無菌制劑成品密封系統(tǒng)完好性驗證

1、主要內(nèi)容主要內(nèi)容 定義和目的定義和目的 適用范圍適用范圍 試驗方法試驗方法 結(jié)果評價結(jié)果評價 貯存穩(wěn)定性貯存穩(wěn)定性 惡劣條件下的成品密封性驗證惡劣條件下的成品密封性驗證 生產(chǎn)中的在線檢漏生產(chǎn)中的在線檢漏一、概述一、概述 微生物侵入試驗是對最終滅菌容器的密封件系統(tǒng)微生物侵入試驗是對最終滅菌容器的密封件系統(tǒng) 完好性的挑戰(zhàn)性試驗。目的是考察并確認(rèn)容器密完好性的挑戰(zhàn)性試驗。目的是考察并確認(rèn)容器密 封系統(tǒng)的完好性。封系統(tǒng)的完好性。二、適用范圍二、適用范圍 本驗證適用于無菌制劑生產(chǎn)中使用的輸液瓶、西林瓶等需用多組件完成密封的本驗證適用于無菌制劑生產(chǎn)中使用的輸液瓶、西林瓶等需用多組件完成密封的容器完好性測試

2、。容器完好性測試。三、試驗方法三、試驗方法 在驗證試驗中，取輸液瓶或西林瓶，灌入培養(yǎng)基，在正常生產(chǎn)線上壓塞、壓蓋在驗證試驗中，取輸液瓶或西林瓶，灌入培養(yǎng)基，在正常生產(chǎn)線上壓塞、壓蓋滅菌。此后，將容器密封面浸入高濃度運動性菌液中，取出、培養(yǎng)并檢查是否滅菌。此后，將容器密封面浸入高濃度運動性菌液中，取出、培養(yǎng)并檢查是否有微生物侵入。有微生物侵入。（一）試驗樣品的制備（一）試驗樣品的制備1.1.在生產(chǎn)線上取足夠量的容器，灌裝在生產(chǎn)線上取足夠量的容器，灌裝SCDM/2SCDM/2（大豆（大豆 胰蛋白胨肉湯）培養(yǎng)基，使用自動壓塞和壓胰蛋白胨肉湯）培養(yǎng)基，使用自動壓塞和壓蓋設(shè)蓋設(shè) 備將容器密封；備將容器密

3、封；2.2.將灌裝后的容器經(jīng)最長滅菌程序滅菌。將灌裝后的容器經(jīng)最長滅菌程序滅菌。121121、 30 30；3.3.取出、放冷，將每一試樣倒轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)基與瓶口充分接觸，在取出、放冷，將每一試樣倒轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)基與瓶口充分接觸，在30303535下倒下倒置培養(yǎng)置培養(yǎng)1414天天; ;4.4.選選5050個試樣小心去除鋁蓋個試樣小心去除鋁蓋, ,注意不要破壞其密封口。將去鋁蓋時不慎損壞窗口注意不要破壞其密封口。將去鋁蓋時不慎損壞窗口密封性的所有試樣剔除。按上述密封性的所有試樣剔除。按上述3 3中要求培養(yǎng)樣品。在培養(yǎng)期內(nèi)，當(dāng)試驗中發(fā)中要求培養(yǎng)樣品。在培養(yǎng)期內(nèi)，當(dāng)試驗中發(fā)現(xiàn)任何帶蓋試樣長菌時現(xiàn)任何帶蓋試樣

4、長菌時, ,則試驗無效則試驗無效, ,須棄去全部試樣，重新從頭開始試驗。須棄去全部試樣，重新從頭開始試驗。 （二）確認(rèn)培養(yǎng)基促菌生長能力（二）確認(rèn)培養(yǎng)基促菌生長能力營養(yǎng)性試營養(yǎng)性試驗驗 1.接種接種 所有試樣培養(yǎng)所有試樣培養(yǎng)14天均不長菌時，隨機取天均不長菌時，隨機取20個帶個帶蓋試樣每個試樣內(nèi)接種蓋試樣每個試樣內(nèi)接種0.1ml的銅綠假單胞菌的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC 9027,菌液菌液濃度濃度10100CFU/0.1ml。 試驗菌選擇原則：試驗菌選擇原則： （1）所選菌種的體積大小，越小越好。）所選菌種的體積大小，越小越好。 （2）運動能力強。）運

5、動能力強。 （3）適宜的培養(yǎng)基。）適宜的培養(yǎng)基。2.2.培養(yǎng)培養(yǎng) 在在30303535下培養(yǎng)下培養(yǎng)7 7天，或培養(yǎng)至所有試樣天，或培養(yǎng)至所有試樣 都呈陽性結(jié)果。都呈陽性結(jié)果。 3.3.判定判定 若若7 7天內(nèi)，所有接種銅綠假單胞菌的試樣中，天內(nèi)，所有接種銅綠假單胞菌的試樣中，微生物生長良好，則容器內(nèi)培養(yǎng)基的促菌生長微生物生長良好，則容器內(nèi)培養(yǎng)基的促菌生長能力可判為合格。能力可判為合格。 使用革蘭染色和紫外燈下肉湯呈藍(lán)綠色熒光的使用革蘭染色和紫外燈下肉湯呈藍(lán)綠色熒光的性質(zhì)，來鑒定并確認(rèn)試樣容器內(nèi)生長的菌為接性質(zhì)，來鑒定并確認(rèn)試樣容器內(nèi)生長的菌為接入的銅綠假單胞菌。入的銅綠假單胞菌。 （三）挑戰(zhàn)菌

6、懸浮液的制備（三）挑戰(zhàn)菌懸浮液的制備 1.1.從銅綠假單胞菌從銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC 9027的新鮮斜面上取一整環(huán)培養(yǎng)物，分別的新鮮斜面上取一整環(huán)培養(yǎng)物，分別接入接入 含含lOml lOml 無菌培養(yǎng)基的試管中，在無菌培養(yǎng)基的試管中，在30303535下下 培養(yǎng)培養(yǎng)161618h18h。 2.2.將每管的培養(yǎng)物分別轉(zhuǎn)入含將每管的培養(yǎng)物分別轉(zhuǎn)入含1000ml 1000ml 相同培相同培養(yǎng)養(yǎng) 基基(SCDM(SCDM2)2)的容器內(nèi)，于的容器內(nèi)，于30303535下培養(yǎng)下培養(yǎng) 22 2224h24h。在培養(yǎng)結(jié)束時，能明顯見容器內(nèi)。在培養(yǎng)結(jié)束時，能明顯見容

7、器內(nèi)培培 養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁。養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁。 3.3.培養(yǎng)結(jié)束后的菌懸液即可用來作容器密封培養(yǎng)結(jié)束后的菌懸液即可用來作容器密封系系 統(tǒng)完好性試驗。統(tǒng)完好性試驗。（四）微生物侵入試驗操作步驟（四）微生物侵入試驗操作步驟 本試驗須在生物安全柜內(nèi)或其他不影響生產(chǎn)環(huán)本試驗須在生物安全柜內(nèi)或其他不影響生產(chǎn)環(huán)境的地方進行。境的地方進行。1.1.將新鮮的銅綠假單胞菌將新鮮的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 9027 的菌懸液倒入合適的的菌懸液倒入合適的盆中，用金屬絲架固定試樣容器，使試倒置在盆中，用金屬絲架固定試樣容器，使試倒置在菌懸液中。菌懸液中。2.2.將將5050個經(jīng)最長

8、滅菌程序滅菌的試樣倒置，并個經(jīng)最長滅菌程序滅菌的試樣倒置，并浸入菌懸液中。該組試樣為浸入菌懸液中。該組試樣為A A 組。組。 試樣容器內(nèi)的無菌培養(yǎng)基應(yīng)充分接觸封口內(nèi)試樣容器內(nèi)的無菌培養(yǎng)基應(yīng)充分接觸封口內(nèi)表面，樣品的頸部及封口的外表面應(yīng)完全浸泡表面，樣品的頸部及封口的外表面應(yīng)完全浸泡在菌懸液中，見圖在菌懸液中，見圖4 45454。3.3.同時將同時將2525個去鋁蓋的試樣容器倒置入菌懸液個去鋁蓋的試樣容器倒置入菌懸液中，中， 該組試樣為該組試樣為B B組。組。 4.4.實驗開始時取一份菌懸液，平板計數(shù)每毫升實驗開始時取一份菌懸液，平板計數(shù)每毫升所含的活菌數(shù)。按所含的活菌數(shù)。按2.3.1 2.3.

9、1 確認(rèn)試驗用微生物是確認(rèn)試驗用微生物是銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(Pseudomonas aeruginosa)。 5.5.將將A A組和組和B B組試樣容器在菌懸液中持續(xù)浸泡約組試樣容器在菌懸液中持續(xù)浸泡約4h4h。 6.6.浸泡結(jié)束時，再用平板計數(shù)菌懸液的濃度。浸泡結(jié)束時，再用平板計數(shù)菌懸液的濃度。 7.7.從菌懸液中取出試樣，擦干試樣容器外殘余的菌懸液，然后用含從菌懸液中取出試樣，擦干試樣容器外殘余的菌懸液，然后用含0.50.5過乙過乙酸的酸的 7070異丙醇消毒容器外表面。異丙醇消毒容器外表面。 8.8.取裝滿培養(yǎng)基有鋁蓋和去鋁蓋的樣品各

10、兩個，作陽性對照。陽性對照用樣品取裝滿培養(yǎng)基有鋁蓋和去鋁蓋的樣品各兩個，作陽性對照。陽性對照用樣品制備方法同試樣，但不經(jīng)菌懸液浸泡，其外表用含制備方法同試樣，但不經(jīng)菌懸液浸泡，其外表用含0.50.5過乙酸的過乙酸的7070異丙醇異丙醇消毒。此后，接種入消毒。此后，接種入1010I00CFUI00CFU銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌(Pseudomonas (Pseudomonas aeruginosa)ATCC 9027aeruginosa)ATCC 9027，按步驟，按步驟2 2進行培養(yǎng)基的營養(yǎng)試驗。進行培養(yǎng)基的營養(yǎng)試驗。 9.9.將消毒后的容器放在塑料袋中，置將消毒后的容器放在塑料袋中，置303

11、03535培養(yǎng)培養(yǎng)7 7天。操作中應(yīng)特別注意不要損壞天。操作中應(yīng)特別注意不要損壞B B組無鋁蓋試樣膠塞的組無鋁蓋試樣膠塞的密封性。密封性。 10.10.挑戰(zhàn)試驗用菌懸液經(jīng)滅菌后丟棄。挑戰(zhàn)試驗用菌懸液經(jīng)滅菌后丟棄。 11.11.將挑戰(zhàn)試驗用的試樣培養(yǎng)將挑戰(zhàn)試驗用的試樣培養(yǎng)7 7天，觀察檢查試天，觀察檢查試樣容器內(nèi)培養(yǎng)基中微生物的生長情況。樣容器內(nèi)培養(yǎng)基中微生物的生長情況。 （1 1）對每一試樣進行觀察檢查，有生長記作）對每一試樣進行觀察檢查，有生長記作+ +，無生長計作。無生長計作。 （2 2）如果試樣容器長菌，按）如果試樣容器長菌，按2.3.1 2.3.1 方法確認(rèn)方法確認(rèn)生長菌是挑戰(zhàn)微生物生

12、長菌是挑戰(zhàn)微生物銅綠假單胞菌。銅綠假單胞菌。 （3 3）如果所有容器都不長菌，則從浸過菌懸）如果所有容器都不長菌，則從浸過菌懸液的液的A A 組取組取10 10 個試樣，個試樣，B B 組組5 5個試樣，分別按個試樣，分別按2 2進行培養(yǎng)基的營養(yǎng)檢查。進行培養(yǎng)基的營養(yǎng)檢查。四、結(jié)果評價四、結(jié)果評價 （一）（一） 步驟三步驟三. .（二）（二）.2.2、步驟三、步驟三. .（四）（四）.8.8、步驟三、步驟三. .（四）（四）.11.11.（3 3）中進）中進行的營養(yǎng)試驗都合格，試樣的挑戰(zhàn)試驗才有行的營養(yǎng)試驗都合格，試樣的挑戰(zhàn)試驗才有效。效。 （二）（二） 在挑戰(zhàn)試驗開始時，挑戰(zhàn)用菌懸液在挑戰(zhàn)試

13、驗開始時，挑戰(zhàn)用菌懸液濃度濃度( (活菌數(shù)活菌數(shù)) )必須達到必須達到1 1106CFU/ml106CFU/ml。（三）挑戰(zhàn)試驗中（三）挑戰(zhàn)試驗中A A 組和組和B B 組如有長菌，需組如有長菌，需記錄長菌的試樣數(shù)。在記錄長菌的試樣數(shù)。在A A 組中如出現(xiàn)長菌試驗，組中如出現(xiàn)長菌試驗，則需按下述要求作進一步調(diào)查。則需按下述要求作進一步調(diào)查。 1.1.仔細(xì)去除微生物生長的容器的蓋和塞，檢查仔細(xì)去除微生物生長的容器的蓋和塞，檢查容器封口是否有缺損，造成微生物侵入。容器封口是否有缺損，造成微生物侵入。 2.2.將觀察到試樣容器封口的缺陷，采用拍照或?qū)⒂^察到試樣容器封口的缺陷，采用拍照或及其他適當(dāng)詳細(xì)

14、記錄。及其他適當(dāng)詳細(xì)記錄。 3.3.如果任何挑戰(zhàn)試驗中長菌的容器不是由于容如果任何挑戰(zhàn)試驗中長菌的容器不是由于容器封口明顯的物理性缺損所致，容器密封系器封口明顯的物理性缺損所致，容器密封系統(tǒng)挑戰(zhàn)試驗作失敗論處。統(tǒng)挑戰(zhàn)試驗作失敗論處。五、貯存穩(wěn)定性五、貯存穩(wěn)定性 1.1.將剩余未經(jīng)過挑戰(zhàn)試驗的容器放入箱中，保將剩余未經(jīng)過挑戰(zhàn)試驗的容器放入箱中，保存在室溫，黑暗處。存在室溫，黑暗處。 2.2.在適當(dāng)?shù)臅r間間隔在適當(dāng)?shù)臅r間間隔( (如如12 12 個月、個月、24 24 個月、個月、36 36 個月等個月等) )取出一些容器，重復(fù)挑戰(zhàn)試驗。取出一些容器，重復(fù)挑戰(zhàn)試驗。六、惡劣條件下的成品密封性驗六、

15、惡劣條件下的成品密封性驗證證 （一）高溫高濕儲存（一）高溫高濕儲存 將足夠量的試樣倒置放入恒溫恒濕儀，設(shè)定溫度將足夠量的試樣倒置放入恒溫恒濕儀，設(shè)定溫度33333535，相對，相對濕度濕度90%90%95%95%，分別于，分別于7 7天、天、1414天、天、2121天、天、2828天、天、4242天、天、5656天、天、9090天各取天各取2020瓶瓶/ /支，按前述三支，按前述三. .（四）步驟進行微生物侵入試驗。（四）步驟進行微生物侵入試驗。（二）長途運輸（二）長途運輸 為考察長途運輸?shù)姆绞?、途?jīng)環(huán)境和運輸時間為考察長途運輸?shù)姆绞?、途?jīng)環(huán)境和運輸時間對容器密封性的影響，可以考慮將培養(yǎng)基試樣

16、對容器密封性的影響，可以考慮將培養(yǎng)基試樣隨成品一同運輸，返回后，按照三隨成品一同運輸，返回后，按照三. .（一）（一）.3.3和和4 4的方法進行培養(yǎng)。的方法進行培養(yǎng)。 在培養(yǎng)期內(nèi)，當(dāng)試驗中發(fā)現(xiàn)任何試樣長菌時，在培養(yǎng)期內(nèi)，當(dāng)試驗中發(fā)現(xiàn)任何試樣長菌時，可判定長途運輸對密封性產(chǎn)生不良影響，應(yīng)查可判定長途運輸對密封性產(chǎn)生不良影響，應(yīng)查找具體原因，采取措施改進密封系統(tǒng)、包裝方找具體原因，采取措施改進密封系統(tǒng)、包裝方式或運輸方式，對改進后的措施反復(fù)驗證，直式或運輸方式，對改進后的措施反復(fù)驗證，直至證明措施有效，從而保證產(chǎn)品質(zhì)量。至證明措施有效，從而保證產(chǎn)品質(zhì)量。 在培養(yǎng)期內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)試樣長菌，可進行微生物

17、在培養(yǎng)期內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)試樣長菌，可進行微生物侵入試驗，以進一步考察和評價運輸對密封性侵入試驗，以進一步考察和評價運輸對密封性的影響。的影響。（三）加壓、減壓法（三）加壓、減壓法 在進行微生物侵入試驗時，可采用加壓或減壓裝置，通過加壓在進行微生物侵入試驗時，可采用加壓或減壓裝置，通過加壓或減壓操作，增加菌液侵入容器的幾率，在最差條件下進行驗或減壓操作，增加菌液侵入容器的幾率，在最差條件下進行驗證，以證實密封件及其連接方式、索蓋等設(shè)備和操作能夠充分證，以證實密封件及其連接方式、索蓋等設(shè)備和操作能夠充分滿足最差條件下的容器密封要求。滿足最差條件下的容器密封要求。1.1.加壓法加壓法 當(dāng)容器倒置于菌懸液中

18、，對菌懸液適當(dāng)加壓，如容器密封性較當(dāng)容器倒置于菌懸液中，對菌懸液適當(dāng)加壓，如容器密封性較差，按前述步驟操作后，培養(yǎng)結(jié)果應(yīng)為陽性。差，按前述步驟操作后，培養(yǎng)結(jié)果應(yīng)為陽性。2 2減壓法減壓法 容器正立放置于減壓裝置內(nèi)，進行減壓操作，容器正立放置于減壓裝置內(nèi)，進行減壓操作，達到規(guī)定壓力后保持適當(dāng)時間，在負(fù)壓狀態(tài)下達到規(guī)定壓力后保持適當(dāng)時間，在負(fù)壓狀態(tài)下抽入菌懸液，沒過容器后逐漸恢復(fù)常壓。如容抽入菌懸液，沒過容器后逐漸恢復(fù)常壓。如容器密封性較差，按前述步驟操作后，培養(yǎng)結(jié)果器密封性較差，按前述步驟操作后，培養(yǎng)結(jié)果應(yīng)為陽性。應(yīng)為陽性。七、生產(chǎn)中的在線檢漏七、生產(chǎn)中的在線檢漏（一）適用范圍（一）適用范圍 適用于采用滅菌柜進行滅菌操作的安瓿、輸液瓶或袋的無菌制適用于采用滅菌柜進行滅菌操作的安瓿、輸液瓶或袋的無菌制劑。劑。（二）檢漏方法（二）檢漏方法 1.1.色水法色水法 將滅菌柜腔體內(nèi)抽至一定的真空，形成負(fù)壓，將滅菌柜腔體內(nèi)抽至一定的真空，形成負(fù)壓，通入色水，恢復(fù)常壓，藥品出箱后，逐支進行通入色水，恢復(fù)常壓，藥品出箱后，逐支進行人工和機器燈檢，如藥品顏色異常，則為泄露，人工和機器燈檢，如藥品顏色異常，則為泄露，予以剔除。中藥注射劑多為淺黃色至棕紅色，予以剔除。中藥注射劑多為淺黃色至棕紅色，所以不宜選擇暖色的染料調(diào)制色水，多使用藍(lán)所以不宜選擇暖色的染