與分類一、糖基轉(zhuǎn)移酶的命名與分類l糖基轉(zhuǎn)移酶的傳統(tǒng)分類方法是根據(jù)其所轉(zhuǎn)糖基轉(zhuǎn)移酶的傳統(tǒng)分類方法是根據(jù)其所轉(zhuǎn)移的單糖類型進(jìn)行分類的。移的單糖類型進(jìn)行分類的。l如半乳糖轉(zhuǎn)移酶，唾液酸轉(zhuǎn)移酶等。如半乳糖轉(zhuǎn)移酶，唾液酸轉(zhuǎn)移酶等。l另外一種方法是根據(jù)序列的同源性、底物另外一種方法是根據(jù)序列的同源性、底物/ /產(chǎn)物立體化學(xué)異構(gòu)性以及供體糖進(jìn)行分類產(chǎn)物立體化學(xué)異構(gòu)性以及供體糖進(jìn)行分類。l這種分類法糖基轉(zhuǎn)移酶被分為這種分類法糖基轉(zhuǎn)移酶被分為6666個家族及個家族及一個未分類族。一個未分類族。l所有家族只采用兩種折疊方式，形成了兩所有家族只采用兩種折疊方式，形成了兩個超家族，分別為個超家族，分別為GT-A和和G

3、T-B超家族。超家族。 糖基轉(zhuǎn)移酶的命名糖基轉(zhuǎn)移酶的命名lGlcNAc T-I的全稱為：的全稱為：lUDP-N-乙酰葡糖胺乙酰葡糖胺: : -3-甘露糖基甘露糖基 -1,2N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶。乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶。lGlcNAc T-II的全稱為：的全稱為：lUDP-N-乙酰乙酰葡糖胺葡糖胺: : -6-甘露甘露糖基糖基 -1,2N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶。乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶。 -1,4-Galactosyltransferase Family Fucosyltransferase Family All members of the sialyltransferase genes clonedThe E

4、volutionary History of Glycosyltransferase Genes后生動物后生動物后口動物后口動物脊椎動物脊椎動物哺乳動物哺乳動物原始昆蟲原始昆蟲無脊椎動物無脊椎動物非哺乳動物非哺乳動物二、糖基轉(zhuǎn)移酶特性二、糖基轉(zhuǎn)移酶特性l一個基一個基因因 一種轉(zhuǎn)移一種轉(zhuǎn)移酶酶 一種連接鍵一種連接鍵l糖鏈的合成不是由基因編碼合成的，而是由基因編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶糖鏈的合成不是由基因編碼合成的，而是由基因編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶通過糖基化作用，將糖基由其供體轉(zhuǎn)移到受體上完成的。通過糖基化作用，將糖基由其供體轉(zhuǎn)移到受體上完成的。l每個糖基轉(zhuǎn)移酶都有自己特異供體、受體和聯(lián)接鍵，這就保證了在每個糖基

5、轉(zhuǎn)移酶都有自己特異供體、受體和聯(lián)接鍵，這就保證了在沒有模板的情況下合成特異性的糖。沒有模板的情況下合成特異性的糖。l糖鏈可以認(rèn)為是基因的次級產(chǎn)物糖鏈可以認(rèn)為是基因的次級產(chǎn)物, , 一個基因編碼一個糖基轉(zhuǎn)移酶一個基因編碼一個糖基轉(zhuǎn)移酶, , 一個糖基轉(zhuǎn)移酶專一地催化一個糖苷鍵的合成，一條糖鏈的合成就一個糖基轉(zhuǎn)移酶專一地催化一個糖苷鍵的合成，一條糖鏈的合成就需要一個多酶系統(tǒng)需要一個多酶系統(tǒng), , 也就對應(yīng)了一個基因組。也就對應(yīng)了一個基因組。糖基轉(zhuǎn)移酶特性糖基轉(zhuǎn)移酶特性l糖基轉(zhuǎn)移酶絕大部分是糖基轉(zhuǎn)移酶絕大部分是II型膜結(jié)合蛋白，即型膜結(jié)合蛋白，即較短的較短的N-端在胞漿，有一穿膜部分通過內(nèi)端在胞漿，

6、有一穿膜部分通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體膜，長的質(zhì)網(wǎng)或高爾基體膜，長的C-端在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或端在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體的管腔內(nèi)。高爾基體的管腔內(nèi)。l有少數(shù)糖基轉(zhuǎn)移酶是有少數(shù)糖基轉(zhuǎn)移酶是I型膜結(jié)合蛋白，其較型膜結(jié)合蛋白，其較短的短的N-端在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，而很長的端在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，而很長的C-端則定端則定位于胞漿。位于胞漿。Biological Functions of a Soluble Form of N-acetylglucosaminyltransferase V (GnT-V) Regulation of High Branching in N-linked Oligosaccharides大鼠不同組織中三種大鼠不

7、同組織中三種-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶( (GlcNAc T) )組織組織活力活力(pmolmg蛋白蛋白h)GlcNAc T-IIGlcNAc T-IVGlcNAc T-V腎腎1840 3301.9 1.630 6腦腦660 488.7 0.738 1胃胃500 1508.2 0.725 1小腸小腸280 9917 1.568 11肺肺104 4.62.6 0.738 4脾脾100 2.520 821 2睪丸睪丸52 2.98.2 0.837 4心心11 1.19.4 1.410 1肝肝81 0.92.8 0.78.2 0.8 三、糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)域三、糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)域l屬于屬于

8、II-型膜結(jié)合蛋白的糖基轉(zhuǎn)移酶分成四個型膜結(jié)合蛋白的糖基轉(zhuǎn)移酶分成四個結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域。l氨基端的胞漿域，氨基端的胞漿域，一般少于一般少于2525個個( (最少最少4 4個個) )氨基酸，含正電荷的堿基氨基酸較多；氨基酸，含正電荷的堿基氨基酸較多；l穿膜域，穿膜域，有少量氨基酸殘基，富含疏水氨有少量氨基酸殘基，富含疏水氨基酸；基酸；l頸區(qū)域，頸區(qū)域，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體管腔內(nèi)，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體管腔內(nèi)，含甘氨酸和脯氨酸殘基，有的帶有含甘氨酸和脯氨酸殘基，有的帶有N-糖鏈糖鏈。 糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)域糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)域l催化域，催化域，為管腔中的最大結(jié)構(gòu)域，呈球狀為管腔中的最大結(jié)構(gòu)域，呈球狀，約含，

9、約含310-430310-430個個( (最長可達(dá)最長可達(dá)720720個左右個左右) )氨氨基酸殘基，為糖基轉(zhuǎn)移酶最重要的催化區(qū)基酸殘基，為糖基轉(zhuǎn)移酶最重要的催化區(qū)域。域?？寺〉牟溉閯游锾腔D(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)域克隆的哺乳動物糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)域 四、糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性與功能四、糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性與功能(1)(1)底物專一性底物專一性l糖復(fù)合物中糖基的順序和連接鍵是由糖基糖復(fù)合物中糖基的順序和連接鍵是由糖基轉(zhuǎn)移酶的底物專一性和催化特性來決定的轉(zhuǎn)移酶的底物專一性和催化特性來決定的。l對對底物專一底物專一性，性，一個酶的產(chǎn)物常作為下一一個酶的產(chǎn)物常作為下一個酶的底物，這樣就保證了糖鏈中糖基的個酶的底物，

10、這樣就保證了糖鏈中糖基的特定順序。特定順序。l因合成的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不同或合成的部位不同因合成的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不同或合成的部位不同，所用的供體和受體也不同。，所用的供體和受體也不同。 糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性l合成糖原時，葡萄糖的供體是合成糖原時，葡萄糖的供體是UDP-Glc，合成淀粉時，則是合成淀粉時，則是ADP-Glc，合成纖維素合成纖維素時是時是GDP-Glc。l對受體的專一性對受體的專一性，在糖蛋白的在糖蛋白的N-糖苷糖苷鍵連鍵連接的糖鏈的外周有接的糖鏈的外周有6 6種不同的方式連接的種不同的方式連接的N-乙乙酰酰葡葡糖胺糖胺( (GIcNAc),GIcNAc),它們連接在不同甘露

11、它們連接在不同甘露糖基糖基( (Man)Man)的不同的不同糖糖基上基上，分別有分別有6 6個不同個不同的的糖糖基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)它它們的轉(zhuǎn)移們的轉(zhuǎn)移，每個酶又每個酶又對應(yīng)不同的受體對應(yīng)不同的受體 。不同的糖基轉(zhuǎn)移酶所催化的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)不同不同的糖基轉(zhuǎn)移酶所催化的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)不同人人B B血型的血型的 1-3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對受體底物的專一性半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對受體底物的專一性 糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性l唾液酸化唾液酸化Lewis X四糖抗原合成時，四糖抗原合成時，一般先生成唾液酸化的一般先生成唾液酸化的N-乙酰乳糖胺乙酰乳糖胺，再由，再由 -1,3Fuc T在在G1cNAc上

12、加入上加入Fuc，而不能先合成巖藻糖化的而不能先合成巖藻糖化的N-乙乙酰乳糖胺后再加上酰乳糖胺后再加上NeuAc。因。因 -2,3 NeuAc T不能以不能以 -1,3巖藻糖化糖鏈巖藻糖化糖鏈為底物。為底物。 糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性l糖基轉(zhuǎn)移酶也可作用于人工底物，如參與糖基轉(zhuǎn)移酶也可作用于人工底物，如參與糖蛋白糖鏈合成的糖基轉(zhuǎn)移酶也可利已除糖蛋白糖鏈合成的糖基轉(zhuǎn)移酶也可利已除去蛋白質(zhì)而還原末端標(biāo)記去蛋白質(zhì)而還原末端標(biāo)記( (熒光和放射性核熒光和放射性核素素) )的底物。的底物。l不少糖基轉(zhuǎn)移酶對底物的識別實(shí)際上只涉不少糖基轉(zhuǎn)移酶對底物的識別實(shí)際上只涉及受體底物中接受糖基鄰近的

13、少數(shù)糖基，及受體底物中接受糖基鄰近的少數(shù)糖基，故一些人工合成的寡糖衍生物也可作為這故一些人工合成的寡糖衍生物也可作為這些酶的底物。些酶的底物。 糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性(2)(2)二價金屬離子的需求二價金屬離子的需求l大多數(shù)的糖基轉(zhuǎn)移酶都需二價金屬離子作大多數(shù)的糖基轉(zhuǎn)移酶都需二價金屬離子作為輔助因子，缺乏二價金屬離子時為輔助因子，缺乏二價金屬離子時( (如在如在EDTA存在下存在下) )酶活力很低或喪失。酶活力很低或喪失。l二價金屬離子中二價金屬離子中Mn2+的激活作用最強(qiáng)，其的激活作用最強(qiáng)，其次是次是Co2+,Mg2+,Ni 2+。l糖基轉(zhuǎn)移酶糖基轉(zhuǎn)移酶 T- -V不需要二價

14、金屬離子。不需要二價金屬離子。 五、糖基轉(zhuǎn)移酶同源性和抗原性五、糖基轉(zhuǎn)移酶同源性和抗原性l糖基轉(zhuǎn)移酶在結(jié)構(gòu)上的最大特點(diǎn)是不糖基轉(zhuǎn)移酶在結(jié)構(gòu)上的最大特點(diǎn)是不同糖基轉(zhuǎn)移酶一級結(jié)構(gòu)之間的同源性同糖基轉(zhuǎn)移酶一級結(jié)構(gòu)之間的同源性很少，即使轉(zhuǎn)移相同糖基的糖基轉(zhuǎn)移很少，即使轉(zhuǎn)移相同糖基的糖基轉(zhuǎn)移酶也很少有同源性。酶也很少有同源性。l血型血型A抗原的抗原的GalNAc T和血型和血型B抗原抗原的的Gal T同源性達(dá)同源性達(dá)9999，在，在353353個氨基個氨基酸殘基中只有酸殘基中只有4 4個不同。個不同。 糖基轉(zhuǎn)移酶同源性和抗原性糖基轉(zhuǎn)移酶同源性和抗原性l不同種屬中同一糖基轉(zhuǎn)移酶的同源性不同種屬中同一糖基轉(zhuǎn)

15、移酶的同源性極大，其催化結(jié)構(gòu)域的同源性一般均極大，其催化結(jié)構(gòu)域的同源性一般均在在8080以上。以上。l如人、小鼠和兔中如人、小鼠和兔中 -1,2GlcNAc T-I四個結(jié)構(gòu)域的同源性分別為四個結(jié)構(gòu)域的同源性分別為100%100%、90%90%、80%80%和和95%95%。六、糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病六、糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病l -1,3 T的活性在人體內(nèi)的重現(xiàn)會引發(fā)自身的活性在人體內(nèi)的重現(xiàn)會引發(fā)自身免疫反應(yīng)。相反，如果人體內(nèi)免疫反應(yīng)。相反，如果人體內(nèi) -1,4半乳糖半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的活性下降，致使正常的免疫球基轉(zhuǎn)移酶的活性下降，致使正常的免疫球蛋白蛋白G (IgG)分子中的糖鏈半乳糖含量降低分子中的糖鏈半乳

16、糖含量降低。l它能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，從而也會出現(xiàn)自身免它能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，從而也會出現(xiàn)自身免疫，其癥狀是類風(fēng)濕。疫，其癥狀是類風(fēng)濕。糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病l細(xì)胞癌變過程中常伴有糖鏈結(jié)構(gòu)改變細(xì)胞癌變過程中常伴有糖鏈結(jié)構(gòu)改變，如如糖鏈分支末端出現(xiàn)重復(fù)糖鏈分支末端出現(xiàn)重復(fù)N-乙酰半乳糖胺結(jié)乙酰半乳糖胺結(jié)構(gòu)、唾液酸和巖藻糖含量增加，這些變化構(gòu)、唾液酸和巖藻糖含量增加，這些變化在臨床上常用作腫瘤標(biāo)記物。在臨床上常用作腫瘤標(biāo)記物。l糖基轉(zhuǎn)移酶就是通過影響糖鏈的改變糖基轉(zhuǎn)移酶就是通過影響糖鏈的改變，而而間接關(guān)系到癌瘤發(fā)生和發(fā)展。間接關(guān)系到癌瘤發(fā)生和發(fā)展。糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病l糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)

17、和細(xì)胞周期密切相關(guān)。糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)和細(xì)胞周期密切相關(guān)。l在細(xì)胞分化階段在細(xì)胞分化階段，如果糖基轉(zhuǎn)移酶在成熟如果糖基轉(zhuǎn)移酶在成熟細(xì)胞中活性很高細(xì)胞中活性很高，就會產(chǎn)生癌變就會產(chǎn)生癌變，同時出同時出現(xiàn)早期的分化抗原?，F(xiàn)早期的分化抗原。l多聚多聚N-乙酰半乳糖胺鏈的出現(xiàn)被看成是腫乙酰半乳糖胺鏈的出現(xiàn)被看成是腫瘤的重要標(biāo)志。瘤的重要標(biāo)志。l這些糖鏈可以減低細(xì)胞與基質(zhì)間的粘著，這些糖鏈可以減低細(xì)胞與基質(zhì)間的粘著，有利于癌細(xì)胞的進(jìn)一步侵入。有利于癌細(xì)胞的進(jìn)一步侵入。糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病l與肝癌發(fā)生有關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶與肝癌發(fā)生有關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶l糖基轉(zhuǎn)移酶在肝癌中活性有明顯改變，如糖基轉(zhuǎn)移酶在肝癌

18、中活性有明顯改變，如GnT-、GnT-和和 -1, 6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。lGnT-和和GnT-能將一個能將一個N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移至移至N-糖鏈五糖核心糖鏈五糖核心1, 3和和1, 6臂甘露糖上臂甘露糖上,分別形成分別形成 -1,4和和1,6鍵，使鍵，使N-糖鏈天線數(shù)增糖鏈天線數(shù)增多，多， -1, 6 FucT則將巖藻糖轉(zhuǎn)移至糖鏈最則將巖藻糖轉(zhuǎn)移至糖鏈最內(nèi)側(cè)內(nèi)側(cè)( (與天冬酰胺相鄰與天冬酰胺相鄰) )的的N-乙酰葡糖胺上乙酰葡糖胺上形成核心巖藻糖。形成核心巖藻糖。糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病l這些結(jié)構(gòu)異常的糖鏈出現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞的糖這些結(jié)構(gòu)異常的糖鏈出現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞的糖蛋白

19、上蛋白上，使腫瘤細(xì)胞表面性質(zhì)變化使腫瘤細(xì)胞表面性質(zhì)變化，導(dǎo)致導(dǎo)致細(xì)胞粘附、侵襲和遷移能力改變細(xì)胞粘附、侵襲和遷移能力改變，是造成是造成腫瘤細(xì)胞具有侵襲性和轉(zhuǎn)移能力的一個重腫瘤細(xì)胞具有侵襲性和轉(zhuǎn)移能力的一個重要原因。要原因。七、糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用七、糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用l糖基轉(zhuǎn)移酶在肝癌研究中的應(yīng)用糖基轉(zhuǎn)移酶在肝癌研究中的應(yīng)用l惡性腫瘤中糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)及活性改變所惡性腫瘤中糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)及活性改變所致腫瘤細(xì)胞表面糖鏈結(jié)構(gòu)的變化在腫瘤的致腫瘤細(xì)胞表面糖鏈結(jié)構(gòu)的變化在腫瘤的診斷、診斷、預(yù)防預(yù)防方面有重要意義方面有重要意義。l將糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞將糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞，過表過表達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移

20、酶使細(xì)胞內(nèi)某些蛋白發(fā)生糖達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移酶使細(xì)胞內(nèi)某些蛋白發(fā)生糖基化基化, ,產(chǎn)生不同糖型產(chǎn)生不同糖型，通過雙向電泳和凝集通過雙向電泳和凝集素免疫印跡相結(jié)合素免疫印跡相結(jié)合，比較轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染比較轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染組糖蛋白改變組糖蛋白改變，從而確定蛋白質(zhì)和糖基化從而確定蛋白質(zhì)和糖基化的功能關(guān)系的功能關(guān)系, ,研究研究為糖基化改變在肝癌發(fā)生為糖基化改變在肝癌發(fā)生中的作用研究奠定了基礎(chǔ)。中的作用研究奠定了基礎(chǔ)。糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用l采用同樣技術(shù)路線研究與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)采用同樣技術(shù)路線研究與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的糖基化改變的糖基化改變，并從結(jié)構(gòu)上描述糖鏈并從結(jié)構(gòu)上描述糖鏈，旨旨在將其作為乳腺癌和其他實(shí)

21、體腫瘤診斷工在將其作為乳腺癌和其他實(shí)體腫瘤診斷工具和免疫治療靶點(diǎn)具和免疫治療靶點(diǎn)。l糖基轉(zhuǎn)移酶在糖基轉(zhuǎn)移酶在糖糖類合成中的應(yīng)用類合成中的應(yīng)用l糖類藥物在治療炎癥、用作腫瘤疫苗和抗糖類藥物在治療炎癥、用作腫瘤疫苗和抗病毒等方面都有其獨(dú)特的功效。病毒等方面都有其獨(dú)特的功效。l現(xiàn)在普遍使用的糖類合成方法有兩種現(xiàn)在普遍使用的糖類合成方法有兩種： 化學(xué)合成和酶促合成化學(xué)合成和酶促合成l化學(xué)合成近年來取得一些進(jìn)展化學(xué)合成近年來取得一些進(jìn)展，提出了一種提出了一種全自動寡全自動寡糖糖合成法合成法，但在天然復(fù)合產(chǎn)物中以但在天然復(fù)合產(chǎn)物中以一種糖代替另一種糖仍然困難。一種糖代替另一種糖仍然困難。l酶促合成酶促合成

22、的的產(chǎn)量高、產(chǎn)物產(chǎn)量高、產(chǎn)物具有具有特異立體化學(xué)特異立體化學(xué)異構(gòu)性。異構(gòu)性。糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用l糖基轉(zhuǎn)移酶可作為研究糖復(fù)合物工具糖基轉(zhuǎn)移酶可作為研究糖復(fù)合物工具l如研究糖蛋白糖鏈的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以如研究糖蛋白糖鏈的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及細(xì)胞表面糖基化修飾等。及細(xì)胞表面糖基化修飾等。八、八、O-GlcNAc 糖基轉(zhuǎn)移酶在原核糖基轉(zhuǎn)移酶在原核和真核細(xì)胞中的表達(dá)和提純和真核細(xì)胞中的表達(dá)和提純l南通醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室與美國紐約州立基礎(chǔ)研究所神經(jīng)生化系南通醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室與美國紐約州立基礎(chǔ)研究所神經(jīng)生化系合作。合作。lO-GlcNAc 糖基化修飾起到調(diào)

23、節(jié)蛋白質(zhì)的活性糖基化修飾起到調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性，在生命過程的許多在生命過程的許多方面起作用方面起作用( (如核運(yùn)輸如核運(yùn)輸，基因轉(zhuǎn)錄及翻譯過程基因轉(zhuǎn)錄及翻譯過程) )。lOGT 基因敲除實(shí)驗(yàn)表明蛋白質(zhì)基因敲除實(shí)驗(yàn)表明蛋白質(zhì)O-GlcNAc 糖基化修飾是胚胎干細(xì)胞糖基化修飾是胚胎干細(xì)胞存活和個體發(fā)育所必需的。存活和個體發(fā)育所必需的。l蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的O-GlcNAc 糖基化修飾還調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)磷酸化，蛋白質(zhì)的糖基化修飾還調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)磷酸化，蛋白質(zhì)的O-GlcNAc 糖基化與磷酸化修飾間存在相互競爭、相互補(bǔ)充的關(guān)系。糖基化與磷酸化修飾間存在相互競爭、相互補(bǔ)充的關(guān)系。l細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核

24、內(nèi)的蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基糖基化和去糖基化分別由化和去糖基化分別由O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶糖基轉(zhuǎn)移酶( (OGT) )和和O-GlcNAc 糖苷酶催化。糖苷酶催化。l蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化修飾及其生物學(xué)糖基化修飾及其生物學(xué)意義目前成了蛋白質(zhì)翻譯后修飾領(lǐng)域最熱意義目前成了蛋白質(zhì)翻譯后修飾領(lǐng)域最熱門的課題之一。門的課題之一。l其研究目的：其研究目的：l用原核和真核細(xì)胞表達(dá)用原核和真核細(xì)胞表達(dá)OGT，并用不同的并用不同的方法從這兩個系統(tǒng)提純重組方法從這兩個系統(tǒng)提純重組OGT，獲得制獲得制備有活性的備有活性的OGT，用于進(jìn)行用于進(jìn)行O-GlcNAc糖基糖基酶功能方面的研究。酶功能

25、方面的研究。研究結(jié)果研究結(jié)果l用大腸桿菌和用大腸桿菌和Hi5 昆蟲細(xì)胞表達(dá)并純化具有昆蟲細(xì)胞表達(dá)并純化具有活性的重組活性的重組OGT。l攜帶人攜帶人OGTcDNA的的PET 32a 質(zhì)粒在大腸桿質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)出帶有菌中表達(dá)出帶有1個個S-Tag 的重組人的重組人OGT 融融合蛋白，然后用與合蛋白，然后用與S-蛋白質(zhì)偶聯(lián)的瓊脂糖蛋白質(zhì)偶聯(lián)的瓊脂糖凝膠顆粒從細(xì)菌裂解液中親和層析純化得凝膠顆粒從細(xì)菌裂解液中親和層析純化得到到OGT 融合蛋白。融合蛋白。l其純化的其純化的OGT在電泳中顯現(xiàn)單一條帶并具在電泳中顯現(xiàn)單一條帶并具有生物活性有生物活性，但其活性在洗脫后喪失。但其活性在洗脫后喪失。IPT

26、G 誘導(dǎo)重組誘導(dǎo)重組OGT 在在BL 21 大腸桿菌中的表達(dá)大腸桿菌中的表達(dá)大腸桿菌中表達(dá)的重組大腸桿菌中表達(dá)的重組OGT 經(jīng)經(jīng)S-蛋白質(zhì)凝膠純化蛋白質(zhì)凝膠純化研究結(jié)果研究結(jié)果l在在Hi5 昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的鼠肝昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的鼠肝OGT，經(jīng)鎳離子螯合柱純化后經(jīng)鎳離子螯合柱純化后, 其比其比活性達(dá)到活性達(dá)到0.88 nmolmin-1mg-1OGT。Hi5 細(xì)胞中表達(dá)的重組細(xì)胞中表達(dá)的重組OGT 的純化的純化甜菊糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及序列分析甜菊糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及序列分析l利用與植物次生代謝產(chǎn)物糖基化相關(guān)的利用與植物次生代謝產(chǎn)物糖基化相關(guān)的UDPG糖基轉(zhuǎn)移酶的特征性保守區(qū)域糖基轉(zhuǎn)移酶的特征性

27、保守區(qū)域，設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)了同源引物了同源引物。l以甜菊基因組以甜菊基因組DNA 為模板，為模板，PCR 擴(kuò)增獲得擴(kuò)增獲得甜菊糖基轉(zhuǎn)移酶基因片段甜菊糖基轉(zhuǎn)移酶基因片段。l根據(jù)獲得的基因片段設(shè)計(jì)引物根據(jù)獲得的基因片段設(shè)計(jì)引物GSTr 和和GSTf ，分別與分別與cDNA文庫的文庫的T3 和和T7 通用通用引物擴(kuò)增獲得全長核苷酸序列的甜菊糖基引物擴(kuò)增獲得全長核苷酸序列的甜菊糖基轉(zhuǎn)移酶基因。轉(zhuǎn)移酶基因。The level of expression of plant glycosyltransferasesTransgenic pigs with GnT-IIIRecombinant plant glyco

28、syltransferases reported recently (20012004)葡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽疫苗葡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的實(shí)驗(yàn)研究免疫大鼠的實(shí)驗(yàn)研究l葡糖基轉(zhuǎn)移酶葡糖基轉(zhuǎn)移酶是致是致齲齲菌的重要致病因素之一菌的重要致病因素之一， 具有利用具有利用蔗糖蔗糖合成細(xì)胞外葡聚合成細(xì)胞外葡聚糖糖的催化的催化活性和活性和結(jié)合結(jié)合葡聚糖的活性葡聚糖的活性，在細(xì)菌附著和菌在細(xì)菌附著和菌斑形成的過程中起著重要作用斑形成的過程中起著重要作用。l抑制抑制GTF活性活性，減少葡聚糖的產(chǎn)生是控制菌減少葡聚糖的產(chǎn)生是控制菌震斑預(yù)防震斑預(yù)防齲齲病的重要手段之一病的重要手段之一。l目的：目的： 動物體內(nèi)

29、研究葡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽疫苗動物體內(nèi)研究葡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽疫苗HDS 免疫原性和防齲效果。免疫原性和防齲效果。葡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽疫苗葡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的實(shí)驗(yàn)研究免疫大鼠的實(shí)驗(yàn)研究l方法：方法： 構(gòu)建大鼠人工齲模型，分別用人工抗原構(gòu)建大鼠人工齲模型，分別用人工抗原HDS-KLH，多肽抗原多肽抗原HDS，葡糖基轉(zhuǎn)移酶葡糖基轉(zhuǎn)移酶( (GTF) )免疫大鼠，酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠免疫大鼠，酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清和唾液中抗血清和唾液中抗HDS、GTF抗體；體視顯抗體；體視顯微鏡下觀察各組大鼠磨牙齲壞情況，并用微鏡下觀察各組大鼠磨牙齲壞情況，并用Keyes計(jì)分法計(jì)分。計(jì)分法計(jì)分。葡糖基轉(zhuǎn)移酶

30、多肽疫苗葡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的實(shí)驗(yàn)研究免疫大鼠的實(shí)驗(yàn)研究l結(jié)果：結(jié)果：lHDS-KLH免疫組大鼠唾液、血清中抗免疫組大鼠唾液、血清中抗HDS IgG和和IgA 水平均高于對照組水平均高于對照組(P 0.05)；HDS-KLH，HDS，GTF免疫組大鼠齲免疫組大鼠齲Keyes 計(jì)分均低于對照組計(jì)分均低于對照組( P 0101)，光光滑面防齲效果最為顯著?；娣例x效果最為顯著。l結(jié)論：結(jié)論：l人工抗原人工抗原 HDS-KLH 能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對GTF 的保護(hù)性免疫的保護(hù)性免疫，并減少實(shí)驗(yàn)大鼠齲齒并減少實(shí)驗(yàn)大鼠齲齒發(fā)生。發(fā)生。葡糖基轉(zhuǎn)移酶抗體的制備與研究葡糖基轉(zhuǎn)移酶抗

31、體的制備與研究l以葡糖基轉(zhuǎn)移酶免疫產(chǎn)蛋母雞。以葡糖基轉(zhuǎn)移酶免疫產(chǎn)蛋母雞。l應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定雞蛋黃中免應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定雞蛋黃中免疫球蛋白的活性。疫球蛋白的活性。l經(jīng)葡糖基轉(zhuǎn)移酶免疫后可以得到高效價的經(jīng)葡糖基轉(zhuǎn)移酶免疫后可以得到高效價的蛋黃抗體，其抗遠(yuǎn)援鏈球菌的效價約為一蛋黃抗體，其抗遠(yuǎn)援鏈球菌的效價約為一般般IgY的的1616倍。倍。 l體外模擬實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)遠(yuǎn)援鏈球菌免疫的蛋體外模擬實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)遠(yuǎn)援鏈球菌免疫的蛋黃抗體確實(shí)有抗牙菌斑形成的能力，從而黃抗體確實(shí)有抗牙菌斑形成的能力，從而具備防齲齒的功效。具備防齲齒的功效。第二節(jié)第二節(jié) 糖苷酶糖苷酶l糖糖苷苷酶酶( (G1ycosid

32、ase) )是一大類催化糖是一大類催化糖苷苷鍵水鍵水解解的酶的酶類。類。l其主要分布在動物、植物、微生物體內(nèi)，其主要分布在動物、植物、微生物體內(nèi)，擔(dān)負(fù)著水解各種擔(dān)負(fù)著水解各種糖糖苷苷、寡、寡糖糖、多、多糖糖、復(fù)雜、復(fù)雜多糖以供機(jī)體多糖以供機(jī)體利利用的生物學(xué)功能用的生物學(xué)功能。l大多數(shù)糖苷酶水解典型大多數(shù)糖苷酶水解典型O-糖苷鍵糖苷鍵，也有部，也有部分水解分水解N-糖苷鍵糖苷鍵，有一些糖苷酶水解，有一些糖苷酶水解S-糖糖苷鍵苷鍵。一、一、糖苷酶的分類糖苷酶的分類l按照酶的作用方式和水解產(chǎn)物可把糖苷酶按照酶的作用方式和水解產(chǎn)物可把糖苷酶分為兩大類：分為兩大類：l外切糖苷酶類（外切糖苷酶類（Exog

33、lycosidases)： 它們的作用方式是從糖鏈的非還原端開始它們的作用方式是從糖鏈的非還原端開始，逐步將糖苷鍵切斷，所得到的水解產(chǎn)物，逐步將糖苷鍵切斷，所得到的水解產(chǎn)物為單糖或雙糖；為單糖或雙糖；l內(nèi)切糖苷酶類（內(nèi)切糖苷酶類（Endoglycosidases)： 它們從糖鏈的中間打斷糖苷鍵，水解產(chǎn)物它們從糖鏈的中間打斷糖苷鍵，水解產(chǎn)物為分子量小于原來底物的寡糖。為分子量小于原來底物的寡糖。Exo-1-4-Beta-D-Glycanase二、二、糖苷酶的分布糖苷酶的分布l糖苷酶在自然界有廣泛分布，幾乎所有動糖苷酶在自然界有廣泛分布，幾乎所有動物、植物和微生物體內(nèi)都能找到糖苷鍵。物、植物和微生

34、物體內(nèi)都能找到糖苷鍵。l在哺乳動物中，血清、血細(xì)胞、體液、各在哺乳動物中，血清、血細(xì)胞、體液、各種組織器官中都有存在。種組織器官中都有存在。l許多軟體動物也是糖苷酶的良好來源。許多軟體動物也是糖苷酶的良好來源。l植物種子里有豐富的糖苷酶。植物種子里有豐富的糖苷酶。l一些細(xì)菌、酵母、霉菌的糖苷酶已有相當(dāng)一些細(xì)菌、酵母、霉菌的糖苷酶已有相當(dāng)?shù)难芯繄蟮?。的研究報道。三、三、糖苷酶的命名糖苷酶的命名l糖苷酶的命名與它的底物專一性密切相關(guān)糖苷酶的命名與它的底物專一性密切相關(guān)。l底物專一性包含：底物專一性包含：l糖基一側(cè)的專一性；糖基一側(cè)的專一性；l糖苷鍵的糖苷鍵的 - - - -異頭專一性；異頭專一性；

35、l糖苷配基一側(cè)的專一性。糖苷配基一側(cè)的專一性。l糖苷酶的命名是根據(jù)糖基一側(cè)的專一性和糖苷酶的命名是根據(jù)糖基一側(cè)的專一性和糖苷鍵的糖苷鍵的 - - - -異頭專一性來命名的。異頭專一性來命名的。l - -葡萄糖苷酶、葡萄糖苷酶、 - -葡萄糖苷酶、葡萄糖苷酶、 - -半乳糖半乳糖苷酶、苷酶、 - -甘露甘露糖苷酶等。糖苷酶等。(1)(1)糖基一側(cè)的專一性糖基一側(cè)的專一性(2)(2)糖苷鍵的糖苷鍵的 - - - -異頭專一性異頭專一性(3)(3)糖基配基一側(cè)的專一性糖基配基一側(cè)的專一性四、四、糖苷酶的生物學(xué)功能糖苷酶的生物學(xué)功能(1)(1)分泌到細(xì)胞外的糖苷酶，參與營養(yǎng)物質(zhì)的分泌到細(xì)胞外的糖苷酶，

36、參與營養(yǎng)物質(zhì)的胞外消化吸收過程。胞外消化吸收過程。(2)(2)細(xì)胞內(nèi)的糖苷酶，如動物細(xì)胞內(nèi)的溶酶體細(xì)胞內(nèi)的糖苷酶，如動物細(xì)胞內(nèi)的溶酶體中有一系列糖苷酶，它們的功能是降解胞中有一系列糖苷酶，它們的功能是降解胞內(nèi)的糖復(fù)合物。內(nèi)的糖復(fù)合物。(3)(3)參與糖鏈的合成，如在糖蛋白生物合成過參與糖鏈的合成，如在糖蛋白生物合成過程中，參加程中，參加N-型糖鏈的型糖鏈的“剪枝剪枝”， “修剪修剪”成較短分支成較短分支(Man3GlcNAc-Asn)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)，然后再由糖基轉(zhuǎn)移酶加上新的糖基，形成然后再由糖基轉(zhuǎn)移酶加上新的糖基，形成不同結(jié)構(gòu)的糖鏈。不同結(jié)構(gòu)的糖鏈。Biological Roles of N-g

37、lycanase in Cells五、一些常見的五、一些常見的糖苷酶糖苷酶l -D-甘露糖苷酶甘露糖苷酶l -D-甘露糖苷酶甘露糖苷酶l - D-木糖苷酶木糖苷酶l , -鼠李糖苷酶鼠李糖苷酶l -D-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶l -D-葡萄糖苷酶：葡萄糖苷酶： 海藻糖酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡聚糖蔗糖海藻糖酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡聚糖蔗糖酶、淀粉麥芽糖酶。酶、淀粉麥芽糖酶。 l唾液酸酶唾液酸酶( (神經(jīng)氨酸酶類神經(jīng)氨酸酶類) )。一些常見的一些常見的糖苷酶糖苷酶l -D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶l -D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶l -D-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶l -D-N-乙酰己糖胺酶乙酰己糖胺酶 l

38、 -D-N-乙酰葡糖胺酶乙酰葡糖胺酶l -D-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶l -D-巖澡塘苷酶巖澡塘苷酶l -L-巖澡塘苷酶巖澡塘苷酶水解不同類型糖苷鍵的糖苷酶水解不同類型糖苷鍵的糖苷酶六、六、糖苷酶的制備方法糖苷酶的制備方法l黃芪皂苷糖苷酶產(chǎn)生菌的篩選黃芪皂苷糖苷酶產(chǎn)生菌的篩選l將篩選用將篩選用菌株菌株Absida sp. A9r 、A84r 、A9r 、A8r 、A38r 、Arr進(jìn)行培養(yǎng)制備酶進(jìn)行培養(yǎng)制備酶液液 以黃芪總皂苷為底物進(jìn)行誘導(dǎo)以黃芪總皂苷為底物進(jìn)行誘導(dǎo) 薄薄層層析法層層析法檢測水解結(jié)果檢測水解結(jié)果。l結(jié)果：結(jié)果：A bsida sp. A3r 菌所產(chǎn)酶液能較菌所產(chǎn)酶液能較

39、好的水解黃芪總皂苷中糖基較多的皂苷好的水解黃芪總皂苷中糖基較多的皂苷，進(jìn)而生成糖基較少的皂苷。進(jìn)而生成糖基較少的皂苷。l綠色木霉產(chǎn)生的外切綠色木霉產(chǎn)生的外切- -葡聚糖苷酶葡聚糖苷酶l從潮濕的樹皮及腐爛的木塊上采集樣本從潮濕的樹皮及腐爛的木塊上采集樣本 加適量的無菌水溫和攪拌加適量的無菌水溫和攪拌取取1 ml 懸濁液懸濁液, ,分別涂于含有濾紙的固體篩選培養(yǎng)基上分別涂于含有濾紙的固體篩選培養(yǎng)基上待長出若干菌落后，對生長良好的菌種待長出若干菌落后，對生長良好的菌種進(jìn)行分離進(jìn)行分離以以羧甲基纖維素鈉為底物分別羧甲基纖維素鈉為底物分別測定其所產(chǎn)酶活性。測定其所產(chǎn)酶活性。l菌培養(yǎng)液菌培養(yǎng)液過濾過濾上清

40、液上清液硫酸銨沉淀硫酸銨沉淀Sephadex 柱層析柱層析DEAE2纖維素纖維素52 陰陰離子交換柱層析離子交換柱層析收集洗脫純酶液。收集洗脫純酶液。l一株神經(jīng)節(jié)苷脂內(nèi)切糖苷酶產(chǎn)生菌的分離一株神經(jīng)節(jié)苷脂內(nèi)切糖苷酶產(chǎn)生菌的分離l采用神經(jīng)節(jié)苷脂選擇性培養(yǎng)基，從土壤微采用神經(jīng)節(jié)苷脂選擇性培養(yǎng)基，從土壤微生物中篩選得到一株產(chǎn)神經(jīng)節(jié)苷脂內(nèi)切糖生物中篩選得到一株產(chǎn)神經(jīng)節(jié)苷脂內(nèi)切糖苷酶的菌株苷酶的菌株YW2112，該酶能特異性水解該酶能特異性水解神經(jīng)節(jié)苷脂中連接神經(jīng)酰胺和寡糖鏈之間神經(jīng)節(jié)苷脂中連接神經(jīng)酰胺和寡糖鏈之間的糖苷鍵，是研究神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)構(gòu)與功能的糖苷鍵，是研究神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)構(gòu)與功能的重要工具酶。的重要

41、工具酶。l人參糖苷酶提取人參糖苷酶提取l目的目的： 用于對人參皂苷進(jìn)行改造的糖苷酶。用于對人參皂苷進(jìn)行改造的糖苷酶。l方法：方法： 從鮮人參根中提取人參皂苷酶從鮮人參根中提取人參皂苷酶，乙醇沉淀乙醇沉淀，離子交換層析純化離子交換層析純化，凝膠電泳分析凝膠電泳分析，薄薄層色譜法測酶活力。層色譜法測酶活力。l結(jié)果：結(jié)果： 經(jīng)離子交換層析得到人參皂苷經(jīng)離子交換層析得到人參皂苷 -葡糖苷酶葡糖苷酶。七、七、糖苷酶的分離、純化和測定糖苷酶的分離、純化和測定l糖苷酶的分離純化，在原則和技術(shù)方法上糖苷酶的分離純化，在原則和技術(shù)方法上和一般的蛋白質(zhì)或酶的分離純化沒有區(qū)別和一般的蛋白質(zhì)或酶的分離純化沒有區(qū)別。l

42、常用的方法：常用的方法： 鹽析鹽析( (硫酸銨沉淀硫酸銨沉淀) )、柱層析、柱層析( (離子交換、離子交換、凝膠過濾、親和層析、吸附凝膠過濾、親和層析、吸附)， 電泳等。電泳等。一些糖苷酶的分離純化方法一些糖苷酶的分離純化方法來來 源源酶的名稱酶的名稱方方 法法刀豆粉刀豆粉 -甘露糖苷酶甘露糖苷酶乙醇沉淀、凝膠過濾、離子交換乙醇沉淀、凝膠過濾、離子交換 -N-乙酰己糖胺酶乙酰己糖胺酶柱層析柱層析 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶無花果無花果 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶丙酮沉淀、凝膠過濾、離子交換丙酮沉淀、凝膠過濾、離子交換柱層析、等電聚膠柱層析、等電聚膠產(chǎn)氣夾膜梭菌產(chǎn)氣夾膜梭菌 -N-乙酰葡糖胺酶乙酰葡糖胺

43、酶 -N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶硫酸銨沉淀、凝膠過濾、離子交硫酸銨沉淀、凝膠過濾、離子交換柱層析、制備電泳換柱層析、制備電泳豬腎豬腎 -甘露糖苷酶甘露糖苷酶硫酸銨沉淀、丙酮沉淀、熱處理硫酸銨沉淀、丙酮沉淀、熱處理( (60C，15分鐘分鐘) )、吸附、吸附柱層析、凝柱層析、凝膠過濾、制備電泳膠過濾、制備電泳親和層析法分離純化糖苷酶親和層析法分離純化糖苷酶酶的名稱酶的名稱所用的吸附劑所用的吸附劑 -N-乙酰己糖胺酶乙酰己糖胺酶Sepharose-ConA(刀豆凝集素刀豆凝集素) -甘露糖苷酶甘露糖苷酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶葡萄糖醛酸苷酶葡萄

44、糖醛酸苷酶Sepharose- -氨基乙酰甘露糖胺氨基乙酰甘露糖胺Sepharose-6-氨基乙基氨基乙基-1-硫硫- -D-吡喃半乳糖苷吡喃半乳糖苷聚丙聚丙酰胺酰胺-對氨基苯基對氨基苯基-硫代硫代半乳糖苷半乳糖苷瓊脂糖瓊脂糖-糖苷酶活性測定糖苷酶活性測定l糖苷酶活性測定：糖苷酶活性測定：(1)(1)最常用的方法是以合成的對硝基苯酚糖苷化合物作為底物，在酶作最常用的方法是以合成的對硝基苯酚糖苷化合物作為底物，在酶作用下釋放出的對硝基苯酚，在堿性條件下呈黃色，可用分光光度計(jì)用下釋放出的對硝基苯酚，在堿性條件下呈黃色，可用分光光度計(jì)法定量測定。法定量測定。(2)(2)把傘形酮類螢光化合物把傘形酮類

45、螢光化合物(4-(4-Methyumbelliferone) )結(jié)合到神經(jīng)氨酸的結(jié)合到神經(jīng)氨酸的半縮醛羥基上，生成半縮醛羥基上，生成4-4-甲基傘形酮基甲基傘形酮基N-N-乙酰神經(jīng)氨酸苷，用做神經(jīng)乙酰神經(jīng)氨酸苷，用做神經(jīng)氨酸苷酸的底物。在酶作用下，釋放出發(fā)螢光的氨酸苷酸的底物。在酶作用下，釋放出發(fā)螢光的4-4-甲基傘形酮，用甲基傘形酮，用360360nmnm波長光作激發(fā)光，在波長光作激發(fā)光，在440440nmnm波長處測發(fā)射光，可定量地測定釋波長處測發(fā)射光，可定量地測定釋放的放的4-4-甲基傘形圈。甲基傘形圈。糖苷酶活性測定糖苷酶活性測定(3)(3)需要以合成的或天然的雙糖需要以合成的或天然的

46、雙糖、寡糖、糖肽寡糖、糖肽甚至糖脂作為底物的方法。甚至糖脂作為底物的方法。l有兩種情況：有兩種情況：l一是測定糖苷酶作用下從非還原端釋放的一是測定糖苷酶作用下從非還原端釋放的單糖。用雙糖單糖。用雙糖 - -O-2-L-O-2-L-吡喃巖藻糖基吡喃巖藻糖基- -D- -半半乳糖為底物。釋放出來的巖藻糖，可以轉(zhuǎn)乳糖為底物。釋放出來的巖藻糖，可以轉(zhuǎn)變?yōu)槿谆杳蜒苌?，氣相色譜上測定變?yōu)槿谆杳蜒苌?，氣相色譜上測定。糖苷酶活性測定糖苷酶活性測定l二是在酶作用下，非還原端的糖基釋放后二是在酶作用下，非還原端的糖基釋放后，測定其余下的部分。，測定其余下的部分。l采用螢光化合物采用螢光化合物( ( -

47、 -氨基吡啶氨基吡啶, 5-, 5-二甲氨基二甲氨基萘磺?；容粱酋；? )標(biāo)記在底物糖鏈的還原末端，標(biāo)記在底物糖鏈的還原末端，結(jié)合使用高效液相色譜分離，用螢光分光結(jié)合使用高效液相色譜分離，用螢光分光光度計(jì)檢測酶活性。光度計(jì)檢測酶活性。八、八、糖苷酶的應(yīng)用糖苷酶的應(yīng)用l在糖鏈結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用在糖鏈結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用l作為工具酶的糖苷酶作為工具酶的糖苷酶l -D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶l -D-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶l -D-N-乙酰己糖胺酶乙酰己糖胺酶 l -D-N-乙酰葡糖胺酶乙酰葡糖胺酶l -D-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶l -D-巖澡塘苷酶巖澡塘苷酶l -L-巖澡塘苷酶巖澡

48、塘苷酶1 1、作為工具酶的糖苷酶作為工具酶的糖苷酶l糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖等糖復(fù)合物在生糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖等糖復(fù)合物在生物體內(nèi)，尤其是在細(xì)胞表面攜帶著生物的物體內(nèi)，尤其是在細(xì)胞表面攜帶著生物的信息，在分子識別過程中起著重要作用。信息，在分子識別過程中起著重要作用。l研究其功能，首先要研究其結(jié)構(gòu)。研究其功能，首先要研究其結(jié)構(gòu)。l闡明一種糖復(fù)合物的糖鏈結(jié)構(gòu)往往需要綜闡明一種糖復(fù)合物的糖鏈結(jié)構(gòu)往往需要綜合運(yùn)用多種技術(shù)方法包括過碘酸氧化、甲合運(yùn)用多種技術(shù)方法包括過碘酸氧化、甲基化反應(yīng)、紅外光譜、核磁共振以及糖苷基化反應(yīng)、紅外光譜、核磁共振以及糖苷酶作用等。酶作用等。l糖苷酶的使用在糖鏈結(jié)構(gòu)研究主要

49、體現(xiàn)在糖苷酶的使用在糖鏈結(jié)構(gòu)研究主要體現(xiàn)在以下幾個方面：以下幾個方面：(1)(1)外切糖苷酶的作用特點(diǎn)和底物專一性外切糖苷酶的作用特點(diǎn)和底物專一性l通過糖苷酶水解，能切下非還原末端的一通過糖苷酶水解，能切下非還原末端的一個單糖，同時提供關(guān)于糖基的組成、排列個單糖，同時提供關(guān)于糖基的組成、排列順序以及糖苷鍵的順序以及糖苷鍵的 - -或或 - -異頭構(gòu)型的信息異頭構(gòu)型的信息。l糖基組成，用糖鏈完全酸水解，加上紙色糖基組成，用糖鏈完全酸水解，加上紙色譜或氣相色譜分析得到的結(jié)果，可以和應(yīng)譜或氣相色譜分析得到的結(jié)果，可以和應(yīng)用糖苷酶所得到的結(jié)果相印證。用糖苷酶所得到的結(jié)果相印證。外切糖苷酶的作用特點(diǎn)和底

50、物專一性外切糖苷酶的作用特點(diǎn)和底物專一性l糖鏈中糖基的連接順序分析，甲基化反應(yīng)糖鏈中糖基的連接順序分析，甲基化反應(yīng)過碘酸氧化和核磁共振等方法，結(jié)合糖苷過碘酸氧化和核磁共振等方法，結(jié)合糖苷酶的逐步水解方法，可提供順序的信息。酶的逐步水解方法，可提供順序的信息。l采用核磁共振和紅外光譜法分析糖苷鍵的采用核磁共振和紅外光譜法分析糖苷鍵的 - -或或 - -異頭構(gòu)型。在不具備這些大型儀器異頭構(gòu)型。在不具備這些大型儀器的條件下，可采用糖苷酶水解的。的條件下，可采用糖苷酶水解的。(2)(2)打開糖肽鍵獲得完整糖鏈打開糖肽鍵獲得完整糖鏈l打開打開O-型糖肽鍵常用的方法是采用稀堿水型糖肽鍵常用的方法是采用稀堿

51、水解解( - -消除反應(yīng)消除反應(yīng))的方法。的方法。l打開打開N-型糖肽鍵主要采用肼解法。型糖肽鍵主要采用肼解法。l可采用糖苷酶方法打開糖肽鍵，獲得天然可采用糖苷酶方法打開糖肽鍵，獲得天然的完整糖鏈。的完整糖鏈。l - -N- -乙乙酰葡糖胺內(nèi)切酶酰葡糖胺內(nèi)切酶H(Endo-H)的應(yīng)用的應(yīng)用，在多甘露糖型，在多甘露糖型N- -型糖鏈的研究中，收到型糖鏈的研究中，收到良好效果。良好效果。(3)(3)獲得短糖鏈獲得短糖鏈l有些植物或微生物來源的糖鏈，分子有些植物或微生物來源的糖鏈，分子量大，并有重復(fù)的寡糖結(jié)構(gòu)單位，可量大，并有重復(fù)的寡糖結(jié)構(gòu)單位，可以應(yīng)用合適的內(nèi)切糖苷酶，將長的糖以應(yīng)用合適的內(nèi)切糖苷

52、酶，將長的糖鏈打斷成為較短的寡糖片段，有利于鏈打斷成為較短的寡糖片段，有利于結(jié)構(gòu)研究。結(jié)構(gòu)研究。2 2、用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的外切糖、用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的外切糖苷酶苷酶l從肺炎雙球菌的培養(yǎng)液中純化得到從肺炎雙球菌的培養(yǎng)液中純化得到 -半乳半乳糖苷酶，可以水解糖苷酶，可以水解Gal- -1,4GlcNAc糖苷糖苷鍵，但不能水解鍵，但不能水解 -1,3和和 -1,6鍵，表現(xiàn)出嚴(yán)鍵，表現(xiàn)出嚴(yán)格的對取代位置的專一性要求。格的對取代位置的專一性要求。l -半乳糖苷酶常用于半乳糖苷酶常用于N-型糖鏈的結(jié)構(gòu)分析型糖鏈的結(jié)構(gòu)分析，因?yàn)樵?，因?yàn)樵贜-型糖鏈中，型糖鏈中，Gal-G1cNAc之間之間的連鍵多為的連鍵多為

53、 -1,4。用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的外切糖用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的外切糖苷酶苷酶l - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶l - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶l - -甘露糖苷酶甘露糖苷酶l - -甘露糖苷酶甘露糖苷酶l - -巖藻糖苷酶巖藻糖苷酶l - -N-N-乙酰己糖胺酶乙酰己糖胺酶l - -N-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶l唾液酸苷酶唾液酸苷酶 - -半乳糖苷酶的底物專一性半乳糖苷酶的底物專一性 -巖藻糖苷酶的底物專一性巖藻糖苷酶的底物專一性唾液酸唾液酸苷酶的底物專一性苷酶的底物專一性 - -半乳糖苷酶的底物專一性半乳糖苷酶的底物專一性3 3、用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的內(nèi)切糖、用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的內(nèi)切糖苷酶苷酶l內(nèi)切糖苷

54、酶主要體現(xiàn)在對糖基一側(cè)整內(nèi)切糖苷酶主要體現(xiàn)在對糖基一側(cè)整個寡糖鏈的結(jié)構(gòu)有專一要求。個寡糖鏈的結(jié)構(gòu)有專一要求。l它們它們作用于作用于糖鏈的中間打斷糖苷鍵，糖鏈的中間打斷糖苷鍵，水解產(chǎn)物為分子量小于原來底物的寡水解產(chǎn)物為分子量小于原來底物的寡糖。糖。用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的內(nèi)切糖用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的內(nèi)切糖苷酶苷酶l - -N-N-乙酰葡糖胺內(nèi)切酶乙酰葡糖胺內(nèi)切酶l - -N-N-乙酰半乳糖胺內(nèi)切酶乙酰半乳糖胺內(nèi)切酶l - -半乳糖苷內(nèi)切酶半乳糖苷內(nèi)切酶l -1,6-1,6甘露聚糖內(nèi)切酶甘露聚糖內(nèi)切酶l -1,4-1,4氨基半乳糖苷內(nèi)切酶氨基半乳糖苷內(nèi)切酶幾種內(nèi)切糖幾種內(nèi)切糖苷酶的底物專一性苷酶的底物專一性

55、(1) (1) -N-乙酰乙酰葡糖胺內(nèi)切酶葡糖胺內(nèi)切酶l按其來源和底物專一性的差別，共分四種。按其來源和底物專一性的差別，共分四種。(1)它們都能水解它們都能水解N- -型糖中緊挨著天冬酰胺的兩個型糖中緊挨著天冬酰胺的兩個N- -乙酰葡糖胺之間的乙酰葡糖胺之間的 - -1,4連接鍵。連接鍵。(2)Endo-D和和Endo-C1的底物專一性完全相同。的底物專一性完全相同。 都要求在糖基一側(cè)有一個三碳結(jié)構(gòu)。非還原末端的都要求在糖基一側(cè)有一個三碳結(jié)構(gòu)。非還原末端的 - -甘露糖殘基必甘露糖殘基必需沒有被其他糖取代。需沒有被其他糖取代。 - -N-N-乙酰葡糖胺內(nèi)切酶乙酰葡糖胺內(nèi)切酶(3)(3)ind

56、o-Hindo-H的底物專一性，在糖基一例要求一的底物專一性，在糖基一例要求一個四糖結(jié)構(gòu)個四糖結(jié)構(gòu): : 非還原末端的非還原末端的 - -甘露糖必需是，或者不被甘露糖必需是，或者不被取代、或者是僅僅取代在取代、或者是僅僅取代在C- -2位置上。位置上。卵清蛋白糖肽的一條糖鏈卵清蛋白糖肽的一條糖鏈 - -N-N-乙酰葡糖胺內(nèi)切酶乙酰葡糖胺內(nèi)切酶(4)(4)Endo-C11Endo-C11的底物專一性，在糖基一側(cè)要求的底物專一性，在糖基一側(cè)要求一個分枝的五糖單位，并且兩個處于還原一個分枝的五糖單位，并且兩個處于還原末端的末端的 - -甘露糖殘基都必需、或者不被別甘露糖殘基都必需、或者不被別的糖基取

57、代的糖基取代，或者僅取代在或者僅取代在C-2C-2位置上。位置上。lEndo-C11Endo-C11在糖苷配基一側(cè)的專一性要求，在糖苷配基一側(cè)的專一性要求，和和Endo-HEndo-H一樣，不容許有巖藻糖的取代。一樣，不容許有巖藻糖的取代。(2) (2) - -N-N-乙酰半乳糖苷內(nèi)切酶乙酰半乳糖苷內(nèi)切酶l蛋白的蛋白的O-O-型糖鏈中最常見的一種，是由糖型糖鏈中最常見的一種，是由糖鏈還原末端的鏈還原末端的N-N-乙酰半乳糖胺和糖鏈中的乙酰半乳糖胺和糖鏈中的絲氨酸或蘇氨酸的羥基以絲氨酸或蘇氨酸的羥基以 -0-0-糖苷鍵連接糖苷鍵連接而成。而成。 - -N-N-乙酰半乳糖胺內(nèi)切酶能夠切開乙酰半乳糖

58、胺內(nèi)切酶能夠切開這個連鍵，把這個連鍵，把0-0-型糖鏈和肽鏈完全分開。型糖鏈和肽鏈完全分開。(3) (3) - -半乳糖苷內(nèi)切酶半乳糖苷內(nèi)切酶l糖基一側(cè)必須是一個三糖單位，失去非還糖基一側(cè)必須是一個三糖單位，失去非還原末端的半乳糖原末端的半乳糖- -乙酰半乳糖胺，都不能成乙酰半乳糖胺，都不能成為該酶的底物。為該酶的底物。l糖苷配基一側(cè)必須是糖苷配基一側(cè)必須是N-N-乙酰葡糖胺或葡萄乙酰葡糖胺或葡萄糖。糖。l被酶水解打開的糖苷鍵必須是被酶水解打開的糖苷鍵必須是 -1,4-1,4連接。連接。l這個內(nèi)切酶只能用于帶有血型這個內(nèi)切酶只能用于帶有血型A(A(或或B)B)決定決定簇的糖鏈，能作用于血型物質(zhì)

59、簇的糖鏈，能作用于血型物質(zhì)H H。(4) (4) 其他內(nèi)切糖其他內(nèi)切糖苷酶苷酶l來自灰色鏈霉菌發(fā)酵液的一個氨基半乳糖來自灰色鏈霉菌發(fā)酵液的一個氨基半乳糖苷內(nèi)切酶，可以水解苷內(nèi)切酶，可以水解 - -氨基半乳糖苷鍵。氨基半乳糖苷鍵。用于一種真菌所產(chǎn)生的氨基半乳聚糖的結(jié)用于一種真菌所產(chǎn)生的氨基半乳聚糖的結(jié)構(gòu)研究。構(gòu)研究。l來自一株土壤芽孢桿菌的來自一株土壤芽孢桿菌的 -1,-1,6 6甘露聚糖酶甘露聚糖酶，能水解無側(cè)鏈取代的，能水解無側(cè)鏈取代的 -1,-1,6 6甘露糖糖苷鍵甘露糖糖苷鍵，在研究酵母胞壁外層甘露聚糖結(jié)構(gòu)時，在研究酵母胞壁外層甘露聚糖結(jié)構(gòu)時，將大分子甘露聚糖外側(cè)鏈打斷，獲得靠近將大分子

60、甘露聚糖外側(cè)鏈打斷，獲得靠近天冬酰胺結(jié)合位置的內(nèi)核結(jié)構(gòu)。天冬酰胺結(jié)合位置的內(nèi)核結(jié)構(gòu)。4 4、應(yīng)用中的問題、應(yīng)用中的問題l在應(yīng)用糖苷酶進(jìn)行糖鏈結(jié)構(gòu)研究時，在應(yīng)用糖苷酶進(jìn)行糖鏈結(jié)構(gòu)研究時，所取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)對照其他技術(shù)所取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)對照其他技術(shù)方法提供的信息，小心加以解釋，以方法提供的信息，小心加以解釋，以免引出錯誤的結(jié)論。免引出錯誤的結(jié)論。l影響糖苷酶測定結(jié)果的因素很多，大影響糖苷酶測定結(jié)果的因素很多，大致有以下幾個方面：致有以下幾個方面：(1) (1) 工具酶的選擇工具酶的選擇l任何一助糖苷酶都可用于糖鏈結(jié)構(gòu)研任何一助糖苷酶都可用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的工具酶。究的工具酶。l一般應(yīng)選擇文獻(xiàn)中常